本发明属于生物靶向功能高分子缓释材料领域，具体地指一种用于治疗肿瘤的纳米粒制剂及其制备方法。
背景技术：
在癌症化疗中面临的一个主要问题是化疗药物缺乏对肿瘤细胞的靶向性，这样药物不但到达肿瘤组织的含量有限，还会对正常的细胞或者组织造成损害。这些问题严重限制了化疗药物在临床上的应用。随着纳米技术的发展，利用纳米载药系统包载化疗药物靶向输送化疗药物至肿瘤部位成了现在提高化疗药物药效，减小毒性的重要手段。为了提高纳米载药系统的靶向性，主动靶向分子例如叶酸，半乳糖胺，rgd肽通常被修饰在纳米粒子的表面。叶酸由于免疫原性低，分子量小，易于修饰，与叶酸受体的结合能力强等优点，被广泛地修饰在纳米粒子的表面。通过与肿瘤表面过度表达的叶酸受体结合，识别和调节的内吞作用，可以降低纳米药物对正常组织的伤害，提高药物的抗肿瘤效果。
目前叶酸共聚物被广泛的应用于组装纳米粒，包载抗肿瘤药物。叶酸共聚物具有良好的主动靶向叶酸受体高表达细胞的优势，通过叶酸共聚物组装的纳米粒具有易于靶向至叶酸受体高表达的肿瘤细胞例如乳腺癌细胞、膀胱癌细胞、宫颈癌细胞等。然而，目前的叶酸共聚物组装过程大多较为繁琐。
专利cn102973512a公开了一种负载阿霉素并具有叶酸靶向功能的白蛋白纳米粒子制剂的制备办法。该发明通过maillard反应，将葡聚糖-叶酸和葡聚糖同时接到白蛋白上，得到白蛋白-葡聚糖-叶酸复合物；然后在酸性条件下混合阿霉素和白蛋白-葡聚糖-叶酸共价复合物的水溶液，调整溶液的ph值以后加热制备得到稳定的具有叶酸受体靶向功能的阿霉素/白蛋白-葡聚糖-叶酸纳米粒子。然而，这种制备方法流程较为繁琐，需要通过两步反应才能得到白蛋白-叶酸复合物，进一步加热后才能得到葡聚糖-叶酸的白蛋白纳米粒。
专利cn103638528公开了一种叶酸-海藻酸钠-植物甾醇的纳米粒，纳米粒将抗肿瘤药物阿霉素包载在其疏水和核内，具备安全性、有效性和靶向性的特点。然而，该发明中需要先合成得到海藻酸钠-植物甾醇共聚物，组装该共聚物得到海藻酸钠-植物甾醇纳米粒，在纳米粒上继续偶联叶酸才能得到叶酸-海藻酸钠-植物甾醇纳米粒。纳米粒经过透析法得到包载阿霉素的叶酸-海藻酸钠-植物甾醇纳米粒。该发明中采用的植物甾醇成本较高，需要通过两步合成得叶酸-海藻酸钠-植物甾醇，流程较为繁琐，需要通过透析得到包载阿霉素的纳米粒，制备工艺较为冗长，增加了生存成本。
技术实现要素：
本发明针对现有技术缺陷，提供了一种用于治疗肿瘤的纳米粒制剂及其制备方法，该纳米粒制剂具有良好的负载效果同时，该制备方法解决了现有的叶酸共聚物制备流程复杂，组装工艺冗长问题。该纳米制剂相对于阿霉素，降低了阿霉素的体内毒性，提高了阿霉素的治疗效果。
为实现上述目的，本发明提供的一种用于治疗肿瘤的纳米粒制剂，所述制剂包括多糖接枝叶酸共聚物纳米粒和带正电的抗肿瘤药物，所述多糖接枝叶酸共聚物纳米粒包载有带正电的抗肿瘤药物，所述带正电的抗肿瘤药物与多糖接枝叶酸共聚物纳米粒重量比为1～5:100。
进一步地，所述多糖接枝叶酸共聚物纳米粒的粒径小于或者等于150nm；所述带正电的抗肿瘤药物为阿霉素。其以多糖接枝叶酸共聚物为载体，通过静电吸附的方式负载阿霉素，通过ph调节的方式得到阿霉素-葡聚糖-叶酸纳米粒子。
本发明还提供了一种用于治疗肿瘤的纳米粒制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)调节多糖接枝叶酸共聚物纳米粒的ph至8～12；在冰浴条件下超声破碎，同时加入脱去盐酸的抗肿瘤药物的二甲亚砜溶液，得到超声后的溶液；抗肿瘤药物的二甲亚砜溶液中阿霉素与多糖接枝叶酸共聚物纳米粒投料质量比为1：5～100；
2)再超声后的溶液在冰浴条件下超声破碎5～15min，随后调节ph至7.2～7.4；得到包载抗肿瘤药物的多糖接枝叶酸共聚物纳米粒；
3)将步骤2)所得的包载抗肿瘤药物的多糖接枝叶酸共聚物纳米粒离心超滤，超滤管截留分子量为3000～100000da，超滤5～10次，得到包载抗肿瘤药物的多糖接枝叶酸共聚物纳米粒，即为纳米粒制剂。
作为优选方案，所述步骤1)中，ph值为9，
所述步骤1)中，多糖接枝叶酸共聚物纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
a.将多糖接枝叶酸共聚物溶解于水中，得到浓度为0.1～100mg/ml的多糖接枝叶酸共聚物的溶液；
b.调节多糖接枝叶酸共聚物的溶液ph值至8～12，优选ph为9，在该状态下搅拌5～30min；然后快速加入盐酸溶液，控制时间0～10s之内将溶液ph调节至7.2～7.4，得到了多糖接枝叶酸共聚物纳米粒，其中，上述溶液中多糖接枝叶酸共聚物纳米粒的粒径小于或者等于150nm。
再进一步地，所述步骤a中，多糖接枝叶酸共聚物，其具有如下的通式：
其中，r为分子量为5000～500000da的多糖。
进一步，r选自葡聚糖、壳寡糖、普鲁兰多糖、羟乙基纤维素和透明质酸。
再进一步地，所述多糖-叶酸共聚物为葡聚糖接枝叶酸共聚物，其具有如下的通式：
其中，n为100～10000；作为优选方案，n为640。
再进一步地，所述叶酸在多糖上的取代度为20％～50％；为保证多糖-叶酸共聚物能够组装成粒径小于或者等于150纳米的纳米粒；进一步优选为42％，该取代度下，纳米粒拥有小于或者等于150纳米的均一的粒径分布。
再进一步地，一种上述多糖接枝叶酸共聚物的制备方法，包括以下步骤：
1)溶解叶酸并活化其羧基：用无水二甲亚砜溶解叶酸，随后加入1-羟基苯并三氮唑和n-n’-二环己基碳二亚胺，进行羧基活化反应，在室温下搅拌2～4h后得到端羧基活化的叶酸溶液；其中，叶酸、1-羟基苯并三氮唑和n-n’-二环己基碳二亚胺的投料摩尔比为1:1～2:1～2；
2)溶解多糖：氦气保护条件下，在温度为50～70℃下将分子量为5000～500000da的多糖充分溶解于无水二甲亚砜中，得到多糖的二甲亚砜溶液：
3)酯化反应：将步骤1)得到的羧基活化的叶酸溶液与步骤2)得到的多糖的二甲亚砜溶液混合，在氮气保护和温度为40～80℃条件下发生酯化反应24～72h，纯化后得到共聚物混合物；其中，羧基活化的叶酸溶液中的叶酸与多糖的二甲亚砜溶液中的多糖质量比为1:1～4；
4)纯化：将上述共聚物混合物使用pbs溶液进行共透析1～5天，除去未反应的1-羟基苯并三氮唑、n-n’-二环己基碳二亚胺、叶酸以及dmso溶剂，透析完毕后将透析袋中的液体转移至塑料培养皿中，先在温度为-20～-25℃条件冷冻3～5h，然后放入温度为-40～-60℃条件下冷冻干燥，将冷冻干燥后得到所述的多糖接枝叶酸共聚物冻干粉；即为多糖接枝叶酸共聚物。
再进一步地，所述步骤1)中，羧基活化反应中，反应温度为40～80℃，反应时间为30～60min。
所述步骤2)中，所述多糖选自葡聚糖、壳寡糖、普鲁兰多糖、羟乙基纤维素和透明质酸；
所述步骤4)中，透析过程中，透析袋分子量为3500da～24000da，冷冻温度为-20℃，冷冻时间为4h；冷冻干燥温度为-50℃。
本发明的有益效果在于：
1)本发明采用ph调节的方式可以高效的得到用于治疗肿瘤的纳米粒制剂，该制剂包括多糖接枝叶酸共聚物纳米粒和带正电的抗肿瘤药物，所述多糖接枝叶酸共聚物纳米粒包载有带正电的抗肿瘤药物，相对于其他的制备方法而言，制备工艺更加简单，流程更短。其中，阿霉素的载药量在5％-15％之间。动态光散射的结果表明纳米粒的水和半径在30～200nm之间并能够长期稳定(图2)；
2)本发明得到用于治疗肿瘤的纳米粒制剂，相对于游离的抗肿瘤药物，可以显著提高抗肿瘤药物在肿瘤部位的续集量；如相对于游离的阿霉素，可以显著提高阿霉素在肿瘤部位的续集量。
3)本发明得到用于治疗肿瘤的纳米粒制剂，其中一种为包载阿霉素的纳多糖接枝叶酸共聚物纳米粒细胞摄取的结果表明(图4)，当叶酸与叶酸受体高表达的细胞共同孵育后加入纳米粒子，与直接在叶酸受体高表达的细胞中加入纳米粒子相比，细胞对纳米粒子的摄取显著减少。小动物成像的结果表明(图5)，提前注射叶酸后，小鼠肿瘤对纳米粒子的摄取显著少于没有提前注射叶酸条件下，小鼠肿瘤对纳米粒子的摄取(图3)。小鼠叶酸除了包载阿霉素和支撑纳米粒子之外，还起到了主动靶向叶酸高受体表达肿瘤细胞的作用。
4)本发明得到用于治疗肿瘤的纳米粒制剂，其中一种为包载阿霉素的纳多糖接枝叶酸共聚物纳米粒细胞，在药物释放方面，具有明显的ph敏感效果。这是由于叶酸在ph降低的条件下，叶酸的羧基会失去电子，从而与阿霉素的静电结合减弱，导致阿霉素的加速释放。纳米粒子在ph7.4条件下释放阿霉素的速率很小，而降低ph值可以显著增加阿霉素的释放速率。由于肿瘤细胞的ph值低于正常细胞，纳米粒子的这个性质有利于其进入肿瘤细胞以后释放阿霉素(图6)。荷瘤小鼠的实验表明，阿霉素-叶酸-葡聚糖的纳米粒子在肿瘤抑制和延长小鼠生命方面具有明显的优势(图7、8)。
附图说明
图1为实施例1制备葡聚糖接枝叶酸共聚物的合成路线图；
图2为实施例1制备的葡聚糖接枝叶酸共聚物的红外光谱图；
图3为实施例1制备的葡聚糖接枝叶酸共聚物的核磁共振谱图；
图4为实施例1制备的用于治疗肿瘤的纳米粒制剂1接枝的dls图(图4a)及透射电镜图(图4b)；
图5为实施例1备的用于治疗肿瘤的纳米粒制剂，即为负载阿霉素的葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒的细胞摄取图；
图6为实施例1制备的用于治疗肿瘤的纳米粒制剂，即为负载阿霉素的葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒的组织分布图；
图7为实施例1制备的用于治疗肿瘤的纳米粒制剂，即为负载阿霉素的葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒的肿瘤生长曲线图及瘤重图；
图8为发明制备的用于治疗肿瘤的纳米粒制剂的生化指标图。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1
用于治疗肿瘤的纳米粒制剂1的制备方法，包括以下步骤：
1)溶解叶酸并活化其羧基：用5ml无水二甲亚砜溶解0.5g叶酸，随后加入1-羟基苯并三氮唑和n-n’-二环己基碳二亚胺，在温度为6℃条件下羧基活化反应30min，在室温下搅拌2-4小时后得到端羧基活化的叶酸溶液；其中，叶酸、1-羟基苯并三氮唑和n-n’-二环己基碳二亚胺的投料摩尔比为1:11；
2)溶解多糖：氦气保护条件下，在50℃下将0.5g分子量为50000da的葡聚糖充分溶解于无水二甲亚砜中，得到葡聚糖的二甲亚砜溶液：
3)酯化反应：将步骤1)得到的羧基活化的叶酸溶液与步骤2)得到的葡聚糖的二甲亚砜溶液混合，在氮气保护和温度为50℃条件下发生酯化反应48h，纯化后得到共聚物混合物；
4)纯化：将上述共聚物混合物使用pbs溶液进行透析，透析袋分子量为3500da，共透析3天，除去未反应的1-羟基苯并三氮唑、n-n’-二环己基碳二亚胺、叶酸以及dmso溶剂，透析完毕后将透析袋中的液体转移至塑料培养皿中，先在温度为-20℃条件冷冻4h，然后放入温度为-50℃条件下冷冻干燥，将冷冻干燥后得到所述的葡聚糖接枝叶酸共聚物冻干粉；即为葡聚糖接枝叶酸共聚物(图1)；其具有如下的通式：
其中，n为640。采用红外光谱(ftir)以及核磁共振谱(1h-nmr)确认本发明制备的葡聚糖接枝叶酸共聚物的化学结构。由图2可知，与葡聚糖的红外光谱相比，葡聚糖接枝叶酸共聚物的红外吸收在1730cm-1出现了一个新的吸收峰，归属于反应生成的酯键的c＝o伸缩振动峰。葡聚糖接枝叶酸共聚物的红外吸收在1697cm-1和1643cm-1出现了新的吸收峰，归属于叶酸上芳香环的伸缩振动。这些新出现的吸收峰证明叶酸成果的接枝到葡聚糖上。
由图3可知，与葡聚糖的核磁谱图相比，葡聚糖-叶酸在6.5-9.0ppm出现了一组新的峰，归属于叶酸上芳香环上质子的峰。葡聚糖-叶酸在1.5-3ppm出现了一组新峰，归属于叶酸中亚甲基上质子的峰。根据核磁共振图确认本实施例1制备的葡聚糖接枝叶酸共聚物的化学结构的正确。核磁共振的结果进一步证实了dex-fa的结果，叶酸在葡聚糖上的取代度为46.4wt％。
5)葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒的制备
a.将葡聚糖接枝叶酸共聚物溶解于水中，得到浓度为1mg/ml的多糖接枝叶酸共聚物的溶液；
b.调节葡聚糖接枝叶酸共聚物的溶液ph值至10，在该状态下搅拌5～30min；然后快速加入盐酸溶液，控制时间0～10s之内将溶液ph调节至7.2，得到了多糖接枝叶酸共聚物纳米粒，其中，上述溶液中多糖接枝叶酸共聚物纳米粒的平均粒径为100nm；
6)包载阿霉素的葡聚糖叶酸共聚物纳米粒的制备
a.调节葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒的ph至10；在冰浴条件下超声破碎，同时加入脱去盐酸的阿霉素的二甲亚砜溶液，控制阿霉素于葡聚糖叶酸共聚物纳米粒的质量比为1:8，得到超声后的溶液；
b.再超声后的溶液在冰浴条件下超声破碎5min，随后调节ph至7.2；得到包载阿霉素的多糖接枝叶酸共聚物纳米粒，粒径为80nm；
c.将步骤b)所得的包载阿霉素的葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒离心超滤，超滤管截留分子量为30000da，超滤10次，得到包载阿霉素的葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒，即为纳米粒制剂1。
取1mg/ml的纳米粒制剂1，超声10min，备用。将铜网放在覆有滤纸的表面皿中，将1mg/ml的纳米粒分散液20μl滴于铜网上，用0.2％磷钨酸染色，室温下自然干燥后，用投射电子显微镜观察其形貌，用激光粒度仪测量胶束粒径和分布，测定温度25℃，平衡时间2min，激光电源：he-ne激光，波长为633nm。
通过紫外分光光度法检测纳米粒制剂1中阿霉素的载药量。将包载阿霉素的葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒溶液放置-20℃冰箱中冷冻4小时，然后放入-50℃的冻干机中冷冻干燥，得到纳米粒制剂1，将冻干粉称重得到质量w1，通过紫外分光光度法测得纳米粒制剂1中阿霉素的质量w2，载药量采用公式wt(％)＝w2/w1×100％计算为7.2％。
如图4中的dls结果可知，纳米粒制剂1的粒径在80nm左右，且分布均匀。tem的结果与dls结果吻合。
实施例2
用于治疗肿瘤的纳米粒制剂2的制备方法，包括以下步骤：
1)溶解叶酸并活化其羧基：用5ml无水二甲亚砜溶解0.5g叶酸，随后加入1-羟基苯并三氮唑和n-n’-二环己基碳二亚胺，在温度为60℃条件下羧基活化反应30min，在室温下搅拌2～4小时后得到端羧基活化的叶酸溶液；其中，叶酸、1-羟基苯并三氮唑和n-n’-二环己基碳二亚胺的投料摩尔比为1:2:2；
2)溶解多糖：氦气保护条件下，在60℃下将分子量为，50000da的葡聚糖充分溶解于无水二甲亚砜中，得到葡聚糖的二甲亚砜溶液：
3)酯化反应：将步骤1)得到的羧基活化的叶酸溶液与步骤2)得到的葡聚糖的二甲亚砜溶液混合，在氮气保护和温度为50℃条件下发生酯化反应48h，纯化后得到共聚物混合物；
4)纯化：将上述共聚物混合物使用pbs溶液进行透析，透析袋分子量为3500da，共透析3天，除去未反应的1-羟基苯并三氮唑、n-n’-二环己基碳二亚胺、叶酸以及dmso溶剂，透析完毕后将透析袋中的液体转移至塑料培养皿中，先在温度为-20℃条件冷冻4h，然后放入温度为-50℃条件下冷冻干燥，将冷冻干燥后得到所述的葡聚糖接枝叶酸共聚物冻干粉；即为葡聚糖接枝叶酸共聚物；5)多糖接枝叶酸共聚物纳米粒的制备
a.将葡聚糖接枝叶酸共聚物溶解于水中，得到浓度为0.1～100mg/ml的多糖接枝叶酸共聚物的溶液；
b.调节葡聚糖接枝叶酸共聚物的溶液ph值至10，在该状态下搅拌5～30min；然后快速加入盐酸溶液，控制时间0～10s之内将溶液ph调节至7.2，得到了多糖接枝叶酸共聚物纳米粒，其中，上述溶液中多糖接枝叶酸共聚物纳米粒的粒径为80nm；
6)包载阿霉素的葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒的制备
a.调节葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒的ph至10；在冰浴条件下超声破碎，同时加入脱去盐酸的阿霉素的二甲亚砜溶液，控制阿霉素于葡聚糖叶酸接枝共聚物的质量比为1:40得到超声后的溶液，粒径为60nm；
b.再超声后的溶液在冰浴条件下超声破碎5～15min，随后调节ph至7.2；得到包载阿霉素的葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒，其粒径为100nm；
c.将步骤b)所得的包载阿霉素的葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒离心超滤，超滤管截留分子量为3000～100000da，超滤5～10次，得到包载阿霉素的葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒，即为纳米粒制剂2。
通过紫外分光光度法检测纳米粒制剂2中阿霉素的载药量。将包载阿霉素的葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒溶液放置-20℃冰箱中冷冻4小时，然后放入-50℃的冻干机中冷冻干燥，得到纳米粒制剂2的冻干粉，将冻干粉称重得到质量w1，通过紫外分光光度法测得纳米粒制剂2中阿霉素的质量w2，载药量采用公式wt(％)＝w2/w1×100％计算为1.8％。
实施例3
用于治疗肿瘤的纳米粒制剂3的制备方法，包括以下步骤：
1)溶解叶酸并活化其羧基：用5ml无水二甲亚砜溶解0.5g叶酸，随后加入1-羟基苯并三氮唑和n-n’-二环己基碳二亚胺，在温度为60℃条件下羧基活化反应30min，在室温下搅拌2-4小时后得到端羧基活化的叶酸溶液；其中，叶酸、1-羟基苯并三氮唑和n-n’-二环己基碳二亚胺的投料摩尔比为1:2:2
2)溶解多糖：氦气保护条件下，在60℃下将0.5g分子量为40kda的透明质酸充分溶解于无水二甲亚砜中，得到透明质酸的二甲亚砜溶液：
3)酯化反应：将步骤1)得到的羧基活化的叶酸溶液与步骤2)得到的透明质酸的二甲亚砜溶液混合，在氮气保护和温度为50℃条件下发生酯化反应48h，纯化后得到共聚物混合物；
4)纯化：将上述共聚物混合物使用pbs溶液进行透析，透析袋分子量为3500da，共透析1-5天，除去未反应的1-羟基苯并三氮唑、n-n’-二环己基碳二亚胺、叶酸以及dmso溶剂，透析完毕后将透析袋中的液体转移至塑料培养皿中，先在温度为-20℃条件冷冻4h，然后放入温度为-50℃条件下冷冻干燥，将冷冻干燥后得到所述的透明质酸接枝叶酸共聚物冻干粉；即为透明质酸接枝叶酸共聚物。
5)透明质酸接枝叶酸共聚物纳米粒的制备
a.将透明质酸接枝叶酸共聚物溶解于水中，得到浓度为0.1～100mg/ml的透明质酸接枝叶酸共聚物的溶液；
b.调节透明质酸接枝叶酸共聚物的溶液ph值至9，在该状态下搅拌5～30min；然后快速加入盐酸溶液，控制时间0～10s之内将溶液ph调节至7.4，得到了透明质酸接枝叶酸共聚物纳米粒，其中，上述溶液中透明质酸接枝叶酸共聚物纳米粒的粒径为100nm；
6)包载阿霉素的透明质酸叶酸共聚物纳米粒的制备
a.调节透明质酸接枝叶酸共聚物纳米粒的ph至9；在冰浴条件下超声破碎，同时加入脱去盐酸的阿霉素的二甲亚砜溶液，阿霉素于葡聚糖叶酸共聚物纳米粒质量比为1:20，得到超声后的溶液；
b.再超声后的溶液在冰浴条件下超声破碎5～15min，随后调节ph至7.2；得到包载阿霉素的透明质酸接枝叶酸共聚物纳米粒，粒径为70nm；
c.将步骤b)所得的包载阿霉素的透明质酸接枝叶酸共聚物纳米粒离心超滤，超滤管截留分子量为30000da，超滤10次，得到包载阿霉素的透明质酸接枝叶酸共聚物纳米粒，即为纳米粒子制剂3。
通过紫外分光光度法检测纳米粒制剂3中阿霉素的载药量。将包载阿霉素的透明质酸接枝叶酸共聚物纳米粒溶液放置-20℃冰箱中冷冻4小时，然后放入-50℃的冻干机中冷冻干燥，得到纳米粒制剂3的冻干粉，将冻干粉称重得到质量w1，通过紫外分光光度法测得纳米粒制剂3中阿霉素的质量w2，载药量采用公式wt(％)＝w2/w1×100％计算为3.4％。
实施例4
用于治疗肿瘤的纳米粒制剂4的制备方法，包括以下步骤：
1)溶解叶酸并活化其羧基：用5ml无水二甲亚砜溶解0.5g叶酸，随后加入1-羟基苯并三氮唑和n-n’-二环己基碳二亚胺，在温度为60℃条件下羧基活化反应30min，在室温下搅拌2-4小时后得到端羧基活化的叶酸溶液；其中，叶酸、1-羟基苯并三氮唑和n-n’-二环己基碳二亚胺的投料摩尔比为1:2:2
2)溶解多糖：氦气保护条件下，在60℃下将0.5g分子量为40kda的壳寡糖充分溶解于无水二甲亚砜中，得到壳寡糖的二甲亚砜溶液：
3)酯化反应：将步骤1)得到的羧基活化的叶酸溶液与步骤2)得到的壳寡糖的二甲亚砜溶液混合，在氮气保护和温度为50℃条件下发生酯化反应48h，纯化后得到共聚物混合物；
4)纯化：将上述共聚物混合物使用pbs溶液进行透析，透析袋分子量为3500da，共透析1-5天，除去未反应的1-羟基苯并三氮唑、n-n’-二环己基碳二亚胺、叶酸以及dmso溶剂，透析完毕后将透析袋中的液体转移至塑料培养皿中，先在温度为-20℃条件冷冻4h，然后放入温度为-50℃条件下冷冻干燥，将冷冻干燥后得到所述的壳寡糖接枝叶酸共聚物冻干粉；即为壳寡糖接枝叶酸共聚物；其具有如下的通式：
其中，r为葡聚糖；
5)壳寡糖接枝叶酸共聚物纳米粒溶液的制备
a.将壳寡糖接枝叶酸共聚物溶解于水中，得到浓度为0.1～100mg/ml的壳寡糖接枝叶酸共聚物的溶液；
b.调节壳寡糖接枝叶酸共聚物溶液ph值至8，在该状态下搅拌5～30min；然后快速加入盐酸溶液，控制时间0～10s之内将溶液ph调节至7.4，得到了壳寡糖接枝叶酸共聚物纳米粒溶液，其中，上述溶液中壳寡糖接枝叶酸共聚物纳米粒的粒径为150nm；
6)包载阿霉素的壳寡糖叶酸共聚物纳米粒溶液的制备
a.调节壳寡糖接枝叶酸共聚物纳米粒溶液的ph至9；在冰浴条件下超声破碎，同时加入脱去盐酸的阿霉素的二甲亚砜溶液，阿霉素于葡聚糖叶酸共聚物纳米粒质量比为1:10，得到超声后的溶液；
b.再超声后的溶液在冰浴条件下超声破碎5～15min，随后调节ph至7.2；得到包载阿霉素的壳寡糖接枝叶酸共聚物纳米粒溶液，其粒径为120nm；
c.将步骤2)所得的包载阿霉素的壳寡糖接枝叶酸共聚物纳米粒溶液离心超滤，超滤管截留分子量为30000da，超滤10次，得到包载阿霉素的壳寡糖接枝叶酸共聚物纳米粒溶液，即为纳米粒制剂4。
通过紫外分光光度法检测纳米粒制剂4中阿霉素的载药量。将包载阿霉素的壳寡糖接枝叶酸共聚物纳米粒溶液放置-20℃冰箱中冷冻4小时，然后放入-50℃的冻干机中冷冻干燥，得到纳米粒制剂4的冻干粉，将冻干粉称重得到质量w1，通过紫外分光光度法测得纳米粒制剂4中阿霉素的质量w2，载药量采用公式wt(％)＝w2/w1×100％计算为6.5％。
实施例5
用于治疗肿瘤的纳米粒制剂6的制备方法，包括以下步骤：
1)溶解叶酸并活化其羧基：用5ml无水二甲亚砜溶解0.5g叶酸，随后加入1-羟基苯并三氮唑和n-n’-二环己基碳二亚胺，在温度为60℃条件下羧基活化反应30min，在室温下搅拌2-4小时后得到端羧基活化的叶酸溶液；其中，叶酸、1-羟基苯并三氮唑和n-n’-二环己基碳二亚胺的投料摩尔比为1:2:2
2)溶解多糖：氦气保护条件下，在60℃下将0.5g分子量为40kda的普鲁兰多糖充分溶解于无水二甲亚砜中，得到普鲁兰多糖的二甲亚砜溶液：
3)酯化反应：将步骤1)得到的羧基活化的叶酸溶液与步骤2)得到的普鲁兰多糖的二甲亚砜溶液混合，在氮气保护和温度为50℃条件下发生酯化反应48h，纯化后得到共聚物混合物；
4)纯化：将上述共聚物混合物使用pbs溶液进行透析，透析袋分子量为3500da，共透析1-5天，除去未反应的1-羟基苯并三氮唑、n-n’-二环己基碳二亚胺、叶酸以及dmso溶剂，透析完毕后将透析袋中的液体转移至塑料培养皿中，先在温度为-20℃条件冷冻4h，然后放入温度为-50℃条件下冷冻干燥，将冷冻干燥后得到所述的普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物冻干粉；即为普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物。
5)普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物纳米粒的制备
a.将普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物溶解于水中，得到浓度为0.1～100mg/ml的普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物的溶液；
b.调节普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物溶液ph值至12，在该状态下搅拌5～30min；然后快速加入盐酸溶液，控制时间0～10s之内将溶液ph调节至7.2～7.4，得到了普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物纳米粒，其中，上述溶液中普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物纳米粒的粒径为80nm；
6)包载阿霉素的普鲁兰多糖叶酸共聚物纳米粒的制备
a.调节普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物纳米粒的ph至9；在冰浴条件下超声破碎，同时加入脱去盐酸的阿霉素的二甲亚砜溶液，阿霉素于葡聚糖叶酸共聚物纳米粒质量比为1:10，得到超声后的溶液；
b.再超声后的溶液在冰浴条件下超声破碎5～15min，随后调节ph至7.2；得到包载阿霉素的普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物纳米粒，其粒径为50nm；
c.将步骤2)所得的包载阿霉素的普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物纳米粒离心超滤，超滤管截留分子量为30000da，超滤10次，得到包载阿霉素的普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物纳米粒，即为纳米粒制剂5。
通过紫外分光光度法检测纳米粒制剂5中阿霉素的载药量。将包载阿霉素的普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物溶液放置-20℃冰箱中冷冻4小时，然后放入-50℃的冻干机中冷冻干燥，得到纳米粒制剂5的冻干粉，将冻干粉称重得到质量w1，通过紫外分光光度法测得纳米粒制剂5中阿霉素的质量w2，载药量采用公式wt(％)＝w2/w1×100％计算为6.1％。
实施例6
建立了4t1小鼠乳腺癌皮下瘤模型，考察了以实施例1得到的纳米粒制剂1即为：包载阿霉素的葡聚糖接枝叶酸共聚物的组织分布行为，具体步骤如下：
实验药物的配置：将超滤后得到的阿霉素的葡聚糖接枝叶酸共聚物溶液稀释至13.9mg/ml的pbs水溶液，相当于1mg/ml的阿霉素：将阿霉素原料药溶解在水中配置成1mg/ml的阿霉素pbs水溶液，将叶酸溶解于pbs配置成3mg/ml叶酸pbs水溶液。
随机将荷4t1乳腺癌皮下瘤的小鼠分为三组，分别为组a，组b，组c，每组3只。组c预先注射叶酸pbs溶液，2小时后，将包载阿霉素的葡聚糖-叶酸水溶液以4mg阿霉素当量/kg的给药量，200μl的剂量分别通过尾静脉注射到a组和b组。尾静脉注射48小时后处死小鼠，取出心、肝、脾、肺、肾、肿瘤，首先组织匀浆萃取组织中的阿霉素，然后通过高效液相色谱检测组织中的药物含量。组织分布实验表明载阿霉素的葡聚糖-叶酸接枝聚合物纳米制剂显著地增加了阿霉素在肿瘤部位的聚集。
从图6可知，尾静脉注射阿霉素的葡聚糖接枝叶酸共聚物的纳米粒在48h后，肿瘤组织中阿霉素的浓度为10.2μg/g组织，而尾静脉注射阿霉素原料药后，肿瘤中阿霉素浓度仅为4.3μg/g组织。这表明，通过尾静脉给药的方式，实施例1制备的纳米粒制剂1可以显著增加阿霉素在肿瘤组织的聚集。预先注射叶酸后，阿霉素在肿瘤部位的浓度为4.6ug/ml，显著降低，证明了纳米粒制剂1具备叶酸受体的主动靶向性。
实施例7
1、建立了4t1乳腺癌皮下瘤模型，考察了实施例1制备的纳米粒制剂1的体内抗肿瘤效率。具体步骤如下：
实验药物的配置：将纳米粒制剂1稀释至13.9mg/ml的pbs水溶液，相当于1mg/ml的阿霉素：将阿霉素原料药溶解在水中配置成1mg/ml的阿霉素pbs水溶液，将叶酸溶解于pbs配置成3mg/ml叶酸pbs水溶液。
随机将荷4t1乳腺癌皮下瘤的小鼠分为五组，分别为a组，b组，c、d、e组，每组6只。c组预先注射叶酸pbs溶液，2小时后，将纳米粒制剂1以4mg阿霉素当量/kg的给药量，200μl的剂量于第0天、3天、6天分别通过尾静脉注射到c组、d组和e组。a组注射200μl的pbs溶液，b组注射12.9mg/ml的dex-fa材料的pbs溶液。每两天测量肿瘤体积大小及小鼠体重，第十四天将各实验组小鼠处死，剥出肿瘤并称重。体内抗肿瘤活性实验表纳米粒制剂1能够取得最好的抗肿瘤效果。
2、建立了4t1小鼠乳腺癌皮下瘤模型，考察了纳米粒制剂1的安全性，具体步骤如下：
实验药物的配置：将纳米粒制剂1稀释至13.9mg/ml的pbs水溶液，相当于1mg/ml的阿霉素：将阿霉素原料药溶解在水中配置成1mg/ml的阿霉素pbs水溶液。
随机将小鼠分为4组，每组4只，分别为a、b、c、d组，a组尾静脉注射200μl的pbs溶液，b组尾静脉注射200μl的64.5mg/ml的葡聚糖接枝叶酸共聚物溶液即为葡聚糖-叶酸(dex-fa)溶液，c组尾静脉注射200μl的69.5mg/ml的纳米粒制剂1即为阿霉素@(葡聚糖-叶酸)dox@dex-fa溶液，d组注1.6mg/ml的阿霉素溶液。在预定的时间点，从小鼠的眼眶静脉丛去学0.5ml，3500rmp离心10min，取上清100μl用于测量肌酸酶(ck).bun(尿素氮)以及乳酸脱氢酶(ldh)。生化指标实验数据表明实施实例1中的包载阿霉素的葡聚糖接枝叶酸共聚物(纳米粒制剂1)显著减少了阿霉素原料药的心脏毒性以及肾毒性。
由图7可知，与pbs组相比，纳米粒制剂1和阿霉素原料组的相对肿瘤体积有所降低。相比阿霉素原料药给药组，第十四天，纳米粒制剂1的抗肿瘤效率为20.2％，显著低于阿霉素原料药组45.1％。实验结束后，从各实验组小鼠剥离的肿瘤瘤重显示，相比于阿霉素原料药给药组，纳米粒制剂1具有更低的瘤重。这表明，通过尾静脉给药方式，实施例1制备的纳米粒子制剂1组队小鼠4t1皮下瘤的抑制作用比阿霉素原料药的抑制作用更好。
由图8可知，纳米粒制剂1与pbs组相比，ck，ldh，bun相差不大，与阿霉素原料药相比，纳米粒制剂1具有更低的ck，ldh，bun值，纳米粒子制剂1能够显著降低阿霉素的心脏和肝脏毒副作用。
因此，本发明制备的纳米粒子制剂的给药组对小鼠4t1皮下瘤的抑制作用与阿霉素原料药抑瘤效果显著降低了原料药的毒副作用。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。