氨基吡啶咪唑酮类衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法

本发明涉及药物化学领域，具体地，涉及一种氨基吡啶咪唑酮类衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
：磷酸鞘氨醇转运蛋白(spinsterhomolog2，spns2)是磷酸鞘氨醇(sphingosine1-phosphate,s1p)转运过程中的关键蛋白。s1p主要由红细胞、血小板和内皮细胞细胞膜上的鞘磷脂在多种酶的催化作用下产生。s1p在细胞内由鞘氨醇(sphingosine，sph)经鞘氨醇激酶(sphingosinekinases，sphk1和sphk2)磷酸化后，被转运蛋白转运到细胞外与靶细胞的1-磷酸鞘氨醇受体(sphingosine1-phosphatereceptors，s1prs)结合，s1p可以通过与不同亚型的s1prs结合，激活或抑制不同的信号通路，对细胞增殖，细胞迁移，血管形成，淋巴细胞趋化等功能发挥着重要的调节作用。研究显示，spns2的缺失也会显著降低结直肠癌、乳腺癌等多种癌细胞系向小鼠肺部的扩散，对b16-f10黑色素瘤细胞向肝脏的扩散也具有抑制作用。进一步的研究结果表明，spns2全部或淋巴内皮特异性方式的缺失会引起循环淋巴细胞减少和肺内效应t细胞和自然杀伤(nk)细胞的比例上升，这可以起到有效的肿瘤细胞杀伤作用并减轻总体的转移负担。因此spns2将有可能成为抗肿瘤药物开发的新型靶点。同时，文献调研结果表明，基于s1p信号通路的药物研发主要集中在磷酸鞘氨醇激酶sphk及1-磷酸鞘氨醇受体s1prs两个靶点上。进入临床研究的sphk1抑制剂主要有safingol及苯妥帝尔；除芬戈莫德外，全球还有14个s1prs调节剂进入临床，适应证包括ms、银屑病、类风湿性关节炎和炎症性肠病等，以s1prs为靶点的抗肿瘤药物开发仍处于临床前研究阶段。此外，s1p阻断抗体也在开发过程中，而靶向磷酸鞘氨醇转运蛋白spns2的抗肿瘤药物目前还没有报道。技术实现要素：针对以上问题，本发明提供了一种氨基吡啶咪唑酮类衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，其中，所述氨基吡啶咪唑酮类衍生物具有如下通式(i)结构：其中，r1为c1-3烷基、芳环、芳基杂环或氢原子；r2为c1-3烷基、烷氧基或氢原子；r3为o-烷基甲肟、o-烷基羟胺、噁二唑环、三氟甲基取代的噁二唑环、c1-5烷基取代的噁二唑环、c1-5烷基取代的咪唑环、c1-5烷基取代的三氮唑环、c1-5烷基取代的噻二唑环、n-羟基甲酰胺、n-烷氧基甲酰胺；以及x为c1-4烷基。在以上应用中，r1为c1-3烷基或氢原子；r2为c1-3烷基或氢原子；r3为o-烷基甲肟、o-烷基羟胺、噁二唑环、三氟甲基取代的噁二唑环、c1-5烷基取代的噁二唑环、c1-5烷基取代的咪唑环、c1-5烷基取代的三氮唑环、c1-5烷基取代的噻二唑环、n-羟基甲酰胺、n-烷氧基甲酰胺；以及x为c1-4烷基。在以上应用中，所述氨基吡啶咪唑酮类衍生物为以下化合物：在以上应用中，所述氨基吡啶咪唑酮类衍生物为：在以上应用中，所述肿瘤包括乳腺癌、结肠癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、肺癌、卵巢癌、白血病、食管癌、宫颈癌、膀胱癌、黑色素瘤、胰腺癌、淋巴癌。在以上应用中，所述氨基吡啶咪唑酮类衍生物的ic50值为1μmol/l～10μmol/l。本发明还提供了一种抗肿瘤药物，包括：氨基吡啶咪唑酮类衍生物或其药学上可接受的盐以及辅料。在以上抗肿瘤药物中，所述氨基吡啶咪唑酮类衍生物的药学上可接受的盐包括有机盐和无机盐。在以上抗肿瘤药物中，所述有机盐包括甲磺酸盐、甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、苯磺酸盐、对甲基苯磺酸盐、萘磺酸盐、乳酸盐和苯甲酸盐，所述无机盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐和磷酸盐。在以上抗肿瘤药物中，所述抗肿瘤药物的剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、气雾剂、口服液体制剂、颗粒剂、散剂、注射剂、糖浆剂、酒剂、酊剂、缓释制剂或它们的组合。本发明通过虚拟筛选发现了一种氨基吡啶咪唑酮类衍生物，该衍生物可以靶向spns2蛋白，具有显著的抗肿瘤作用，可用于制备抗肿瘤的药物。附图说明图1a至图1d分别示出了氨基吡啶咪唑酮类衍生物对plc细胞、mcf-7细胞、mda-mb-231细胞和hct-8细胞凋亡的影响；图2a至图2d分别示出了氨基吡啶咪唑酮类衍生物对plc细胞、mcf-7细胞、mda-mb-231细胞和hct-8细胞侵袭的影响；图3a和图3b分别示出了氨基吡啶咪唑酮类衍生物对plc细胞和mda-mb-231细胞转移的影响。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明提供了一种氨基吡啶咪唑酮类衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，其中，该氨基吡啶咪唑酮类衍生物具有以下通式(i)结构：其中，r1为c1-3烷基、芳环、芳基杂环或氢原子；r2为c1-3烷基、烷氧基或氢原子；r3为o-烷基甲肟、o-烷基羟胺、噁二唑环、三氟甲基取代的噁二唑环、c1-5烷基取代的噁二唑环、c1-5烷基取代的咪唑环、c1-5烷基取代的三氮唑环、c1-5烷基取代的噻二唑环、n-羟基甲酰胺、n-烷氧基甲酰胺；以及x为c1-4烷基。在以上应用中，氨基吡啶咪唑酮类衍生物优选以下化合物：本发明使用的实验材料及其来源包括：plc(肝癌细胞系)细胞、mcf-7(乳腺癌细胞系)细胞、mda-mb-231(乳腺癌细胞系)细胞、hct-8(结肠癌细胞系)细胞均购自凯基生物；rmpi-1640培养基、高糖dmem培养基和胎牛血清(fbs)，均购自invitrogen公司；四甲基偶氮唑盐(mtt)、结晶紫、matrigel基质胶、annexin/pi细胞凋亡检测试剂盒，均购自上海生工生物工程有限公司。细胞培养瓶及96孔板，购赛默飞世尔科技中国有限公司。；5周龄雌性spf级(无特定病原体级)c57bl/6小鼠，购自军事医学科学院的试验动物中心，饲养于spf级双走廊屏障环境中。苏木素、伊红,均购自sigma(西格玛试剂网)。化合物库，来自天津国际生物医药联合研究院高通量药物筛选中心。实施例1通过虚拟筛选评价氨基吡啶咪唑酮类衍生物对spns2蛋白的影响，具体步骤如下：1)pdb数据库(蛋白数据库)下载spns2蛋白结构后，采用chemdraw画出小分子结构，分别导入薛定谔软件。2)优化蛋白与小分子结构，选取蛋白活性中心，对接，得到虚拟筛选评分。氨基吡啶咪唑酮类衍生物的虚拟筛选结果如下表1所示：表1氨基吡啶咪唑酮类衍生物的虚拟筛选结果化合物编号对接评分13,7824.133.6544.554.963.175.585.195.43105.87114.46124.7133.91144.54156.06从上表1可以看出，氨基吡啶咪唑酮类衍生物中的化合物1至15靶向spns2的评分较高，均在3.1分以上，结合能力较强，并且化合物15的评分最高，为6.06，因此，效果最好。实施例2测试氨基吡啶咪唑酮类衍生物对plc细胞、mcf-7细胞、mda-mb-231细胞、hct-8细胞增殖活性的影响，具体步骤如下：1)用胰蛋白酶将贴壁的肿瘤细胞消化成单个细胞，以每孔5000个细胞的方式接种于96孔板中，每孔100μl完全培养基，将细胞在温度37℃、二氧化碳浓度5％的细胞培养箱中过夜培养。待细胞贴壁后，吸出原来的培养基，分别加入100μl3.125μmol/l、6.25μmol/l、12.5μmol/l、25μmol/l、50μmol/l、100μmol/l的氨基吡啶咪唑酮类衍生物的细胞培养液作为实验组，并分别针对每种细胞的实验组设置阴性对照孔(培养基中含有mtt、二甲基亚砜和所测定的细胞)和调零孔(培养基中含有mtt、二甲基亚砜)，每组设置5个平行孔，置于温度37℃、二氧化碳浓度5％的细胞培养箱中培养24h。2)培养24小时后吸出原有培养基，每孔加入100μl1mg/mlmtt于培养箱中继续培养4h，随后吸出mtt，每孔加入150μl的dmso(二甲基亚砜)，充分溶解后，用酶标仪(mr-96a)测定570nm处的吸光度。3)细胞存活率(％)＝(实验组od(吸光度)值-调零组od值)/(阴性对照组od值-调零组od值)*100％。用graphpadprism5计算ic50值，计算结果如下表2所示：表2氨基吡啶咪唑酮类衍生物对plc细胞、mcf-7细胞、mda-mb-231细胞、hct-8细胞增殖活性的影响化合物编号ic50μmol/l(plc)ic50μmol/l(mcf-7)ic50μmol/l(mda-mb-231)ic50μmol/l(hct-8)15.34.328.247.7526.716.436.747.9837.235.787.655.4347.563.214.546.8958.676.097.439.6568.17.128.237.4379.57.457.657.5686.136.346.238.1395.788.985.0611.2108.1236.778.459.21116.125.256.748.55128.128.455.437.12136.875.7610.235.43147.654.357.566.55151.341.021.561.12由上表2可知，在给药24h后，在不同浓度的氨基吡啶咪唑酮类衍生物刺激下，氨基吡啶咪唑酮类衍生物中的化合物1至15对四种细胞系的ic50值均在10μmol/l以下，具有良好的抑制肿瘤细胞增殖的效果，其中，化合物15对四种细胞系的ic50值均在1μmol/l左右，远小于其它化合物的ic50值，效果最好。实施例3测试氨基吡啶咪唑酮类衍生物对plc细胞、mcf-7细胞、mda-mb-231细胞、hct-8细胞凋亡的影响，具体步骤如下：1)细胞收集：将悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，每样本细胞数为5×106/ml，1000r/min离心5min，弃去培养液。2)用磷酸盐缓冲液洗涤1次，500～1000r/min离心5min。3)用100μl的fitc-annexinv和pi(均购自上海生工生物工程有限公司)混合的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育15min。4)1000r/min离心5min沉淀细胞，并用磷酸盐缓冲液洗1次。5)加入荧光(sa-floμs)溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。6)流式细胞仪分析：在流式细胞仪激发光波长为488nm的情况下，用波长为515nm的通带滤器检测fitc(异硫氰酸荧光素)荧光，用另一波长大于560nm的滤器检测pi(细胞核荧光染料)。7)结果判断：在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(fitc-/pi-)；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(fitc+/pi+)；而右下象限为凋亡细胞，为(fitc+/pi-)。实验结果如下图1a至图1d所示，图1a至图1d示出了在氨基吡啶咪唑酮类衍生物刺激下，给药10μmol/l，24h后的四种细胞系的凋亡率，其中，横坐标为化合物名称，纵坐标为总凋亡百分比，与对照组相比，化合物1至15均具有良好的促进肿瘤细胞凋亡的效用，并且化合物15效果最明显，凋亡率分别高达83.2％(plc)、79.2％(mcf-7)、81.2％(mda-mb-231)合86.5％(hct-8)。实施例4测试氨基吡啶咪唑酮类衍生物对plc细胞、mcf-7细胞、mda-mb-231细胞、hct-8细胞迁移的影响，具体步骤如下：1)将枪头置于75％的乙醇里浸泡，待用2h前取出，在生物安全柜中晾干待用。2)用胰蛋白酶将贴壁的细胞消化成单个细胞，在24孔板中，每孔接种1.0*106/ml的细胞悬液500μl，将inserts插入孔板中，朝同一方向排列，使其与24孔板底面紧密接触；将此24孔板置于细胞培养箱中培养24小时，使细胞充分贴壁。3)24小时后用磷酸缓冲盐溶液清洗孔内细胞碎片和未贴壁细胞，于显微镜下观察并拍照；每组设置三个重复，给药(氨基吡啶咪唑酮类衍生物)后于细胞培养箱培养，分别在给药后24小时和48小时后拍照，观察划痕的愈合程度。实验结果如表3所示，表3氨基吡啶咪唑酮类衍生物(10μmol/l)给药作用24h后四种细胞系的相对迁移距离(相对oh)化合物编号plc(相对0h)mcf-7(相对0h)mda-mb-231(相对0h)hct-8(相对0h)对照0.31±0.0230.29±0.0290.3±0.0230.38±0.03310.694±0.0320.694±0.0410.694±0.0180.594±0.02820.607±0.0220.702±0.0710.602±0.0450.702±0.04230.55±0.03450.55±0.0510.65±0.0410.65±0.05140.6010±0.0420.51±0.0430.61±0.040.51±0.0550.610±0.0390.62±0.0530.62±0.0510.52±0.05160.690±0.0230.58±0.0510.68±0.0420.54±0.0470.640±0.0290.64±0.0610.54±0.0310.56±0.02180.580±0.0410.67±0.0630.56±0.0410.61±0.03190.500±0.0280.45±0.0410.55±0.0210.65±0.031100.600±0.0230.6±0.0510.5±0.0310.56±0.0380110.590±0.0270.61±0.060.51±0.0320.61±0.042120.700±0.0210.59±0.050.69±0.0340.54±0.024130.650±0.0230.6±0.0410.62±0.0410.52±0.021140.520±0.0370.53±0.0310.63±0.0230.53±0.033150.83±0.0450.89±0.0410.75±0.0290.87±0.043由上表3可以看出，化合物1至15均具有良好的抑制肿瘤细胞迁移的效用，并且化合物15抑制效果最明显。实施例5测试氨基吡啶咪唑酮类衍生物对plc细胞、mcf-7细胞、mda-mb-231细胞、hct-8细胞侵袭的影响，具体步骤如下：1)在4℃的温度下预冷枪头、培养板和transwell小室(购自威斯腾生物医药科技有限责任公司)，将分装的matrigel置于4℃冰箱中至融化，在冰上稀释matrigel，与相应空培以1∶1的比例混合，将小室放入24孔板中，然后以每孔50μlmatrigel铺于小室中。铺好胶后置于37℃中20min左右，待其凝固；配置含0.1％fbs(胎牛血清)的培养基，每孔50μl于胶上，然后置于37℃培养箱中30min。2)用胰蛋白酶将贴壁的细胞消化成单个细胞，磷酸缓冲盐溶液重悬，再次离心去上清，用含0.1％fbs的培养基重悬细胞，计数，将细胞稀释成2×105个/ml密度的溶液，以每个小室200μl的密度铺于matrigel上，将细胞置于37℃细胞培养箱中过夜培养。3)培养24小时后用棉签将小室内部的细胞和matrigel擦掉，然后将小室置于-20℃预冷的甲醇中固定10min，用磷酸缓冲盐溶液清洗3次，然后将小室置于结晶紫染色液中染色10min，用磷酸缓冲盐溶液洗掉多余的染色液，然后置于显微镜下拍照记录结果。实验结果如下图2a至图2d所示，图2a至图2d示出了在氨基吡啶咪唑酮类衍生物(10μmol/l)给药作用24h后四种细胞系的相对侵袭百分比，其中，横坐标为化合物名称，纵坐标为相对侵袭率，对照组设为100％，可以看出，化合物1至15相对于对照组均具有良好的抑制肿瘤细胞侵袭的效用，并且化合物15抑制侵袭效果较明显。实施例6测试氨基吡啶咪唑酮类衍生物对plc细胞、mda-mb-231细胞转移的影响，具体步骤如下：1)培养足够数量的plc细胞和mda-mb-231细胞，配制成1*107个细胞/ml的生理盐水细胞悬液。2)用75％的酒精棉球给小鼠消毒后，于鼠蹊部皮下注射0.1ml体积的细胞悬液，其中两种细胞系各接种80只，每天观察记录小鼠的生存情况及肿瘤生长情况，待肿瘤体积长到100mm3大小时将接种两种肿瘤的小鼠分别随机分为16组，每组5只老鼠，其中，分为空白对照组(给予生理盐水)、1-15号氨基吡啶咪唑酮类衍生物组，给药一周之后解剖小鼠，固定肿瘤组织和肺脏。3)将解剖得到的肿瘤组织和肺脏固定于福尔马林溶液中，组织固定好后，放入脱水机中脱水，程序如下：50％乙醇45min，70％乙醇45min，80％乙醇1h，90％乙醇1h，95％乙醇1h，100％乙醇a50min，100％乙醇b45min，50％二甲苯30min，二甲苯a25min，二甲苯b25min，二甲苯c20min，石蜡a1h，石蜡b1h,石蜡c1h。4)将脱水完毕的组织放于包埋机包埋，等待石蜡凝固。5)石蜡病理组织切片：取上述病理组织，使用切片机leicarm2245(半自动轮转式切片机)制备厚度4μm薄片，55℃温水浴展片，置于载玻片上，烘干待用。6)上行系统：组织切片于二甲苯中脱蜡，梯度乙醇(质量分数为95％、80％的无水乙醇)脱水蒸馏水冲洗2min.7)苏木素染色5min，之后，用自来水冲洗。8)盐酸乙醇分化30s。9)自来水浸泡15min。10)下行系统及封片：蒸馏水清洗后，依次梯度浓度(质量分数为80％、95％的无水乙醇)酒精处理，后经二甲苯处理脱水；封片机封片，置于通风柜中晒干。11)显镜下统计肺转移灶数量。实验结果如下图3a和图3b所示，图3a至图3b示出了氨基吡啶咪唑酮类衍生物(50mg/kg)给药乳腺癌，肺癌小鼠一周后的细胞转移的数目，其中，横坐标为化合物名称，纵坐标为转移灶数目，将实验组的细胞转移数目与对照组的细胞转移数目相比可以看出，化合物1至15均具有良好的抑制肿瘤肺转移的效用，并且化合物15相对于其他1-14号衍生物效果更佳明显。以上仅为本发明的具体实施方式，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12