一种蟾皮有效部位及其制备方法与流程

本发明属于中药加工
技术领域：
，特别是涉及一种蟾皮有效部位以及一种蟾皮有效部位的制备方法。
背景技术：
蟾皮是是蟾蜍科(bufonidae)动物中华大蟾蜍或黑框蟾蜍的干燥皮，又称蛤蚆皮、癞蟆皮，于夏、秋季捕捉后剥下整皮，晒干而得。本品最早记载于《本经逢原》，自古至今沿用，其性味辛、凉、微毒，主入胃经，具有清热解毒，利水消胀的功效，主治痈疽、肿毒、瘰疬、肿瘤、疳积腹胀、慢性气管炎等症。《本草纲目》记载“蟾蜍其皮，主治恶疮、破症结、肿毒、肠头挺出和一切恶肿等”。蟾皮的化学成分复杂，主要有蟾蜍甾二烯类化合物，吲哚碱类，甾醇类。其中蟾蜍二烯内酯类化合物是蟾皮中的主要有效成分，具有显著的洋地黄样作用、升压作用、呼吸兴奋作用及治疗原发性肝癌、肺癌、肠癌等。现代医学研究表明，蟾皮中的蟾蜍二烯内酯类化合物具有明显的抗肿瘤作用，对结肠癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、白血病和宫颈癌等恶性肿瘤均有作用。近年来，用于多种癌症的治疗和配合放、化疗，不仅能够有效抑制癌细胞的过度增殖，还具有改善血象，减轻放、化疗毒副作用的功效，且不良反应小，使用安全、可靠，对骨髓无抑制作用等优点。临床上常用于治疗各种肿瘤、疖痈、腮腺炎、带状疱疹、乙型肝炎、骨髓炎和体表感染等疾病，临床应用广泛。蟾蜍二烯内酯类化合物(bufadienolides，bfd)是一类在c-17位连接有-吡喃酮环(-pyrone)的c-24甾体或其苷，为蟾皮发挥抗肿瘤活性的主要成分。蟾皮中所含bfd主要包括蟾毒灵(bufalin)、酯蟾毒配基(resibufogenin)、华蟾酥毒基(cinobufagin)等。自1933年stoll等分离得到第一个具有蟾蜍二烯内酯结构的scillarena，到发现蟾毒灵具有良好的抗癌活性(ic5035达10-9-10-10m)，bfd的抗癌作用逐渐被科学家们所认识。国内外多项研究表明bfd对包括肝癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、直肠癌、胃癌、鼻咽癌、口腔癌、表皮癌、胶质瘤、发性骨髓瘤及白血病在内的十余种恶性肿瘤具有活性。远华蟾毒精、蟾毒灵、华蟾酥毒基以及酯蟾毒配基等化合物，能够作用于人子宫癌细胞(hhua,hec-1)、人前列腺癌细胞(lncap，du145，pc3)、人白血病细胞(k562，u397，ml1，hl-60)、人类结肠癌细胞(colon26-l5)、人卵巢癌细胞(sk-ov-3，omc-3)、人肝癌细胞(smmc-7721，bel-7402)并显著抑制癌细胞的生长和增殖。蟾毒灵能够使人类骨髓性白血病细胞株(k562，u397，ml1，hl-60)有效地诱导分化成巨噬细胞，并能能过通过下调细胞周期相关蛋白的表达，诱导人肝癌细胞hepg2细胞阻滞于g2/m期；同时有研究表明人白血病多药耐药k562/vcr细胞株对蟾毒灵无交叉耐药性。酯蟾毒配基对裸鼠的hela宫颈癌移植瘤有明显的抑瘤作用。此外华蟾酥毒基还能保护和提高机体的免疫功能。中药有效部位是指从中药中提取的一类或几类化学成分的混合体,其含量达到总提取物的50％以上,而且这一类或几类已知化学成分要被认为是有效成分。中药有效部位新药由于既能体现中药多成分、多靶点、多途径发挥药效的特点,又能使药物有效成分更加富集,药理作用和临床疗效增强,以及利于质量控制水平提高等优势,近年来成为中药、天然药新药开发的重要方向之一。目前国内外学者对蟾皮二烯内酯类化合物的研究多集中在单体/多组分化合物的药理药效研究，以及新的单体化合物的发现，制备工艺以提取分离工艺的研究较多，工艺繁琐，工业化大生产上存在一定难度；有效成分纯度较低，不适合制备有效部位。中国发明专利(cn101209264b)公开了一种具有抗肿瘤作用的总蟾毒内酯提取物，其中作为主成分的酯蟾毒配基、华蟾酥毒基和蟾毒灵含量和最高只能达到37.1％；中国发明专利(专利号：cn101176739b)公开了一种蟾毒配基提取物，其中作为主成分的华蟾毒精和酯蟾毒配基含量和最高只能达到43.8％，远低于中药有效部位要求。且上述公开及其类似的技术中，蟾蜍二烯内酯类化合物的总量测定采用紫外分光光度法，原法收载于《中国药典》1995年版一部蟾酥项下，因单一对照存在较大的误差及紫外分光光度法局限性，《中国药典》自2000版起改用高效液相色谱法(hplc)法测定，具有良好的专属性与准确性，紫外测定含量仅具有参考作用，有效部位中的一种或多种成分应能准确定量测定。生产上这些显而易见的缺陷，使得本领域的技术人员迫切希望利用物料本身特性，开发一种经改进的有效部位制备方法，使得蟾蜍二烯内酯类成分含量大幅度提高，质量可控，易于规模化生产，丰富蟾皮类中药利用内涵。技术实现要素：基于
背景技术：
存在的技术问题，本发明提出了一种蟾皮有效部位及其制备方法，蟾皮有效部位中蟾蜍二烯内酯类天然活性成分含量高，制备方法科学可行，有利于质量控制，易于规模化生产，具有良好的药物开发前景。为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：本发明一方面提供一种蟾皮有效部位，所述有效部位中以重量百分比计蟾蜍二烯内酯类化合物的含量之和大于50％。本发明另一方面提供一种蟾皮有效部位的制备方法，包括如下步骤：步骤1、粉碎、提取：蟾皮药材经粉碎后，以乙醇回流提取，减压回收溶剂并浓缩得到浸膏；步骤2、石油醚脱脂：将步骤1得到的浸膏分散于纯水中制成母液，根据相比为1:1采用石油醚萃取得到去除油脂杂质的水相；步骤3、有效部位萃取：将步骤2得到的水相根据相比为1:1用饱和有机溶剂萃取，有机相经减压浓缩得到稠膏；步骤4、分离和纯化：将步骤3得到的稠膏通过硅胶柱色谱分离，用己烷-丙酮溶剂体系梯度洗脱，洗脱液分段减压浓缩干燥后得到蟾皮有效部位。进一步地，所述步骤1中的乙醇浓度为60％-90％。进一步地，所述步骤2中母液中浸膏的浓度含量为0.3g-2g生药/ml。进一步地，所述步骤3中的有机溶剂为乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯中的一种。进一步地，所述步骤4中的己烷为正己烷、环己烷中的一种。进一步地，所述步骤4中的己烷-丙酮梯度洗脱体系的比例为1:1-20:1，所述梯度洗脱体积顺序为1-5bv,3-10bv，2-8bv。进一步地，所述步骤4中的己烷-丙酮洗脱梯度体系的比例顺序依次为10:1、5:1、3:1，优选相应洗脱体积分别为3bv、5bv、3bv。进一步地，上述制备得到的蟾皮有效部位主要成分包括蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基，所述三种成分的重量之和在该有效部位中的含量大于50％，其结构式如下：蟾毒灵华蟾酥毒基酯蟾毒配基进一步地，上述制备得到的蟾皮有效部位还包括成分：蟾蜍二烯内酯类化合物是远华蟾毒精、蟾毒它灵、去乙酰华蟾毒它灵、嚏根草苷元、沙蟾毒精、日蟾毒它灵、11-羟基脂蟾毒配基、华蟾毒它灵。本发明通过乙醇回流提取，石油醚脱脂，结合二氯甲烷萃取分离，除去易引起不良反应的生物碱类成分及其他与药效无关成分，再经硅胶柱色谱纯化，获得高纯度蟾皮有效部位，并以酯蟾毒配基(resibufogenin)、华蟾酥毒基(cinobufagin)、蟾毒灵(bufalin)为对照品，采用高效液相色谱法测定蟾皮有效部位的含量，结果显示，蟾皮有效部位中上述三种蟾蜍二烯内酯类化合物的含量达到50％以上，符合中药有效部位要求，为研制中药创新药提供物质基础。本发明具有以下有益效果：1、本发明制备方法设计合理，操作简单，具有良好的稳定性和重现性。避免了大孔树脂易毒化、再生工时长，聚酰胺/氧化铝柱死吸附等繁琐工序；2、本发明方法条件温和，产品质量稳定，所用有机溶剂均可回收再利用，成本低，可实现线性放大，适合工业化生产；3、所得本发明制备所得有效部位质量可控，以酯蟾毒配基、蟾毒灵、华蟾酥毒基作为代表的蟾蜍二烯内酯类主要成分大于50％；4、本发明制备的蟾皮有效部位可用于中药创新药研究开发，有广阔的应用前景。当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为实施例1中蟾皮有效部位的制备工艺流程图；图2为实施例1中蟾皮有效部位的hplc含量测定混合对照品色谱图；图3为实施例1中蟾皮有效部位的hplc含量测定样品色谱图。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。本发明实施例1-3中3种蟾蜍二烯内酯类化合物的含量测定采用高效液相色谱法，具体方法如下：色谱仪：dionexultimate3000；色谱柱：glwondasilc18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；色谱条件：以乙腈-0.5％磷酸二氢钾溶液(50:50)(用磷酸调节ph值为3.2)为流动相；检测波长为296nm；柱温40℃；流速1.0ml/min；进样量20μl。理论板数按蟾毒灵峰、华蟾酥毒基峰、酯蟾毒配基峰计算应分别不低于4000。实施例1蟾皮有效部位制备方法：粉碎、提取：取蟾皮药材1000g经粉碎后，加10倍量80％乙醇回流提取2次，每次1.5小时，减压回收乙醇并浓缩得到浸膏(相对密度1.25,60℃测定)；石油醚脱脂：取上述浸膏分散于纯水中制成浓度为0.5g生药/ml的母液，根据相比为1:1采用石油醚萃取三次，得到去除油脂杂质的水相；有效部位萃取：取上述水相根据相比为1:1用饱和二氯甲烷萃取，萃取三次，有机相经减压浓缩得到稠膏(相对密度1.20,60℃测定)；分离和纯化：取上述稠膏通过硅胶柱色谱分离，用己烷-丙酮溶剂体系梯度洗脱，洗脱梯度为10:1、5:1、3:1，相应的洗脱体积为3bv、5bv、3bv，洗脱液分段减压浓缩干燥后得到蟾皮有效部位1.12g。产物利用高效液相色谱仪进行含量测定，外标法以峰面积计算含量，结果酯蟾毒配基(resibufogenin)含量为15.42％，蟾毒灵(bufalin)含量为25.51％，华蟾酥毒基(cinobufagin)含量为14.24％，三种成分含量和为55.17％。实施例2蟾皮有效部位制备方法：粉碎、提取：取蟾皮药材1000g经粉碎后，加10倍量80％乙醇回流提取2次，每次1.5小时，减压回收乙醇并浓缩得到浸膏(相对密度1.25,60℃测定)；石油醚脱脂：取上述浸膏分散于纯水中制成浓度为1g生药/ml的母液，根据相比为1:1采用石油醚萃取三次，得到去除油脂杂质的水相；有效部位萃取：取上述水相根据相比为1:1用饱和二氯甲烷萃取，萃取三次，有机相经减压浓缩得到稠膏(相对密度1.20,60℃测定)；分离和纯化：取上述稠膏通过硅胶柱色谱分离，用己烷-丙酮溶剂体系梯度洗脱，洗脱梯度为10:1、5:1、3:1，相应的洗脱体积为3bv、5bv、3bv，洗脱液分段减压浓缩干燥后得到蟾皮有效部位1.05g。产物利用高效液相色谱仪进行含量测定，外标法以峰面积计算含量，结果酯蟾毒配基(resibufogenin)含量为19.27％，蟾毒灵(bufalin)含量为24.38％，华蟾酥毒基(cinobufagin)含量为13.09％，三种成分含量和为56.74％。实施例3蟾皮有效部位制备方法：粉碎、提取：取蟾皮药材1000g经粉碎后，加10倍量80％乙醇回流提取2次，每次1.5小时，减压回收乙醇并浓缩得到浸膏(相对密度1.25,60℃测定)；石油醚脱脂：取上述浸膏分散于纯水中制成浓度为1g生药/ml的母液，根据相比为1:1采用石油醚萃取三次，得到去除油脂杂质的水相；有效部位萃取：取上述水相根据相比为1:1用饱和乙酸乙酯萃取，萃取三次，有机相经减压浓缩得到稠膏(相对密度1.20,60℃测定)；分离和纯化：取上述稠膏通过硅胶柱色谱分离，用己烷-丙酮溶剂体系梯度洗脱，洗脱梯度为10:1、5:1、3:1，相应的洗脱体积为3bv、5bv、3bv，洗脱液分段减压浓缩干燥后得到蟾皮有效部位1.18g。产物利用高效液相色谱仪进行含量测定，外标法以峰面积计算含量，结果酯蟾毒配基(resibufogenin)含量为14.17％，蟾毒灵(bufalin)含量为24.33％，华蟾酥毒基(cinobufagin)含量为11.64％，三种成分含量和为50.14％。实施例4为了更直观表示本发明所带来的效果，取实施例1中所得浸膏，对脱脂及有机溶媒萃取效果进行考察，筛选适宜的萃取剂；方法如下：取所得浸膏，分散于纯水中制成浓度为1g生药/ml的母液，分成等体积的a、b两组，其中a组根据相比1:1采用石油醚萃取三次，得到去除油脂杂质的水相，b组不做任何处理。将所得a组水相与b组同法根据相比1:1用饱和有机溶媒萃取，萃取三次，有机相经减压浓缩得到稠膏(相对密度1.20,60℃测定)，产物利用高效液相色谱仪进行含量测定，外标法以峰面积计算酯蟾毒配基(resibufogenin)、蟾毒灵(bufalin)、华蟾酥毒基(cinobufagin)三种主成分含量。结果见表1。表1脱脂及不同有机溶媒萃取考察名称主成分含量(％)母液1.20a组-乙酸乙酯萃取2.62a组-丁酮萃取1.99a组-正丁醇萃取2.01b组-乙酸乙酯萃取1.68b组-丁酮萃取1.40b组-正丁醇萃取1.28结果表明，经石油醚脱脂情况下，所得产物纯度得到大幅度提高，其中以弱极性的乙酸乙酯萃取效果较好。而不经石油醚脱脂得到的产物杂质较多，且萃取过程中容易发生乳化现象，给分离带来一定的困难。实施例5为了进一步改善萃取过程中的萃取效果并提高萃取物纯度，优化不同极性的有机溶剂，选择介电常数较低的二氯甲烷、乙醚、氯仿拓展筛选范围，即极性较乙酸乙酯弱，根据相似相溶原理，能更好地萃取出弱极性的蟾蜍二烯内酯类化合物。方法如下：取实施例1所得浸膏，分散于纯水中制成浓度为1g生药/ml的母液，根据相比1:1采用石油醚萃取三次，得到去除油脂杂质的水相，水相根据相比1:1用饱和有机溶媒萃取，萃取三次，有机相经减压浓缩得到稠膏(相对密度1.20,60℃测定)，产物利用高效液相色谱仪进行含量测定，外标法以峰面积计算酯蟾毒配基(resibufogenin)、蟾毒灵(bufalin)、华蟾酥毒基(cinobufagin)三种主成分含量。结果见表2。表2不同有机溶媒萃取考察名称主成分含量(％)母液1.20母液-乙醚萃取8.82母液-二氯甲烷萃取8.14母液-乙酸乙酯萃取6.58母液-氯仿萃取4.18结果表明，有机溶媒的极性越弱，萃取出的产物中蟾蜍二烯内酯类化合物越多，相应的主成分含量越高，其中以乙醚、二氯甲烷效果较好。但乙醚、氯仿具有低毒性，闪点低，对人体有潜在的安全危险，不适合工业化大生产。故优选二氯甲烷作为有机萃取溶媒。实施例6母液的浓度考察方法：取实施例1所得浸膏，分散于纯水中分别制成浓度为0.5g生药/ml、1.0g生药/ml、1.5g生药/ml、2.0g生药/ml的母液，根据相比1:1采用石油醚同法萃取三次，得到去除油脂杂质的四组水相，水相再根据相比1:1用饱和二氯甲烷萃取，萃取三次，有机相经减压浓缩得到四组稠膏(相对密度1.20,60℃测定)，产物利用高效液相色谱仪进行含量测定，外标法以峰面积计算酯蟾毒配基(resibufogenin)、蟾毒灵(bufalin)、华蟾酥毒基(cinobufagin)三种主成分含量。结果见表3。表3母液浓度考察母液浓度乳化程度萃取物主成分含量(％)0.5g生药/ml无，静置后分层3.601.0g生药/ml轻微乳化，静置30min分层6.281.5g生药/ml中度乳化，分层时间长(5h)7.552.0g生药/ml高度乳化，无法分层-结果表明，母液浓度在一定范围内，萃取能够顺利进行，优选浓度为1.5g生药/ml。不同实施例所得蟾皮有效部位比较，结果见表4。表4不同实施例所得蟾皮有效部位比较上述实验表明，采用实施例1、2、3制备方法，均能制备出符合要求的蟾皮有效部位。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属
技术领域：
技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。当前第1页12