本发明涉及医药
技术领域：
，特别是涉及氧化钇纳米颗粒的新用途，即在制备预防和治疗急性肝功能衰竭药物中的应用。
背景技术：
急性肝功能衰竭(ahf)是指患者原来无肝脏疾病，突然出现大量肝细胞坏死或肝功能异常，并在首发症状出现后8周内出现肝性脑病的一种危及生命的严重临床综合征。急性肝功能衰竭是由细菌、外伤、病毒性肝炎等肝毒性药物引起的，死亡率高，大约在70％～80％以上。目前，急性肝功能衰竭的详细机制仍不明确，但是，过度的炎症反应导致组织损伤被普遍认为是急性肝衰竭的主要病理机制之一。炎症小体是一种细胞浆中的多蛋白复合物，是机体固有免疫的重要组分之一，nlrp3炎症小体主要是由nlrp3受体蛋白、凋亡相关斑点样蛋白(asc)和半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase-1)三部分形成，其能够识别不同病原体的分子模式，导致细胞因子及炎症介质的释放，而过度的炎症反应会造成细胞和组织损伤。炎症小体在多种肝脏疾病中发挥重要作用，研究表明，nlrp3炎症小体的激活在急性肝衰竭中发挥重要作用，抑制nlrp3炎症小体活化是目前治疗急性肝衰竭的潜在治疗靶点。至今在临床治疗中，除了肝移植之外，还没有有效的治疗干预措施。因此，寻找一种安全和有效的急性肝功能衰竭的治疗药物是本领域亟待解决的问题。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术中存在的不足，第一方面，提供氧化钇纳米颗粒的新用途，即氧化钇纳米颗粒在制备预防和/或治疗急性肝功能衰竭药物中的应用，所述氧化钇纳米颗粒的粒径为5-200nm(优选10-100nm，更优选50-90nm)。所述氧化钇纳米颗粒的使用剂量为2.5-200mg/kg(体重)，优选20-40mg/kg(体重)，更优选30mg/kg(体重)。第二方面，本发明提供氧化钇纳米颗粒在制备通过减轻炎症反应预防和治疗相关疾病药物中的应用，所述氧化钇纳米颗粒的粒径为5-200nm(优选10-100nm，更优选50-90nm)；所述疾病优选急性肝功能衰竭。所述氧化钇纳米颗粒通过抑制炎症小体减轻炎症反应。所述氧化钇纳米颗粒抑制lps诱导的细胞炎症因子il-6的mrna表达20％以上。所述氧化钇纳米颗粒抑制lps诱导的细胞炎症因子il-1β的mrna表达15％以上。所述氧化钇纳米颗粒抑制lps诱导的细胞炎症因子分泌量20％以上。第三方面，本发明提供氧化钇纳米颗粒在制备通过减轻肝脏氧化应激水平预防和治疗相关疾病药物中的应用，所述氧化钇纳米颗粒的粒径为5-200nm(优选10-100nm，更优选50-90nm)；所述疾病优选急性肝功能衰竭。所述氧化钇纳米颗粒通过清除自由基减轻肝脏氧化应激水平。所述氧化钇纳米颗粒抑制lps诱导的细胞氧自由基水平增加25％以上。所述氧化钇纳米颗粒抑制lps诱导的细胞线粒体氧自由基水平增加20％以上。第四方面，本发明提供氧化钇纳米颗粒在制备通过减轻炎症反应和/或肝脏氧化应激水平预防和治疗相关疾病药物中的应用，所述氧化钇纳米颗粒的粒径为5-200nm(优选10-100nm，更优选50-90nm)；所述疾病优选急性肝功能衰竭。本发明提供了一种潜在的用于治疗和/或预防ahf的纳米粒子治疗剂——氧化钇(y2o3)纳米颗粒，。本发明采用了与临床上ahf相似的脂多糖/d-半乳糖胺(lps/d-galn)诱导的小鼠肝功能衰竭模型研究氧化钇纳米颗粒对其的作用，并探讨了y2o3纳米颗粒对lps诱导的小鼠巨噬细胞的体外作用，评价其对lps/d-galn诱导的小鼠肝功能衰竭模型的治疗作用。实验显示y2o3纳米颗粒与小鼠巨噬细胞和小鼠具有良好的生物相容性，y2o3纳米颗粒可减轻lps诱导的氧化应激及其诱发的炎症反应，包括抑制炎症介质的表达。由于y2o3纳米颗粒对小鼠氧化应激、炎症反应及急性肝功能衰竭均有改善作用，表明y2o3纳米颗粒有可能用作治疗ahf的有效药物。附图说明图1所示为y2o3纳米颗粒的电镜照片；图2所示为y2o3纳米颗粒的x射线衍射图谱；图3所示为y2o3纳米颗粒的紫外可见吸收图谱；图4所示为细胞内炎症因子il-6mrna表达水平柱状图；图5所示为细胞内炎症因子il-1βmrna表达水平柱状图；图6所示为细胞培养上清中il-6和il-1β含量柱状图；图7所示为ipa高级分析结果通路图；图8所示为细胞内活性氧检测实验中的dhe染色荧光图；图9所示为细胞内活性氧检测实验中的线粒体氧化应激染色荧光图；图10所示为小鼠体内肝脏氧化应激实验中肝组织mda含量的柱状图；图11所示为小鼠体内肝脏炎症反应实验中肝组织mpo含量的柱状图；图12所示为fhf模型小鼠肝组织病理切片的照片。具体实施方式由于稀土纳米材料具有独特的光、热、催化等性能，氧化钇作为其中的一种新型无机材料，广泛用于高温涂层材料、先进陶瓷材料、发光材料等领域。随着纳米技术的发展，稀土纳米材料越来越多地应用于生物医学领域，氧化钇纳米材料被大量用于荧光探针、药物载体及骨支架材料等领域。目前，氧化钇纳米颗粒在ahf中的治疗作用尚未有相关研究报道。发明人在研究中发现：急性肝功能衰竭发病机制的核心除了炎症反应会导致肝损伤外，大量的活性氧(ros)也会导致肝损伤。细菌脂多糖、过量药物、手术或创伤等的初始损伤会引起肠通透性改变，诱导肠内毒素和细菌的易位增加，导致巨噬细胞和中性粒细胞等产生大量的ros和炎性细胞因子，最终导致肝损伤的发生。因此，发明人分析减少ros、降低肝脏氧化应激水平也可以作为预防或减轻ahf的潜在治疗靶点。虽然有实验表明氧化钇纳米颗粒能够提高hek293细胞中氧化应激水平而促进hek293细胞凋亡(selvarajv.,bodapatis.,murraye.,等internationaljournalofnanomedicine,2014,9,1379–1391)，但是发明人通过对氧化钇纳米颗粒剂量、表面特性及理化特性差异进行大量研究后，筛选出了氧化钇纳米颗粒能够清除自由基同时抑制炎症小体的特定剂量，降低肝脏氧化应激水平，从而发挥减轻急性肝损伤的作用。于是，本发明提出了氧化钇纳米颗粒的一种新用途，即用于制备预防和治疗急性肝功能衰竭的药物。以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。目前，d-氨基半乳糖(dgalactosamine，d-galn)联合脂多糖(lipopolysaccharide，lps)诱导的肝功能衰竭是一种行之有效的实验模型，本实施例即采用这种实验模型评价氧化钇纳米颗粒的效果。一、y2o3纳米颗粒的表征1、y2o3纳米颗粒的获得氧化钇纳米颗粒购买自南京吉仓纳米科技有限公司(产品批号：jc170426)，粒径为70-90nm。2、y2o3纳米颗粒的粒径在室温条件下，将y2o3纳米颗粒悬浮于乙醇溶液中，浓度为0.1mg/ml。利用feitecnaig2f20透射电子显微镜(feicompany，美国)测定y2o3纳米颗粒的粒径大小，结果见图1。3、y2o3纳米颗粒的x射线衍射利用brukerd8advancex射线衍射仪(bruker，德国)检测固体y2o3纳米颗粒的x射线衍射图像，结果见图2。4、y2o3纳米颗粒的紫外可见光谱将y2o3纳米颗粒悬浮于磷酸缓冲液(pbs)中制备成浓度为0.25mg/ml的悬浮液，使用uv-vis光谱仪器(moleculardevices,sunnyvale，美国)测定悬浮液在200-800nm范围内紫外可见吸光度，结果见图3。图1的透射电镜照片表明y2o3纳米颗粒的平均直径为80nm。图2的xrd谱分析后，证实了y2o3纳米颗粒的谱图与氧化钇标准谱图一致，说明该y2o3纳米颗粒是氧化钇纳米粒子。图3的紫外可见光吸收图谱表明y2o3纳米颗粒在紫外区域具有良好的吸收作用。可见，图1-图3均确证了所得到的产物就是y2o3纳米颗粒。二、体外细胞实验该部分的体外细胞实验包括实时定量pcr检测细胞炎症因子表达、细胞内活性氧检测实验、测定细胞炎症因子释放、表达谱芯片测定氧化钇纳米颗粒对炎症小体通路的影响四个实验例，实验例中所用的各组细胞，由以下步骤1-3得到。1.氧化钇纳米颗粒悬浮液的配制用电子分析天平准确称量20mg氧化钇纳米颗粒，溶于50ml磷酸盐缓冲液(pbs)中，配制得到浓度为0.4mg/ml的氧化钇纳米颗粒母液，在70w功率下超声30min，放置于无菌离心管中，待用。2.巨噬细胞的培养小鼠巨噬细胞的细胞株raw264.7从美国菌种保藏中心获得。细胞培养基是含10％胎牛血清(gibco)和抗生素(50u/ml青霉素和50mg/ml链霉素)的dmem高糖培养基(以下简称培养基a)(购自invitrogen)。细胞在含有5％二氧化碳的37℃孵箱中培养。3.巨噬细胞的处理及分组体外细胞实验中，在经过低血清培养基(血清浓度为1.5％的培养基a)培养12h后，将细胞分成五个实验组，分别是空白对照组、lps处理组、氧化钇低浓度处理组(50ng/ml)、氧化钇中浓度处理组(100ng/ml)、氧化钇高浓度处理组(200ng/ml)，其中，空白对照组的细胞培养基为血清浓度为1.6％的培养基a，lps处理组的细胞培养基为含有1μg/mllps的血清浓度为1.6％的培养基a，氧化钇低浓度处理组的细胞培养基为含有1μg/mllps和50ng/ml氧化钇纳米颗粒的血清浓度为1.6％的培养基a，氧化钇中浓度处理组的细胞培养基为含有1μg/ml的lps和100ng/ml氧化钇纳米颗粒的血清浓度为1.6％的培养基a，氧化钇高浓度处理组的细胞培养基为含有1μg/ml的lps和200ng/ml氧化钇纳米颗粒的血清浓度为1.6％的培养基a。实验例1、氧化钇纳米颗粒对炎症小体的抑制效果实验本实验采用实时定量pcr方法检测细胞炎症因子表达。将第3部分得到的各组细胞继续培养8小时(不更换培养基)后，用超纯rna提取试剂盒(购自康为试剂公司)并按其中说明书提供步骤提取细胞mrna，具体为：加入1ml裂解液裂解细胞，再加入200μl氯仿后剧烈震荡，12000rpm离心10分钟，吸取上层溶液，然后加入等体积70％乙醇溶液，将混合溶液转移到吸附管中，12000rpm离心30秒，弃废液。向吸附管中加入700μl洗液1，12000rpm离心30秒，弃废液。加入500μl洗液2，12000rpm离心30秒。重复上一步骤后12000rpm离心3分钟。在吸附管中加入45μl无核酸酶的水，室温放置2分钟后离心收集rna的溶液，接着采用第一链逆转录试剂盒(美国fermentas公司)进行逆转录，将600ngrna和1μl随机引物溶液混合，用无核酸酶的水补足至12μl，再加入8μl反应混合物。25℃孵育5分钟，然后42℃孵育60分钟，最后72℃孵育5分钟，获得cdna。进一步按下列组成配置实时定量反应混合液：10μl实时定量pcrmastermix(日本东洋纺公司)，0.4μl上游引物(10μm)，0.4μl下游引物(10μm)，0.2μlcdna溶液，9μldh2o，接着按三步法设定pcr反应程序95℃，1min；95℃，10s；60℃，15s；72℃，20s，循环次数为40次。其中扩增引物序列如表1所示:表1扩增引物的序列基因上游引物下游引物pro-il-6ttccatccagttgccttcttttctgcaagtgcatcatcgtpro-il-1βttcaggcaggcagtatcaccagcaggttatcatcatcatccgapdhccaaggtcatccatgacaacttaggggccatccacagtctt检测结果见图4和图5。从图4和图5可以看出，相对于空白对照(图中的“对照”)组，lps处理显著提高raw264.7细胞的il-6和il-1βmrna表达(*p＜0.05)，与lps组相比，50ng/ml氧化钇(yo-50)对il-6mrna水平无明显影响；而100ng/ml(yo-100)氧化钇能够显著降低lps引起的il-6mrna水平升高(&p＜0.05)，与lps组相比，yo-100组il-6mrna水平大约降低21％；200ng/ml(yo-200)氧化钇同样能够降低lps引起的il-6水平升高(&p＜0.05)，与lps组相比，yo-200组il-6mrna水平大约降低30.8％；另外，随着氧化钇浓度增加，il-6mrna水平逐渐下降，呈明显的剂量效应关系。对于il-1β而言，50ng/ml，100ng/ml及200ng/ml氧化钇都可以显著降低il-1βmrna水平，其中，与lps组相比，yo-200组il-1βmrna水平大约降低35％，并且三个氧化钇组之间呈明显的量效关系。因此，本实验例表明氧化钇能够抑制lps诱导的细胞炎症因子的mrna表达，抑制炎症小体，减轻炎症反应。实验例2、氧化钇纳米颗粒对氧自由基的清除效果实验细胞内活性氧检测实验：通过氧自由基探针dihydroethidium(dhe，invitrogen)和线粒体氧自由基探针mitosox染料(invitrogen)处理raw264.7细胞可以检测氧化钇纳米颗粒对细胞和线粒体中ros水平的影响。将第3部分得到的空白对照组、lps处理组和氧化钇高浓度处理组(200ng/ml)的细胞分别进行以下处理：1)将三组细胞培养1h后(不更换培养基)，各组分别加入5μm的dhe无血清培养基37℃孵育30分钟，然后用37℃预热的pbs清洗两次，利用荧光显微镜(echo公司)检测细胞荧光强度，结果如图8所示。2)将三组细胞培养6h后(不更换培养基)，各组细胞更换含有浓度为5μm的mitosox的无血清培养基37℃孵育10分钟，pbs清洗两次后利用荧光显微镜(echo公司)检测细胞荧光强度，结果见图9。从图8可以看出，相对空白对照，lps处理后细胞内荧光强度增加，表明lps处理导致细胞内ros水平增加，而相对于lps组，200ng/ml氧化钇能够显著降低细胞荧光强度，表明氧化钇能够抑制lps诱导的细胞内ros水平增加，说明氧化钇纳米颗粒能清除氧自由基，减轻氧化应激水平。从图9可以看出，相对空白对照，lps处理后细胞内荧光强度增加，表明lps处理导致细胞线粒体ros水平增加，而相对于lps组，200ng/ml氧化钇能够显著降低细胞荧光强度，表明氧化钇能够抑制lps诱导的细胞线粒体ros水平增加，说明氧化钇纳米颗粒能清除氧自由基，减轻氧化应激水平。实验例3、氧化钇纳米颗粒炎症反应减轻效果实验测定细胞炎症因子释放：使用第3部分得到的各组细胞培养24小时后(不更换培养基)，收取细胞培养上清，4000rpm离心5min，上清用酶联免疫吸附试验(elisa)检测炎症因子水平。用白介素6(il-6)和白介素1β(il-1β)酶联免疫吸附试验(elisa)试剂盒(peprotech，美国)及试剂盒中说明书方法测定培养基上层清液中raw264.7细胞分泌的il-6和il-1β的水平，结果如图6所示。图6的a幅和b幅均表明lps诱导raw264.7细胞后，il-6和il-1β的水平显著增高(*p＜0.05)。其中相对于空白对照组(图中的“对照”)，lps处理能分别提高2.4和17倍的il-6和il-1β水平，50ng/ml，100ng/ml及200ng/ml氧化钇都可以显著降低细胞il-6的分泌水平，与lps组相比，200ng/ml氧化钇能够降低大约29％的il-6分泌水平，三个氧化钇组之间呈明显的量效关系。与lps组相比，50ng/ml氧化钇(yo-50)对il-1β分泌水平有一定程度的降低；100ng/ml(yo-100)氧化钇能够显著降低lps引起的il-1β分泌水平升高(&p＜0.05)，与lps组相比，yo-100组il-1β分泌大约降低24％；200ng/ml(yo-200)氧化钇同样能够降低lps引起的il-6分泌水平升高(&p＜0.05)，与lps组相比，yo-200组il-1β分泌水平大约降低30％；因此，说明氧化钇能够抑制lps诱导的细胞炎症因子分泌，减轻炎症反应。实验例4、氧化钇纳米颗粒抑制炎症小体实验本实验用表达谱芯片测定氧化钇纳米颗粒对炎症小体通路的影响。取第3部分得到的lps处理组(lps)和氧化钇高浓度处理组(yo,200ng/ml)细胞继续培养8小时后，用trzol裂解液(康为世纪)裂解细胞，交由上海欧易公司采用表达谱芯片(安捷伦公司)进行实验，获取表达差异的基因数据后，由中国医学科学院基础医学研究所利用ipa(ingenuitypathwayanalysis)软件进行高级数据分析，结果如图7所示。图7是ipa分析后获得的炎症小体信号通路图，在lps诱导的炎症小体通路中，lps通过膜表面toll样受体4(tlr4)激活髓样分化因子(myd88)，引起下游nlrp3蛋白、凋亡相关斑点样蛋白(asc)及半胱氨酸蛋白酶-1蛋白组(pro-casp1)装成炎症复合体，剪切白介素-1和18的前体蛋白(pro-il-1β和pro-il-18)，形成白介素-1和白介素-18蛋白，促进炎症反应。另外一方面，lps可以促进nf-κb通路活化，转录形成pro-il-1β和pro-il-18，两个通路协同促进炎症反应发生和发展。yo组中nf-κb通路及nlrp3炎症小体通路中凋亡相关斑点样蛋白(asc)下调(灰色代表下调)，表明氧化钇纳米颗粒通路能够抑制lps诱导的nlrp3炎症小体和nf-κb通路活化。第二部分体外细胞实验中的实验1、实验3和实验4都证明氧化钇纳米颗粒可减轻炎症反应，实验2证明氧化钇纳米颗粒可减轻氧化应激水平，这些实验共同证明氧化钇纳米颗粒与通过减轻炎症水平和/或氧化应激水平来预防和治疗的疾病相关。三、小鼠体内模型实验该部分的体内模型实验包括肝脏氧化应激水平实验、肝脏炎症反应水平实验、肝组织病理切片实验三个实验例，实验例中所用的各组小鼠模型，由以下方法得到。动物模型的建立：雄性c57bl/6j小鼠(8-10周龄)从维通利华(中国北京)购买，在5-7天环境适应后进行实验。除空白对照组动物不作任何处理外，小鼠均接受d-galn(250mg/kg)和lps(10μg/kg)的腹腔注射，然后随机分为四组并分别腹腔注射给予超高剂量(300mg/kg)、高剂量(30mg/kg)、低剂量(10mg/kg)的y2o3纳米颗粒和等体积的溶剂pbs，形成超高剂量组、高剂量组(yo-h)、低剂量组(yo-l)和模型组(模型)。其中超高剂量组注射完毕后，动物精神状态差，活跃度降低，说明超高剂量氧化钇纳米粒子可能会引起副作用，因此超高剂量组小鼠未进行以下实验。在氧化钇注射完毕8小时后，采集小鼠肝脏。肝脏组织用预冷的生理盐水快速清洗后冷冻保存在液氮中，备用。实验例5、肝脏氧化应激水平实验mda检测试剂盒(南京建成公司，货号a003-1)测定肝组织mda含量，丙二醛(mda)是氧化应激产物，因此肝脏氧化应激是通过对肝脏中mda含量来确定的，结果见图10。由图10可以看出，正常肝脏组织mda含量为0.152±0.011mmol/mg蛋白，lps/d-galn诱导后小鼠(模型组)肝脏组织mda含量为0.210±0.017mmol/mg蛋白，mda含量显著增高(*p＜0.05)。y2o3纳米颗粒输注小鼠体内后低剂量组肝脏中mda含量为0.189±0.018mmol/mg蛋白，高剂量组mda含量是0.164±0.018mmol/mg蛋白。该结果说明与模型组相比，y2o3纳米颗粒能够显著降低肝脏组织mda含量(&p＜0.05)。另外，高剂量y2o3纳米颗粒较之低剂量能够更加显著降低肝脏组织mda含量(#p＜0.05)，且与空白对照组相比无显著差异。实验例6、肝脏炎症反应水平实验mpo检测试剂盒(南京建成生物科技有限公司，货号a044-1)测定肝组织mpo活性，结果见图11。图11结果显示，正常肝脏组织每毫克蛋白中mpo活性为1.97±0.051u/mg蛋白，lps/d-galn诱导后小鼠肝脏组织每毫克蛋白中mpo活性为2.718±0.300u/mg蛋白，mpo活性显著增高(*p＜0.05)。y2o3纳米颗粒输注小鼠体内后发现低浓度肝脏组织每毫克蛋白中mpo活性为2.402±0.11u/mg蛋白，高浓度组mpo含量是2.162±0.256u/mg蛋白。与模型组相比，无论是高剂量还是低剂量y2o3纳米颗粒能够显著降低肝脏组织mpo活性(&p＜0.05)，且与空白对照组相比无显著差异。实验例7、肝组织病理切片实验取小鼠肝组织，病理蜡块包埋和he染色处理后，(方法步骤参考，hod,e.a.,zhang,n.,sokol,s.a.,等blood,115,4284-4292)观察肝组织的病理变化，结果如图12所示。图12结果显示，与正常对照组相比，模型组肝损伤明显加重，主要表现浸润炎症细胞增多，如标号1所示为浸润的炎症细胞，主要以淋巴细胞和中性粒细胞为主，另外，损伤还表现为肝细胞排列混乱(标号2)，而低剂量组(yo-l)能够降低浸润的炎症细胞数量(标号3)，减弱肝细胞排列混乱。与模型组相比，高剂量组(yo-h)30mg/kg氧化钇显著降低浸润的炎症细胞，如标号4所示，减弱肝细胞排列混乱，表明氧化钇纳米颗粒能够有效减弱急性肝损伤。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的内容。当前第1页12