一种趋化内源性细胞及诱导成软骨分化的生物活性支架及其用途的制作方法

本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种趋化内源性细胞及诱导成软骨分化的生物活性支架及其制备方法和用途。

背景技术：

骨关节炎(osteoarthritis,oa)是一种最普遍的关节退行性疾病。其主要的病理特征包括：软骨降解，软骨下骨的不规则骨化及其继发性炎症。临床特征主要表现为：关节疼痛，僵硬，活动度受限等。目前，临床上的药物治疗方法对于缓解疾病的进展效果不大，到疾病晚期，大部分骨关节炎病人都不得不接受关节置换手术，但手术风险软大及术后容易出现并发症，且关节置换假体使用寿命的问题，使得长期疗效不佳等。于是，寻找一种有效的治疗方法则非常重要。

通过干细胞移植治疗骨关节炎已经有广泛地报道，由于外源性细胞移植，存在免疫原性等问题，目前研究的热点在于如何定向刺激诱导内源性干细胞迁移到损伤处，从而进行损伤修复。基因细胞衍生因子(sdf-1)是一种公认的趋化因子，已经被实验证实可以促进干细胞迁移与归巢。

如何诱导干细胞成软骨定向分化，是软骨损伤细胞移植疗法面对的一个重要问题。转化生长因子-β(tgf-β)是一种常见的成软骨分化的诱导因子，在经典的间充质干细胞成软骨诱导液中的主要成分。因此软骨损伤修复过程中提高损伤区tgf-β含量有利于诱导干细胞成软骨分化促进软骨修复。

目前，国内外均未报道具有内源性细胞趋化及诱导成软骨分化功能的生物活性支架。因此，急需一种可以促进骨源性干细胞迁移到损伤区，同时可以诱导其成软骨分化，从而达到更好的软骨修复目的的生物活性支架。

技术实现要素：

基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种趋化内源性细胞及诱导成软骨分化的生物活性支架，其可以长时间释放趋化因子sdf-1，吸引自体内源性细胞趋化迁移到损伤区，同时长期缓释的tgf-β又可以诱导其成软骨分化，达到吸引内源性细胞并实施有效地软骨损伤修复的目的。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种趋化内源性细胞及诱导成软骨分化的生物活性支架，包含以下组分：sdf-1、tgf-β、丝素蚕白和多孔支架。

优选地，所述sdf-1、tgf-β和丝素蚕白的质量比为(1×10^-6～5×10^-4)：(1×10^-5～0.002)：(10～200)。

优选地，所述sdf-1、tgf-β和丝素蚕白饱和吸附在多孔支架中。

优选地，所述多孔支架原料选自明胶海绵、胶原、壳聚糖、海藻酸钠和透明质酸中的至少一种。

优选地，所述多孔支架孔隙直径为50～600μm。

优选地，所述多孔支架所述多孔支架为明胶海绵多孔支架。

本发明还提供了所述的生物活性支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)按比例称取sdf-1、tgf-β和丝素蚕白，加水溶解，制备得到蛋白混合液；

(2)取多孔支架，将步骤(1)制备得到蛋白混合液吸附到所述多孔支架上至饱和，然后真空冷冻干燥，即得所述生物活性支架。

优选地，所述步骤(2)中多孔支架孔隙直径为50～600μm。

优选地，所述步骤(2)中真空冷冻干燥的温度为-10～-80℃，时间为1～7天。

本发明所述丝素蚕白可通过从蚕茧中提取获得，也可为市售的丝素蚕白产品。

优选地，所述丝素蚕白提取方法包括以下步骤：

a、脱胶：将桑蚕蚕丝放入的碳酸钠水溶液中，90～100℃水浴20～60分钟，纯水清洗；以上过程重复3次，脱去丝胶蛋白，得到丝素蛋白，然后于20～60℃烘干，获得干燥后的丝素蛋白；

b、溶解：将上述干燥后的丝素蛋白溶解于溴化锂水溶液中，55～65℃水浴30～300分钟至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白的混合液；

c、透析：将含丝素蛋白的混合液用截留分子量为1000～20000道尔顿的透析袋进行透析，然后用去离子水作为透析液在3天透析10～12次，去除溶液中的溴化锂成分，获得截留液；

d、将上述截留液离心，取上清液，冷冻干燥，即得所述丝素蛋白。

优选地，所述步骤a中桑蚕蚕丝和碳酸钠水溶液的重量体积比为20g：1l。

优选地，所述步骤a中碳酸钠水溶液的浓度为0.5％。

优选地，所述步骤b中丝素蛋白溶解于溴化锂水溶液后的质量浓度为16％。

优选地，所述步骤b中溴化锂水溶液的浓度为9m。

优选地，所述步骤c中作为透析液的去离子水的体积为所述含丝素蛋白的混合液体积的10倍。

本发明中这种通过同时释放sdf-1和tgf-β改善丝素蛋白-多孔支架的成软骨性能的方法，能够充分发挥两者的作用，能取得更好的软骨损伤修复效果。

优选地，所述步骤d中将所述截留液于4℃，5000g，离心10分钟。

本发明还提供了所述的生物活性支架在制备软骨缺损修复材料中的用途。

本发明所述生物活性支架可用于制备软骨缺损修复材料，具有很好的吸引自体内源性细胞趋化迁移到损伤区，同时诱导其成软骨分化的作用，可有效提高软骨损伤的修复效果。

本发明还提供了一种软骨缺损修复材料，包含所述的生物活性支架和修复材料领域可接受的辅料。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：(1)本发明提供了一种具有内源性细胞趋化及诱导成软骨分化功能的生物活性支架，其含有趋化因子sdf-1，成软骨诱导因子(tgf-β)和丝素蛋白，可以有效解决软骨修复过程中损伤区成软骨分化效率低的缺点；(2)本发明生物活性支架通过趋化因子sdf-1吸引内源性细胞更多地向修复材料区迁移，同时诱导因子tgf-β诱导细胞成软骨分化，可有效提高软骨损伤的修复效果。

附图说明

图1为本发明生物活性支架与单纯明胶海绵支架的扫描电镜检测结果图，其中，gs代表本发明生物活性支架；g0代表单纯明胶海绵支架。

图2为本发明生物活性支架诱导细胞迁移的实验结果图。

图3为本发明生物活性支架诱导间充质干细胞成软骨分化的实验结果图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本发明趋化内源性细胞及诱导成软骨分化的生物活性支架的一种实施例，包含以下组分：sdf-1、tgf-β、丝素蚕白和明胶海绵；所述sdf-1、tgf-β和丝素蚕白的质量比为1×10^-6：1×10^-5：10。

所述生物活性支架的制备方法包括以下步骤：

(1)按比例称取sdf-1、tgf-β和丝素蚕白，加水溶解，制备得到蛋白混合液，使所述蛋白混合液中sdf-1的浓度为1ng/ml，tgf-β的浓度为10ng/ml，丝素蚕白的浓度为10mg/ml；

(2)取孔隙直径为600μm的无菌干燥明胶海绵，将步骤(1)制备得到蛋白混合液吸附到所述多孔支架上至饱和，然后于-80℃真空冷冻干燥1天，即得所述生物活性支架。

所述丝素蚕白提取方法包括以下步骤：a、脱胶：将100g桑蚕蚕丝放入5l的2m碳酸钠水溶液中，90～100℃水浴20～60分钟，纯水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，得到丝素蛋白，然后于20～60℃烘干，获得干燥后的丝素蛋白；b、溶解：将上述干燥后的丝素蛋白以16％的质量浓度溶解于9m的溴化锂水溶液中，55～65℃水浴30～300分钟至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白的混合液；c、透析：将含丝素蛋白的混合液用截留分子量为1000～20000道尔顿的透析袋进行透析，然后用所述含丝素蛋白的混合液体积10倍的无菌去离子水作为透析液在3天透析10～12次，去除溶液中的溴化锂成分，获得截留液；d、将上述截留液于4℃，5000g，离心10分钟，去除底部的未溶解丝素蛋白和其它存在的不溶性颗粒，取上清液，冷冻干燥，即得所述丝素蛋白。

实施例2

本发明趋化内源性细胞及诱导成软骨分化的生物活性支架的一种实施例，包含以下组分：sdf-1、tgf-β、丝素蚕白和明胶海绵；所述sdf-1、tgf-β和丝素蚕白的质量比为1.5×10^-4：5×10^-4：80。

所述生物活性支架的制备方法包括以下步骤：

(1)按比例称取sdf-1、tgf-β和丝素蚕白，加水溶解，制备得到蛋白混合液，使所述蛋白混合液中sdf-1的浓度为150ng/ml，tgf-β的浓度为500ng/ml，丝素蚕白的浓度为80mg/ml；

(2)取孔隙直径为50μm的无菌干燥海藻酸钠海绵，将步骤(1)制备得到蛋白混合液吸附到所述多孔支架上至饱和，然后于-10℃真空冷冻干燥7天，即得所述生物活性支架。

所述丝素蚕白提取方法包括以下步骤：a、脱胶：将100g桑蚕蚕丝放入5l的2m碳酸钠水溶液中，90～100℃水浴20～60分钟，纯水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，得到丝素蛋白，然后于20～60℃烘干，获得干燥后的丝素蛋白；b、溶解：将上述干燥后的丝素蛋白以16％的质量浓度溶解于9m的溴化锂水溶液中，55～65℃水浴30～300分钟至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白的混合液；c、透析：将含丝素蛋白的混合液用截留分子量为1000～20000道尔顿的透析袋进行透析，然后用所述含丝素蛋白的混合液体积10倍的无菌去离子水作为透析液在3天透析10～12次，去除溶液中的溴化锂成分，获得截留液；d、将上述截留液于4℃，5000g，离心10分钟，去除底部的未溶解丝素蛋白和其它存在的不溶性颗粒，取上清液，冷冻干燥，即得所述丝素蛋白。

实施例3

本发明具有内源性细胞趋化及诱导成软骨分化功能的生物活性支架的一种实施例，包含以下组分：sdf-1、tgf-β、丝素蚕白和壳聚糖多孔支架；所述sdf-1、tgf-β和丝素蚕白的质量比为3×10^-5：0.001：200。

所述生物活性支架的制备方法包括以下步骤：

(1)按比例称取sdf-1、tgf-β和丝素蚕白，加水溶解，制备得到蛋白混合液，使所述蛋白混合液中sdf-1的浓度为30ng/ml，tgf-β的浓度为1000ng/ml，丝素蚕白的浓度为200mg/ml；

(2)取孔隙直径为300μm的无菌干燥壳聚糖多孔支架，将步骤(1)制备得到蛋白混合液吸附到所述多孔支架上至饱和，然后于-40℃真空冷冻干燥3天，即得所述生物活性支架。

所述丝素蚕白提取方法包括以下步骤：a、脱胶：将100g桑蚕蚕丝放入5l的2m碳酸钠水溶液中，90～100℃水浴20～60分钟，纯水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，得到丝素蛋白，然后于20～60℃烘干，获得干燥后的丝素蛋白；b、溶解：将上述干燥后的丝素蛋白以16％的质量浓度溶解于9m的溴化锂水溶液中，55～65℃水浴30～300分钟至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白的混合液；c、透析：将含丝素蛋白的混合液用截留分子量为1000～20000道尔顿的透析袋进行透析，然后用所述含丝素蛋白的混合液体积10倍的无菌去离子水作为透析液在3天透析10～12次，去除溶液中的溴化锂成分，获得截留液；d、将上述截留液于4℃，5000g，离心10分钟，去除底部的未溶解丝素蛋白和其它存在的不溶性颗粒，取上清液，冷冻干燥，即得所述丝素蛋白。

实施例4

本发明具有内源性细胞趋化及诱导成软骨分化功能的生物活性支架的一种实施例，包含以下组分：sdf-1、tgf-β、丝素蚕白和海藻酸钠多孔支架；所述sdf-1、tgf-β和丝素蚕白的质量比为8.5×10^-6：6×10^-4：170。

所述生物活性支架的制备方法包括以下步骤：

(1)按比例称取sdf-1、tgf-β和丝素蚕白，加水溶解，制备得到蛋白混合液，使所述蛋白混合液中sdf-1的浓度为8.5ng/ml，tgf-β的浓度为600ng/ml，丝素蚕白的浓度为170mg/ml；

(2)取孔隙直径为400μm的无菌干燥海藻酸钠多孔支架，将步骤(1)制备得到蛋白混合液吸附到所述多孔支架上至饱和，然后于-70℃真空冷冻干燥2天，即得所述生物活性支架。

所述丝素蚕白提取方法包括以下步骤：a、脱胶：将100g桑蚕蚕丝放入5l的2m碳酸钠水溶液中，90～100℃水浴20～60分钟，纯水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，得到丝素蛋白，然后于20～60℃烘干，获得干燥后的丝素蛋白；b、溶解：将上述干燥后的丝素蛋白以16％的质量浓度溶解于9m的溴化锂水溶液中，55～65℃水浴30～300分钟至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白的混合液；c、透析：将含丝素蛋白的混合液用截留分子量为1000～20000道尔顿的透析袋进行透析，然后用所述含丝素蛋白的混合液体积10倍的无菌去离子水作为透析液在3天透析10～12次，去除溶液中的溴化锂成分，获得截留液；d、将上述截留液于4℃，5000g，离心10分钟，去除底部的未溶解丝素蛋白和其它存在的不溶性颗粒，取上清液，冷冻干燥，即得所述丝素蛋白。

实施例5

本发明具有内源性细胞趋化及诱导成软骨分化功能的生物活性支架的一种实施例，包含以下组分：sdf-1、tgf-β、丝素蚕白和胶原多孔支架；所述sdf-1、tgf-β和丝素蚕白的质量比为5×10^-4：0.002：50。

所述生物活性支架的制备方法包括以下步骤：

(1)按比例称取sdf-1、tgf-β和丝素蚕白，加水溶解，制备得到蛋白混合液，使所述蛋白混合液中sdf-1的浓度为500ng/ml，tgf-β的浓度为2000ng/ml，丝素蚕白的浓度为50mg/ml；

(2)取孔隙直径为500μm的胶原多孔支架，将步骤(1)制备得到蛋白混合液吸附到所述多孔支架上至饱和，然后于-20℃真空冷冻干燥5天，即得所述生物活性支架。

所述丝素蚕白提取方法包括以下步骤：a、脱胶：将100g桑蚕蚕丝放入5l的2m碳酸钠水溶液中，90～100℃水浴20～60分钟，纯水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，得到丝素蛋白，然后于20～60℃烘干，获得干燥后的丝素蛋白；b、溶解：将上述干燥后的丝素蛋白以16％的质量浓度溶解于9m的溴化锂水溶液中，55～65℃水浴30～300分钟至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白的混合液；c、透析：将含丝素蛋白的混合液用截留分子量为1000～20000道尔顿的透析袋进行透析，然后用所述含丝素蛋白的混合液体积10倍的无菌去离子水作为透析液在3天透析10～12次，去除溶液中的溴化锂成分，获得截留液；d、将上述截留液于4℃，5000g，离心10分钟，去除底部的未溶解丝素蛋白和其它存在的不溶性颗粒，取上清液，冷冻干燥，即得所述丝素蛋白。

实施例6

本实施例以实施例1中的生物活性支架为例，检测本发明生物活性支架与多孔支架的空间结构。

利用扫描电镜(philipscm10,eindhoven,holland)检测实施例1所述生物活性支架与单纯明胶海绵的空间结果。分别取裁剪成直径2mm的实施例1所述生物活性支架及单纯明胶海绵做扫描电镜检测，观察分析空间结构。结果如图1所示，结果表明本发明生物活性支架保持着良好的多孔性，有利于细胞的迁移与附着，其孔径相对于单纯明胶海绵显得较小，材料显得更为致密，显示其可能有更好的机械强度，有利于软骨损伤修复。

实施例7

本实施例以实施例1中的生物活性支架为例，研究本发明生物活性支架诱导细胞趋化的作用。

(一)实验方法

1、大鼠间充质干细胞(mscs)培养

(1)取两周龄sd大鼠，引颈处死，浸泡于75％酒精消毒，分离肌肉取大腿股骨，两端剪开，用α-mem+10％胎牛血清(v/v)培养基冲洗骨髓腔，收集冲洗液，梯度离心收集细胞；

(2)将收集到的细胞重悬，加入α-mem+10％胎牛血清(v/v)培养基中，置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养；

(3)待细胞长成细胞聚落后，进行细胞传代，每三天换一次培养液，取培养3-5代的细胞进行后续实验；

2、准备条件培养基：将实施例1中的生物活性支架(6mm)(实验组1)和丝素蛋白-明胶海绵支架(丝素蚕白饱和吸附于明胶海绵多孔支架上制备而成)(对照组1)分别浸泡于1ml无血清培养液(α-mem培养基)1天，等待生物活性支架中的因子释放在培养基里面，之后收集培养液作为划痕模型条件培养基；

3、将步骤1获得的大鼠间充质干细胞(mscs)种植于6孔板里(1×10⁵cells/cm²)，等细胞生长到几乎100％密度时，取灭菌枪头在孔板中的单层细胞中划一道划痕，制造一下无细胞的划痕区域；然后加入步骤2准备好的条件培养基，空白组则加入α-mem培养基，显微镜下拍照纪录刚开始刺激时的划痕区域；刺激8小时后，显微镜下拍照纪录，检测划痕区域宽度的变化。

(二)实验结果

实验结果如图2所示，结果表明，与对照组1(丝素蛋白-明胶海绵组)相比，实验组1的划痕区域宽度明显减小，迁移的细胞更多。说明实施例1所述生物活性支架(实验组1)可以显著地提高细胞的迁移能力，诱导细胞趋化。本发明其他生物活性支架诱导细胞趋化的作用与本实施例类似，具体数据省略。

实施例8

本实施例以实施例1中的生物活性支架为例，研究本发明生物活性支架诱导成软骨分化的效果。

(一)实验方法

1、大鼠间充质干细胞(mscs)培养

(1)取两周龄sd大鼠，引颈处死，浸泡于75％酒精消毒，分离肌肉取大腿股骨，两端剪开，用α-mem+10％胎牛血清(v/v)培养基冲洗骨髓腔，收集冲洗液，梯度离心收集细胞；

(2)将收集到的细胞重悬，加入α-mem+10％胎牛血清(v/v)培养基中，置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养；

(3)待细胞长成细胞聚落后，进行细胞传代，每三天换一次培养液，取培养3-5代的细胞进行后续实验；

2、取步骤1获得的大鼠mscs，种植于实施例1所述生物活性支架(实验组2)和丝素蛋白-明胶海绵支架(对照组1)中(2×10⁵cells/材料)，用α-mem+10％fbs(v/v)培养基培养于37℃，5％co2的细胞培养箱中；

3、培养第14天取材，收集细胞，提取rna，将rna逆转录成cdna，利用qrt-pcr检测sox9的表达水平(gapdh作为内参)，用于评价生物活性支架诱导成软骨分化的功能。所述sox9和gapdh的检测引物序列信息如表1所示：

表1引物序列信息

(二)实验结果

实验结果如图3所示，结果表明，与对照组2(丝素蚕白-明胶海绵组)相比，实施例1所述生物活性支架(实验组2)能显著提高成软骨标记基因sox9的表达水平，说明所述生物活性支架可有效诱导干细胞成软骨分化。本发明其他生物活性支架诱导干细胞成软骨分化的效果与本实施例类似，具体数据省略。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

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<110>暨南大学

<120>一种趋化内源性细胞及诱导成软骨分化的生物活性支架及其用途

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