本发明属于生物医学领域，涉及一种用于抗衰老的干细胞组合物及其应用。
背景技术：
：衰老是人体机能变缓的直接表现，是一种自然的过程，也是一种复杂多变的过程。在整个生命过程中，机体会受到外界环境中各种物质、能量、信息的影响和作用，且组织和器官也会不可避免地发生损伤和功能衰退。随着医疗技术和生活水平提高，老龄化人口数量增加，伴随衰老，人体器官生理功能发生病变，如高血压、高血糖、高血脂、高尿酸、高体重、冠状动脉粥样硬化等疾病增加。延缓衰老可能减少这些疾病的发生，从整体上提高机体功能状态，从而提高机体的生命质量。研究抗衰老是当今社会的热点课题，也是人们不断追求的目标。目前，抗衰老的方法五花八门，比如调整饮食、适当运动、民间验方等。尽管各有所长，但至今还没有经过系统研究证明确实有效的手段。现阶段再生医学的兴起激发了人们对各种干细胞、组织工程支架和细胞生长因子的研究热潮。干细胞(stemcells，sc)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能性细胞，可以对多种组织、器官、系统的老化退行性病变进行再生性修复，使其结构和功能正常化、年轻化，从整体上调控机体状态，是一种全身性、系统性、根本性的保健。如专利申请cn102486475a公开了一种自体脂肪干细胞抗衰老效果的评价方法，应用脂肪干细胞保健和治疗能提高机体对各种脂蛋白的代谢功能。再如专利申请cn103387962a公开了一种具有抗衰老及延长寿命功效的自体干细胞抗衰老技术，通过定期地、长期地、多次地移植植物和蛋白诱导性自体造血干细胞(ppihps)，补充生命个体机体组织器官生长、再生和修复所需的种子细胞，及其生成的各种器官功能细胞，再生性修复机体器官的衰老结构和功能，实现提升器官机能，延缓衰老和增加寿命的目的。但是，单纯利用干细胞实现机体抗衰老，忽略了干细胞自身微环境，相邻细胞、分泌的蛋白质、细胞外基质、新陈代谢信号(氧气、葡萄糖等)以及力学参数(剪切应力、组织硬度等)……统统都会影响干细胞的“行为”，实际抗衰老的效果并不理想。免疫系统对干细胞发挥功能具有重要影响。维持体内平衡的重要分支是细胞的持续更新，而干细胞巢内的免疫细胞对于细胞更新过程至关重要：骨髓中的巨噬细胞被证实直接与母红细胞(erythroblast)相互作用。如果这种直接互作过程受阻，母红细胞将不能正常成熟，不能补充血液中的红细胞，最终易引发再生障碍性贫血。科学家还发现免疫细胞参与调节海马体记忆和学习功能。啮齿动物的海马体神经发生过程与t细胞和小胶质细胞(大脑和脊髓的巨噬细胞)有关联。免疫缺陷小鼠的神经发生过程会出现故障，进一步导致记忆、学习能力衰退。虽然目前仍不清楚海马区神经发生过程中免疫细胞如何影响神经干细胞巢。但因为仅仅只有一小部分新生神经元融入海马回路，大多数新生神经元会走向凋亡。所以，科学家们推测，小胶质细胞负责吞噬剩余的大部分神经元。免疫细胞也参与青春期乳腺发育过程。进入青春期后，在卵巢激素的刺激下，乳腺导管向外增生，同时，不同的免疫细胞(肥大细胞、嗜酸粒细胞、巨噬细胞)会迁移至导管周围区域。其中，肥大细胞分泌降解蛋白的丝氨酸蛋白酶，该酶调控乳腺导管周围胶原纤维的降解和重组。巨噬细胞负责清理凋亡细胞碎片，直接作用于乳腺干细胞。研究发现，小鼠的肥大细胞、巨噬细胞发生突变后，会抑制青春期乳腺导管细胞的快速增值和分化。通过上述对于骨髓、乳腺、大脑的研究，我们可以发现干细胞巢中的免疫细胞会调控干细胞功能的行使，维持细胞增殖和凋亡的“收支平衡”。免疫细胞除了能够调控干细胞更好地发挥作用外，二者“合作”还可以应对来自外界的各种伤害。例如，研究表明骨骼肌损伤修复涉及免疫细胞和干细胞联合作用。首先，免疫细胞负责清除受损的肌肉纤维。随后，嗜酸性粒细胞促进纤维/脂肪母细胞(faps)生成纤维细胞和脂肪细胞，进一步分泌胶原蛋白和生长因子激活肌肉纤维再生。同时，t细胞分泌双调蛋白(amphiregulin)，该蛋白参与肌肉干细胞“卫星细胞”(satellitecells)的分化，促进新肌肉细胞生成。越来越多的研究揭示免疫细胞是干细胞研究领域不可忽视的部分，是启动组织再生、损伤修复的关键元素。理论上，靶向这些免疫细胞应该能够加快损伤修复的过程。然而，免疫细胞群存在多样性和异质性，所以很难开发出统一、有效的治疗方法。这意味着，我们需要对免疫细胞种群进行细化研究，以精准挖掘到控制组织修复的特定免疫细胞。技术实现要素：基于上述现有技术的缺陷，本发明提供一种新型抗衰老干细胞组合物，通过选择合适的干细胞与免疫细胞联合进行抗衰老方面的应用。一方面，免疫细胞可提高机体的免疫力，清除衰老死亡癌变的细胞，保持机体年轻态；另一方面，干细胞修能复受损的器官。更重要的是，通过免疫细胞及干细胞分泌的多种细胞因子及激素，维持机体神经内分泌系统平衡，在科学地预防疾病发生的基础上，未病先治，更有效地抵抗机体衰老。本发明提供一种抗衰老干细胞组合物，其由干细胞和免疫细胞组成。进一步地，所述组合物中先使用免疫细胞，后使用干细胞。更进一步地，所述组合物中免疫细胞和干细胞使用间隔为2周-6个月。更进一步地，所述组合物中免疫细胞和干细胞使用间隔为1个月-3个月。进一步地，所述干细胞为异体细胞或自体细胞。具体选自hcbsc、huc-msc、hadsc中的一种或多种。更进一步地，所述干细胞选自hcbsc、huc-msc。进一步地，所述免疫细胞为nk细胞，所述nk细胞包含高活性nk(hank)细胞。为提高组合物抗衰老的疗效，所称的hank细胞，非普通的体内nk细胞。普通的nk细胞不但数量少，而且通常处于抑制状态，杀伤异常细胞的活性低下。更进一步地，所述hank细胞的获得包括利用膜嵌合活性因子体外扩增活化来自体内的nk细胞。进一步地，所述膜嵌合活性因子选自细胞本身在其表面天然表达的细胞因子、通过基因工程方法获得的细胞因子、细胞表面吸附或交联的细胞因子中的一种或多种。进一步地，用于制备膜嵌合活性因子的细胞选自原代细胞或传代细胞。更进一步地，获得所述hank细胞，包括：从血液中分离出单核细胞，所述单核细胞包含nk细胞；或者利用hank细胞体外培养试剂盒，扩增活化所述nk细胞，获得所述hank细胞。进一步地，所述nk细胞至少包含80％以上的所述hank细胞。更进一步地，所述nk细胞至少包含80％的所述hank细胞。进一步地，本发明对于用来扩增活化的nk细胞的个体来源不作限制。根据本发明的一个实施例，所述hank细胞是通过体外活化至少以下一种来自体内的nk细胞获得的：所述患者自身的nk细胞、所述患者的半相合的nk细胞和无关异体的nk细胞。所称的患者的半相合nk细胞指来自患者亲属的nk细胞。例如，采集患者自身的外周血nk细胞，最好是在常规治疗前；采集患者亲属的，即半相合的外周血单核细胞或者无关个体的外周血单核细胞或脐带血单核细胞则不受治疗此限制，只要输血传染病血筛检测合格而且供体没有遗传病就可以。本发明进一步提供一种上述干细胞组合物制备抗衰老药物中的应用。本发明的有益效果为(1)用本发明将hank细胞和干细胞联合使用，制备得到一种干细胞组合物，能够使nk细胞和干细胞的疗效互相增强，具体表现包括：hank细胞在体内随时发现并清除衰老死亡及癌变的细胞，使机体的微环境处于安全并清洁的状态；虽然在hank细胞清除衰老死亡的细胞后机体可以通过自身的再生功能修复衰老及死亡的器官，但那毕竟是一个比较漫长的过程。特别是对那些处于严重衰老状态的患者来说，这时给予干细胞，让输入的干细胞发挥再生及修复作用，将会加快机体康复，进一步延缓衰老进程。因此，虽然单独hank细胞或干细胞都有保健及抗衰老功能，但二者联合使用将产生更好的效果。(2)本发明选择hcbsc、hhc-msc、hadsc三种干细胞与hank细胞联合使用，一方面，hank细胞，非普通的体内nk细胞。普通的nk细胞不但数量少，而且通常处于抑制状态，杀伤异常细胞(癌细胞或病毒感染细胞)的活性低下；另一方面，干细胞的选择也很重要，hbmscs与hank细胞联用的效果仅相当于huc-msc或hadsc单独使用的效果。(3)干细胞与hank细胞组成的组合物，在使用时，需先给予hank细胞，再给予干细胞，二者间隔2周-6个月，当hank细胞充分发现并清除衰老死亡或癌变的细胞之后，再给予干细胞，加速修复受损器官，显著提高抗衰老疗效。具体实施方式实施例1制备hank细胞使用深圳市汉科生物工程有限公司的hank细胞体外培养试剂盒制备hank细胞，基本操作步骤如下：(1)采集健康人外周抗凝血，用淋巴细胞分离液分离pbmc；(2)在添加了il-2及膜嵌合活性因子复合物和x-vivo15无血清培养液中培养pbmc，可以使其中的nk细胞大量扩增活化；(3)培养14天左右时即可使用。这种在体外扩增活化的nk细胞就是hank细胞，细胞数量达100亿左右，nk细胞纯度在80％以上，对k562靶细胞(效靶比例10:1)杀伤率大于80％。可以新鲜使用，也可以在液氮中冻存备用。实施例2：制备脐带血干细胞(hcbsc)(1)脐带血采集及分离单核细胞：用脐血采集袋采集脐血约100ml，其中包括20ml的抗凝剂，用75％的酒精对脐血采集袋进行消毒后将采集袋放入生物安全柜中，将脐血分装到4个50ml提前各加入15ml淋巴细胞分离液的离心管中，2000rpm离心20min，离心结束后，轻轻拿出离心管，此时离心管分为四层，从下向上分别是：红细胞层、分离液层、单核细胞层、血浆层；将单核细胞层收集到2个50ml离心管中，然后加满生理盐水，1600rpm离心10min，弃上请；将沉淀细胞混匀后再加满生理盐水，1200rpm离心10min，用1ml培养基重悬细胞，将2个离心管的细胞悬液混合到1个管中，计数，调整细胞浓度为5×106/ml。(2)起始培养：将细胞接种到t75培养瓶中，每瓶接种10ml细胞悬液，第4天半量换液，以后每3天换液一次，显微镜下观察细胞贴壁及生长情况。(3)细胞传代：待细胞长至70％融合度时传代，弃上清液，用生理盐水清洗1次，再用0.05％胰酶消化细胞3min，终止消化后收集细胞悬液于50ml离心管中，1300rpm离心6min，收集细胞，将细胞用5ml培养基重悬，取100ul细胞悬液，计数，将细胞浓度调整至4×104/ml，将细胞重新接种在t75培养瓶中继续放入培养箱中培养，直至细胞传至第3代，即可进行干细胞制剂制备。实施例3：制备人源脐带间充质干细胞(huc-msc)(1)脐带取自足月剖宫产健康孕妇，并且孕妇hbv抗原、抗hcv抗体、抗hiv抗体、抗梅毒螺旋体抗体、支原体、抗巨细胞病毒抗体等检测均阴性，孕妇孕期各项检查包括torch，唐氏筛查等均正常；(2)无菌条件下采集脐带，把脐带剪成小段，每段约1cm，抽去动静脉(动脉两条，静脉1条)，在玻璃瓶中剪碎，装在15ml离心管中(每管装2小节，约2cm)，加胶原酶消化(iv型)8ml，消化3h后用100目过滤网过滤(或500rpm离心3-5分钟)，弃去未消化组织块，将上清液移至15ml离心管，每管约5ml，加pbs至10ml，高速离心(3000-4000rpm)，弃去上清，取沉淀移至培养皿中培养，置37℃，5％co2饱和湿度孵箱内孵育，48h半量换液，4d后全量换液，弃去大量的悬浮细胞；(3)以后每3-4d根据培养基颜色换液。待原代细胞达到覆盖培养皿的60-80％后，给予1：2传代。(4)脐带间充质干细胞的鉴定及使用标准：采用第3-10代细胞，当细胞数量达到108时，用pbs冲洗2次后，滴加0.05％的ttypsin-edta液消化，后加培养基终止消化，制成1-3×106的细胞悬液，用流式细胞仪进行检测显示：cd14或cd11b、cd79a或cd19、cd34、cd45、cd109、hla-dr阴性<2％；cd29、cd44、cd73、cd90、cd105阳性率均>95％。eb病毒、巨细胞病毒、hiv病毒、乙肝病毒、支原体、细菌培养、真菌培养均阴性。(5)直接使用，或液氮保存备用。实施例4制备人源脂肪间充质干细胞(hadsc)(1)37℃预热500ml以上的pbs；(2)在生物安全柜中打开吸有脂肪的外科容器；(3)把脂肪转入培养瓶，每t225培养瓶约35ml组织；(4)向每个培养瓶加入等量预热的pbs；摇晃培养瓶，洗脂肪组织，放置3-5分钟，分层后吸出下层液体；如此重复3-4次；(5)加入等体积预热的胶原酶溶液，拧紧培养瓶盖，在37℃水浴摇床上75rpm孵育60分钟，或直至脂肪组织均匀分开；(6)分离svf；300g室温离心5分钟，用力摇晃，完全悬浮沉淀并混匀细胞，使干细胞从脂肪上彻底分开。重复离心一次。(7)svf在管底形成沉淀，沉淀上往往有一层深红色细胞。细心地除去上层的油和脂肪，原代脂肪细胞(一层黄色的漂浮细胞)，以及再下面的一层胶原酶液。注意在沉淀上方保留少量的胶原酶液，以保证不会破坏沉淀。(8)把沉淀悬浮在10ml预热的含有1％bsa的pbs中，转入50ml离心管，300g室温离心5分钟。吸出上清含有胶原酶的液体，注意吸头从液体顶部吸，尽量吸掉油性成分。细胞沉淀在管底，用10ml干细胞液悬浮细胞，合并在1个50ml离心管中，300g室温离心5分钟。(9)吸去上清液，用10ml干细胞液悬浮细胞。按每35ml脂肪组织用一个t225培养瓶的比例，选择培养瓶的个数；把10ml干细胞悬液平均分至几个朋友瓶中，补足干细胞培养液至35-40ml。(10)培养48小时，去除培养液，用预热的pbs洗涤，加40ml干细胞培养液。大约每2-3天换液，直至细胞80-90％满。(11)用胰酶/edta消化细胞，获得的细胞可以继续传代，直接使用或液氮冻存。对比例1制备人骨髓间质干细胞(hbmscs)(1)人血液采集：对准髂后上棘骨髓进行穿刺，采集20-30岁健康志愿者的骨髓20ml；(2)采用ficoll密度梯度离心法，于20℃、以445×g的速度离心步骤(1)采集的血液30min，分离骨髓中的有核细胞，通过对人骨髓间充质干细胞(bmscs)在培养皿的附壁特性进行筛选、培养及纯化，其中，培养液中含有dmem培养基，培养液中还含体积分数为10％的胎牛血清、2u/l青霉素和2u/l链霉素；在37℃、5％co2的条件下培养48h后，更换培养液并去除悬浮细胞，并在以后每3-4天进行一次相似操作；(3)细胞融合度达到80％时，进行细胞传代：用pbs洗涤细胞，再用胰酶消化，当贴壁细胞变为游离时，终止消化，离心后弃去上清；用pbs洗涤一次后，将细胞接种于培养液中，在37℃，5％co2的条件下进行传代培养，当细胞扩增进入第3代时，使用质量分数为0.25％的胰蛋白酶和1mmol/ledta进行消化，最后混悬于含有dmem培养基并含有体积分数为10％胎牛血清的培养液中，得到人骨髓间充质干细胞。实施例5建立自然衰老动物模型及动物试验5.1建立自然衰老动物模型balbc小鼠，90只，雌性，10月龄，体重25±5g。实验开始前进行7天适应性喂养，并检疫观察合格后进行实验。所有小鼠按标准饲喂管理，不采取其他措施，建立小鼠自然衰老的动物模型。动物管理标准如下：动物房：spf级，严格按照国标进行管理。动物饲料：高压辐照灭菌。动物饮水：双蒸纯净水(独立净水系统)。动物垫料：高温高压灭菌木屑。进入动物房更换专用实验服，所有进入动物房的物品均高温高压灭菌(特殊器械及药品除外)。5.2动物分组及给药表1、动物分组与给药表将balbc小鼠随机分组，每组18只。每月定期分别对各组小鼠尾静脉注射hank细胞，人源的间充质干细胞、或医用生理盐水。注射用的各组干细胞分别源于同一批次，培养至p3代后-180℃液氮保存。各类细胞在每次使用前从液氮中取出，分别加入医用生理盐水洗涤，离心(1000rmp/min，10min)，弃上清后重复洗涤一次，取样计数后，调节细胞密度至1.5×106/ml，每只小鼠每次尾静脉注射0.2ml细胞液。以生理盐水为阴性对照，每只小鼠注射0.2ml。持续观察和记录小鼠生存状态，每日查看小鼠存活情况，每月底统计各组小鼠的存活数。表2各组小鼠23月时存活情况由表2可以看出，hank细胞、hcbsc、huc-msc、及hadsc单独使用都有疗效，hank细胞疗效略好，hcbsc和huc-msc相当，比hadsc的疗效略好(分别为83.3％和77.8％)，hank细胞与hbcsc或huc-msc干细胞的疗效最好。而采用其他干细胞，如hbmscs与hank细胞联合治疗，其疗效则大幅降低，仅为44.4％，另一方面，第9组中hank和hcbsc联合治疗，采用hank注射1周后，hcbsc立即给药的方式，其治疗效果也显著降低，仅为61.1％。另外，从小鼠的生存状态上看，13月龄后，各组小鼠逐渐呈现不同程度的衰老迹象，如消瘦、弓背、颤抖、反应迟钝、眼周病变等，18月龄后衰老的现象非常明显。从整体上看，hank细胞和hcbsc及huc-msc组的小鼠表现出的精神状态最佳，hadsc组的相对较好，hank细胞联合hcbsc或huc-msc的疗效最好，hcbsc与huc-msc的疗效相当。根据小鼠的整体死亡率和精神状态，可认为hcbsc、huc-msc、hadsc与hank细胞联合应用对小鼠抗衰老作用比较明显。hank细胞与hcbsc或huc-msc联合应用的疗效最好。5.4生化指标检测小鼠23月龄时，通过尾部取血和眼眶取血相结合的方法，每只小鼠共取得1-2ml全血，另外从小于6月龄的balbc小鼠中取血作为对照。得到的全血按3000rmp/min离心10min，上清液即为血清，转移血清到新的离心管中。按照试剂盒说明书，检测血清中各类抗氧化物含量的变化。5.4.1血清中总超氧化物歧化酶(t-sod)的测定自由基是机体氧化反应中产生的有害化合物，具有强氧化性，可损害机体的组织和细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应。与衰老发生机制相关的自由基，主要是超氧自由基(o2-)、羟自由基(-oh)和类脂质过氧化自由基。sod即超氧化物歧化酶，是体内重要的抗氧化酶之一，能够催化超氧化物(o2-)通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢，保护机体细胞和组织免受自由基的损害，延缓机体衰老过程。检测方法按照试剂盒说明书操作，每毫升反应液中sod抑制率达到50％时所对应的sod量为一个sod活力单位(u)。sod活性(u/ml)＝(对照管od值－测定管od值)/对照管od值÷50％×反应体系稀释倍数×样品测试前稀释倍数。表3超氧化物歧化酶含量检测结果组号分组超氧化物歧化酶含量(u/ml)1hank细胞132.72##2hcbsc130.32##3huc-msc128.42##4hadsc130.51##5hank+hcbsc142.52##6hank+huc-msc144.57##7hank+hadsc139.47##8hank+hbmscs129.33##9hank+hcbsc(1:2)136.37##10生理盐水对照90.87*11正常对照组113.24注：与正常对照组相比，*p<0.05；与生理盐水对照相比，##p<0.01。5.4.2丙二醛(mda)测定机体通过酶系统与非酶系统产生氧化自由基，氧自由基不但通过生物膜中多不饱和脂肪酸的过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤。mda是自由基引起的脂质过氧化过程中生成的一种醛类物质，测试mda的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。血清中mda含量检测根据试剂盒说明书方法进行检测，组织中mda含量(nmol/mgpro)＝(测定管吸光度－测定空白管吸光度)/(标准管吸光度－标准空白管吸光度)×标准品浓度÷待测样本蛋白浓度注：nmol/mgpro为纳摩尔/毫克蛋白。表4mda含量检测结果组号分组超氧化物歧化酶含量(nmol/mgpro)1hank细胞9.57#2hcbsc9.35#3huc-msc9.24#4hadsc9.15#5hank+hcbsc7.44##6hank+huc-msc7.72##7hank+hadsc7.12##8hank+hbmscs9.02#9hank+hcbsc(1:2)8.89#10生理盐水对照14.30**11正常对照组6.64注：与正常对照组相比，**p<0.01；与生理盐水对照相比，#p<0.05，##p<0.01。5.4.3还原型谷胱甘肽(gsh)测定还原型谷胱甘肽(gsh)是体内最重要的非酶性抗氧化物，是一种低分子清除剂，广泛存在于正常细胞中，它有很强的亲和力，可直接使自由基还原为容易代谢的酸类物质，加速自由基的排泄，从而减轻自由基对重要脏器的损害。gsh还是许多酶反应的辅基，能保护体内重要酶蛋白巯基不被氧化、灭活，有利于酶活性的发挥。因此，gsh是机体组织和细胞内的主要代谢调节物质，gsh量的多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素。检测血清中gsh，根据试剂盒说明进行。表5gsh含量检测结果组号分组超氧化物歧化酶含量(umol/ml)1hank细胞49.16##2hcbsc50.88##3huc-msc51.24##4hadsc52.11##5hank+hcbsc56.42##6hank+huc-msc58.13##7hank+hadsc57.33##8hank+hbmscs52.37#9hank+hcbsc(1:2)53.33#10生理盐水对照24.09*11正常对照组68.97注：与正常对照组相比，*p<0.05；与生理盐水对照相比，##p<0.01。通过以上实验结果可以看出，hank细胞、脐带血干细胞、脐带和脂肪来源的间充质干细胞能对抗自然衰老，使衰老小鼠体内sod酶活性和ghs含量提高，mda水平下降，并且使小鼠整体生存率提高。因而推测hank细胞和干细胞可能通过提高sod和ghs活性，增强其对自由基的清除能力，抑制脂质过氧化，降低mda含量，从而减轻对机体组织的损伤，在一定程度上延缓衰老，起到抗氧化的功效。另外，我们也观察到在小鼠22月龄之前，hank细胞和脐带血干细胞或脐带来源间充质干细胞对小鼠生存率的提高效果，明显优于脂肪来源的间充质干细胞；hank细胞联合脐带血干细胞或脐带间充质干细胞安全性更高，抗衰老效果更好。上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。当前第1页12