本发明涉及组织工程关节软骨损伤修复治疗领域，具体来说是一种基质诱导的自体骨髓间充质干细胞复合支架的制备方法。
背景技术：
关节软骨损伤在临床上是一种常见的疾病，临床表现为关节疼痛，负重、运动则加重，限制了患处关节的活动,多发病于运动员、年老者,由于关节软骨是透明软骨，缺乏血管、淋巴、神经营养等，因此很难自我修复,一旦发病，则往往发展为骨性关节炎，重者需要人工关节置换。
这一疾病的治疗以前有过多种治疗手段，包括清创术、骨髓刺激术（如微骨折术、软骨下骨钻孔术等）、自体或异体软骨膜和骨膜移植术、骨软骨移植术、关节软骨移植术等,但这些技术修复组织多以纤维软骨为主、缺乏正常透明软骨的力学性能及耐用性，同时也常常会出现一些并发症如修复后过度生长、骨膜增生、关节肥大、损坏正常组织、疾病传染等。
随着自体软骨细胞移植技术（autologouschondrocyteimplantation,aci）的成熟，软骨损伤修复治疗逐渐进入组织工程修复领域,第一代aci技术多采用自体骨膜瓣，易形成骨膜肥大，骨膜增生伸入关节腔往往需要二次手术切除,移植的骨膜也使软骨下骨密度增加，导致新生软骨组织退化，移植的骨膜生成的透明软骨样组织的生物力学性能、耐磨持久性不佳，易蜕变，整个手术过程操作复杂，费用高昂。
第二代细胞疗法采用一种可吸收的支架替代自体骨膜，减少了对健康组织的损害,但其仍需两次手术，仍需缝合，技术相对复杂，细胞分布不均衡，存在细胞流失的风险。
第三代的细胞疗法则对以上技术进一步优化，将自体软骨细胞移植入一种可吸收的膜支架，并继续培养一些天，可使细胞均匀分布于胶原膜中,然后将这一细胞胶原膜植入软骨损伤处进行修复，被称为基质诱导的自体软骨细胞移植技术（matrix-inducedautologouschondrocyteimplantation(maci)）,这一技术术后恢复时间短，操作简便、创伤小、修复面积达，可达20cm2，术后产生更多的透明软骨,治疗效果较为理想,这也避免了之前技术所引起的并发症。然而maci技术仍然需要采集患者自体软骨细胞，损坏正常软骨组织，仍需二次手术，增加了患者痛苦，同时治疗费用昂贵。
另一方面，随着组织工程技术的发展，干细胞技术日益成熟，其在医学上应用也越来越被关注。由于干细胞具有组织全能性，能分化成各种组织细胞，尤其是可分化成软骨细胞，这使其在临床上应用于修复软骨损伤成为可能。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术中的检测精确度差、灵敏度不足的缺陷，提供一种基质诱导的自体骨髓间充质干细胞复合支架的制备方法来解决上述问题。
本发明公开了一种基质诱导的自体骨髓间充质干细胞复合支架的制备方法，具体步骤为：
（1）、在无菌条件下，使用20ml的注射器，将1ml肝素钠生理盐水抽吸入注射器内，然后继续使用注射器抽入骨髓9ml，去掉针头后，将肝素钠生理盐水和骨髓加入含10mldmem高糖培养基的培养瓶中，混合均匀后，得到骨髓悬液；
（2）、在无菌条件下，取患者外周血100-200ml，置于血袋中，密封；
（3）、将患者的外周血分装于50ml离心管中，每管45ml,在3000rpm的条件下，离心30min，取上清，在3000rpm的条件下，将上清离心30min，去沉淀，经0.22μm孔径过滤除菌，得到自体血清，分装待用；
（4）、将骨髓悬液沿管壁缓慢加入含20ml细胞分离液的离心管中，在2000rpm的条件下，离心20min，然后吸取中间白膜层，然后向白膜层内加入50mlpbs，并吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，再加入50mlpbs吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，得到的沉淀即为目的细胞；
（5）、向dmem高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，dmem高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，dmem高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40u/ml，然后取15ml含自体血清和硫酸庆大霉素的dmem高糖培养基加入到目的细胞内，然后将细胞吹打均匀，并计数，以5×105/cm2接种于t25细胞培养瓶中，置于37℃，5%的co2培养箱中培养，以后每三天更换一次dmem高糖培养基,该dmem高糖培养基也含10%自体血清和40u/ml硫酸庆大霉素；
（6）、细胞贴壁达到80%以上后，吸干培养液，用pbs液轻洗细胞两次；
（7）、向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的质量浓度为0.01%，直至覆盖所有细胞为止，置于37℃，5%的co2温箱2-3min后，倒置在显微镜下，观察到细胞回缩、细胞间隙增大时，再向培养瓶里滴入5ml高糖dmem培养基终止消化；
（8）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞从瓶壁上脱落，再将细胞悬液转移到50ml离心管内，再加入45ml高糖dmem培养基，离心7min，去上清后，重复上述步骤两次，即得到清洗后的沉淀；
（9）、向dmem高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，dmem高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，dmem高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40u/ml，然后取含自体血清、硫酸庆大霉素的高糖dmem培养基调节细胞浓度为1×108/l，将细胞接种于75cm2细胞培养瓶内继续培养；
（10）、细胞培养3-4周后，细胞传代3次；
（11）、吸干培养液，向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的质量浓度为0.01%，直至覆盖所有细胞为止，置于温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大时，再向培养瓶里滴入高糖dmem培养基终止消化；
（12）、将细胞悬液离心7min，弃上清，再用pbs洗涤细胞3次；
（13）、细胞计数，向dmem高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，dmem高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，dmem高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40u/ml，然后用含自体血清、硫酸庆大霉素的高糖dmem培养基重悬细胞，调整细胞浓度为5×106/ml；
（14）、向dmem高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，dmem高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，dmem高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40u/ml，取一个无菌猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜，糙面朝上，光面朝下放置于无菌塑料培养皿中，然后用含自体血清、硫酸庆大霉素的高糖dmem培养基浸泡过夜；
（15）、将步骤（13）制备得到的细胞悬液滴入准备好的猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜上，细胞数约1×106/cm2，继续培养3天，即可。
作为优选，所述的步骤（1）中，所述的肝素钠生理盐水的浓度为1200u/ml。
作为优选，所述的步骤（1）中，所述的dmem高糖培养基中含有40u/ml的硫酸庆大霉素。
作为优选，所述的步骤（8）和步骤（12）中，离心转速为1200rpm。
所述的步骤（7）、（11）中，胰蛋白酶-edta溶液购自北京雷根生物技术有限公司。
本发明相比现有技术具有以下优点：
1、移植当天，用生理盐水对步骤（15）得到的基质诱导的自体骨髓间充质干细胞复合支架冲洗3次，根据软骨损伤处的形状修剪猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜，然后使糙面朝向关节软骨缺损处，光面朝向关节腔，固定于软骨缺损处，以修复软骨损伤，本发明采用了一种猪腹膜源的ⅰ/ⅲ型胶原双分子层膜结构，其一面具有相对较高密度的胶原纤维，表面摩擦较低，细胞不通透，可阻止细胞向关节腔扩散，另一面为粗糙的表面，上面空隙较大，有利于软骨细胞附着其中，这种膜具有持久性、耐撕裂，其可承受切割、打孔、缝合等操作，其具有弹性，可修成不同形状，不会随着时间的推移而收缩。其具有可吸收性，移植2周后可被降解吸收，可作为极佳的组织工程支架材料；
2、采用自体骨髓间充质干细胞（bonemarrow–derivedmesenchymal
stemcells，bmsc)作为种子细胞，其来源充足，通过简单的骨髓穿刺就可取材，不存在组织配型及免疫排斥反应，体外培养性能稳定，易于传代扩增，可克服体内软骨细胞作为种子细胞来源有限、体外扩增易导致种子细胞老化及生物学功能衰退的缺点,同时也减少了患者手术次数，降低治疗费用；
3、使用自体血清，避免了使用胎牛血清可能引起的免疫原性反应及疾病感染；
4、本技术采用硫酸庆大霉素作为抑菌剂，其浓度为40u/ml，对多种革兰阴性菌及阳性菌都具有抑菌和杀菌作用，可替代目前使用的青霉素和链霉素；
5、本发明可用于治疗3-20cm2的软骨损伤面积，修复面大,精确度高，灵敏度好。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明公开了一种基质诱导的自体骨髓间充质干细胞复合支架的制备方法，具体步骤为：
（1）、在无菌条件下，使用20ml的注射器，将1ml肝素钠生理盐水抽吸入注射器内，然后继续使用注射器抽入骨髓9ml，去掉针头后，将肝素钠生理盐水和骨髓加入含10mldmem高糖培养基的培养瓶中，混合均匀后，得到骨髓悬液；
（2）、在无菌条件下，取患者外周血100-200ml，置于血袋中，密封；
（3）、将患者的外周血分装于50ml离心管中，每管45ml,在3000rpm的条件下，离心30min，取上清，在3000rpm的条件下，将上清离心30min，去沉淀，经0.22μm孔径过滤除菌，得到自体血清，分装待用；
（4）、将骨髓悬液沿管壁缓慢加入含20ml细胞分离液的离心管中，在2000rpm的条件下，离心20min，然后吸取中间白膜层，然后向白膜层内加入50mlpbs，并吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，再加入50mlpbs吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，得到的沉淀即为目的细胞；
（5）、向dmem高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，dmem高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，dmem高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40u/ml，然后取15ml含自体血清和硫酸庆大霉素的dmem高糖培养基加入到目的细胞内，然后将细胞吹打均匀，并计数，以5×105/cm2接种于t25细胞培养瓶中，置于37℃，5%的co2培养箱中培养，以后每三天更换一次dmem高糖培养基，该dmem高糖培养基也含10%自体血清和40u/ml硫酸庆大霉素；
（6）、细胞贴壁达到80%以上后，吸干培养液，用pbs液轻洗细胞两次；
（7）、向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的质量浓度为0.01%，直至覆盖所有细胞为止，置于37℃，5%的co2温箱2-3min后，倒置在显微镜下，观察到细胞回缩、细胞间隙增大时，再向培养瓶里滴入5ml高糖dmem培养基终止消化；
（8）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞从瓶壁上脱落，再将细胞悬液转移到50ml离心管内，再加入45ml高糖dmem培养基，离心7min，去上清后，重复上述步骤两次，即得到清洗后的沉淀；
（9）、向dmem高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，dmem高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，dmem高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40u/ml，然后取含自体血清、硫酸庆大霉素的高糖dmem培养基调节细胞浓度为1×108/l，将细胞接种于75cm2细胞培养瓶内继续培养；
（10）、细胞培养3-4周后，细胞传代3次；
（11）、吸干培养液，向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的质量浓度为0.01%，直至覆盖所有细胞为止，置于温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大时，再向培养瓶里滴入高糖dmem培养基终止消化；
（12）、将细胞悬液离心7min，弃上清，再用pbs洗涤细胞3次；
（13）、细胞计数，向dmem高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，dmem高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，dmem高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40u/ml，然后用含自体血清、硫酸庆大霉素的高糖dmem培养基重悬细胞，调整细胞浓度为5×106/ml；
（14）、向dmem高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，dmem高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，dmem高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40u/ml，取一个无菌猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜，糙面朝上，光面朝下放置于无菌塑料培养皿中，然后用含自体血清、硫酸庆大霉素的高糖dmem培养基浸泡过夜；
（15）、将步骤（13）制备得到的细胞悬液滴入准备好的猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜上，细胞数约1×106/cm2，继续培养3天，即可。
作为优选，所述的步骤（1）中，所述的肝素钠生理盐水的浓度为1200u/ml。
作为优选，所述的步骤（1）中，所述的dmem高糖培养基中含有40u/ml的硫酸庆大霉素。
作为优选，所述的步骤（8）和步骤（12）中，离心转速为1200rpm，这样可以防止细胞被损坏。
所述的步骤（7）、（11）中，胰蛋白酶-edta溶液购自北京雷根生物技术有限公司。
实施例1
本发明公开了一种基质诱导的自体骨髓间充质干细胞复合支架的制备方法，具体步骤为：
（1）、在无菌条件下，使用20ml的注射器，将1ml肝素钠生理盐水抽吸入注射器内，然后继续使用注射器抽入骨髓9ml，去掉针头后，将肝素钠生理盐水和骨髓加入含10mldmem高糖培养基的培养瓶中，混合均匀后，得到骨髓悬液；
（2）、在无菌条件下，取患者外周血150ml，置于血袋中，密封；
（3）、将患者的外周血分装于50ml离心管中，每管45ml,在3000rpm的条件下，离心30min，取上清，在3000rpm的条件下，将上清离心30min，去沉淀，经0.22μm孔径过滤除菌，得到自体血清，分装待用；
（4）、将骨髓悬液沿管壁缓慢加入含20ml细胞分离液的离心管中，在2000rpm的条件下，离心20min，然后吸取中间白膜层，然后向白膜层内加入50mlpbs，并吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，再加入50mlpbs吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，得到的沉淀即为目的细胞；
（5）、向dmem高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，dmem高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，dmem高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40u/ml，然后取15ml含自体血清和硫酸庆大霉素的dmem高糖培养基加入到目的细胞内，然后将细胞吹打均匀，并计数，以5×105/cm2接种于t25细胞培养瓶中，置于37℃，5%的co2培养箱中培养，以后每三天更换一次dmem高糖培养基，该dmem高糖培养基也含10%自体血清和40u/ml硫酸庆大霉素；
（6）、细胞贴壁达到80%以上后，吸干培养液，用pbs液轻洗细胞两次；
（7）、向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的质量浓度为0.01%，直至覆盖所有细胞为止，置于37℃，5%的co2温箱2-3min后，倒置在显微镜下，观察到细胞回缩、细胞间隙增大时，再向培养瓶里滴入5ml高糖dmem培养基终止消化；
（8）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞从瓶壁上脱落，再将细胞悬液转移到50ml离心管内，再加入45ml高糖dmem培养基，离心7min，去上清后，重复上述步骤两次，即得到清洗后的沉淀；
（9）、向dmem高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，dmem高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，dmem高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40u/ml，然后取含自体血清、硫酸庆大霉素的高糖dmem培养基调节细胞浓度为1×108/l，将细胞接种于75cm2细胞培养瓶内继续培养；
（10）、细胞培养3周后，细胞传代3次；
（11）、吸干培养液，向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的质量浓度为0.01%，直至覆盖所有细胞为止，置于温箱2min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大时，再向培养瓶里滴入高糖dmem培养基终止消化；
（12）、将细胞悬液离心7min，弃上清，再用pbs洗涤细胞3次；
（13）、细胞计数，向dmem高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，dmem高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，dmem高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40u/ml，然后用含自体血清、硫酸庆大霉素的高糖dmem培养基重悬细胞，调整细胞浓度为5×106/ml；
（14）、向dmem高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，dmem高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，dmem高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40u/ml，取合适大小的无菌猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜，糙面朝上，光面朝下放置于无菌塑料培养皿中，然后用含自体血清、硫酸庆大霉素的高糖dmem培养基浸泡过夜；
（15）、将步骤（13）制备得到的细胞悬液滴入准备好的猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜上，细胞数约1×106/cm2，继续培养3天，即可。
作为优选，所述的步骤（1）中，所述的肝素钠生理盐水的浓度为1200u/ml。
作为优选，所述的步骤（1）中，所述的dmem高糖培养基中含有40u/ml的硫酸庆大霉素。
作为优选，所述的步骤（8）和步骤（12）中，离心转速为1200rpm。
所述的步骤（7）、（11）中，胰蛋白酶-edta溶液购自北京雷根生物技术有限公司。
实施例2
本发明公开了一种基质诱导的自体骨髓间充质干细胞复合支架的制备方法，具体步骤为：
（1）、在无菌条件下，使用20ml的注射器，将1ml肝素钠生理盐水抽吸入注射器内，然后继续使用注射器抽入骨髓9ml，去掉针头后，将肝素钠生理盐水和骨髓加入含10mldmem高糖培养基的培养瓶中，混合均匀后，得到骨髓悬液；
（2）、在无菌条件下，取患者外周血150ml，置于血袋中，密封；
（3）、将患者的外周血分装于50ml离心管中，每管45ml,在3000rpm的条件下，离心30min，取上清，在3000rpm的条件下，将上清离心30min，去沉淀，经0.22μm孔径过滤除菌，得到自体血清，分装待用；
（4）、将骨髓悬液沿管壁缓慢加入含20ml细胞分离液的离心管中，在2000rpm的条件下，离心20min，然后吸取中间白膜层，然后向白膜层内加入50mlpbs，并吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，再加入50mlpbs吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，得到的沉淀即为目的细胞；
（5）、向dmem高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，dmem高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，dmem高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40u/ml，然后取15ml含自体血清和硫酸庆大霉素的dmem高糖培养基加入到目的细胞内，然后将细胞吹打均匀，并计数，以5×105/cm2接种于t25细胞培养瓶中，置于37℃，5%的co2培养箱中培养，以后每三天更换一次dmem高糖培养基，该dmem高糖培养基也含10%自体血清和40u/ml硫酸庆大霉素；
（6）、细胞贴壁达到80%以上后，吸干培养液，用pbs液轻洗细胞两次；
（7）、向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的质量浓度为0.01%，直至覆盖所有细胞为止，置于37℃，5%的co2温箱3min后，倒置在显微镜下，观察到细胞回缩、细胞间隙增大时，再向培养瓶里滴入5ml高糖dmem培养基终止消化；
（8）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞从瓶壁上脱落，再将细胞悬液转移到50ml离心管内，再加入45ml高糖dmem培养基，离心7min，去上清后，重复上述步骤两次，即得到清洗后的沉淀；
（9）、向dmem高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，dmem高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，dmem高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40u/ml，然后取含自体血清、硫酸庆大霉素的高糖dmem培养基调节细胞浓度为1×108/l，将细胞接种于75cm2细胞培养瓶内继续培养；
（10）、细胞培养4周后，细胞传代3次；
（11）、吸干培养液，培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的质量浓度为0.01%，直至覆盖所有细胞为止，置于温箱3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大时，再向培养瓶里滴入高糖dmem培养基终止消化；
（12）、将细胞悬液离心7min，弃上清，再用pbs洗涤细胞3次；
（13）、细胞计数，向dmem高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，dmem高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，dmem高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40u/ml，然后用含自体血清、硫酸庆大霉素的高糖dmem培养基重悬细胞，调整细胞浓度为5×106/ml；
（14）、向dmem高糖培养基内加入自体血清和硫酸庆大霉素，dmem高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，dmem高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40u/ml，取合适大小的无菌猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜，糙面朝上，光面朝下放置于无菌塑料培养皿中，然后用含自体血清、硫酸庆大霉素的高糖dmem培养基浸泡过夜；
（15）、将步骤（13）制备得到的细胞悬液滴入准备好的猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜上，细胞数约1×106/cm2，继续培养3天，即可。
所述的步骤（1）中，所述的肝素钠生理盐水的浓度为1200u/ml。
所述的步骤（1）中，所述的dmem高糖培养基中含有40u/ml的硫酸庆大霉素。
作为优选，所述的步骤（8）和步骤（12）中，离心转速为1200rpm。
所述的步骤（7）、（11）中，胰蛋白酶-edta溶液购自北京雷根生物技术有限公司。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。