一种具有加热、化疗和显像功能的新型纳米载药系统制备方法及其使用方法与流程

本发明属于生物医学工程和纳米医学领域，特别涉及一种具有加热、化疗和显像功能的新型纳米载药系统制备方法及其使用方法。

背景技术

原发性中枢神经系统淋巴瘤(pcnsl)是一种罕见的肿瘤，占所有非霍奇金淋巴瘤病例的2-4％，并且随着年龄的增长，发病率也逐渐增高。它是一种侵袭性淋巴瘤，其中90％-95％为弥漫性大b细胞淋巴瘤，定位于中枢神经系统：脑，脑膜，脑脊液，脊髓和眼睛等部位。目前，pcnsl的主要治疗方法为大剂量甲氨蝶呤(mtx)或以mtx为基础的联合化疗，并根据患者具体情况采用全脑放疗或局部照射治疗。放疗不能延长患者的生存期，仅适用于体能状态良好的患者，且会带来不可逆的认知功能障碍。因此hd-mtx(3-8g/m²)静脉化疗仍然是目前治疗pcnsl最有效的方法。由于现有治疗方法的局限性且会导致严重的治疗相关毒性及不良反应，所以亟待一种新型治疗方法的出现。

技术实现要素：

技术问题：为了解决现有技术的缺陷，本发明提供了一种具有加热、化疗和显像功能的新型纳米载药系统制备方法及其使用方法。

技术方案：本发明提供了一种具有加热、化疗和显像功能的新型纳米载药系统制备方法，包括以下步骤：

步骤1：按fe²⁺：fe³⁺摩尔浓度比在0.4-0.8之间的比例混合fecl3和feso4溶液；

步骤2：然后在n2保护下水浴上述混合溶液，在搅拌的同时向其内加入nh4oh，至反应液的ph在9-10之间；

步骤3：向上述反应后的混合液内逐滴加入1-10g油酸并继续搅拌3-5h后将其水浴恒温进行熟化；

步骤4：待上述反应后的混合液冷却后用强磁铁吸住烧瓶底部，将生成物冲洗干净后，真空干燥备用得到油酸包裹的fe3o4(oa–fe3o4)；

步骤5：将油酸包裹的fe3o4(oa–fe3o4)溶于去氧去离子水中，向其内加入pluronicf127后封闭磁力搅拌过夜，将得到的产物离心后弃去沉淀，得到的上层即为：oa–pluronic稳定的fe3o4胶体溶液；

步骤6：将oa–pluronic稳定的fe3o4溶胶与不同浓度活化的mtx溶液反应过夜，得到载药磁性纳米颗粒，经水洗、磁铁分离，产物冷冻干燥，得到新型纳米载药系统。

作为一种优化方案：步骤1中所述fecl3·6h2o和feso4·7h2o溶液的具体混合方法为：用分析纯的fecl3·6h2o和feso4·7h2o分别溶于去离子水中配制成0.1mol/l-1mol/l的fecl3溶液和feso4溶液，然后按fe²⁺：fe³⁺摩尔浓度比将两种溶液混合。

作为进一步优化方案：步骤2中所述水浴加热温度为60-80℃。

作为进一步优化方案：步骤3中反应液放置5min后再滴加油酸，且该步骤中水浴温度为80℃，恒温时间为30min。

作为进一步优化方案：步骤4中用乙醇和去离子水交替冲洗生成物2-3次。

作为进一步优化方案：步骤5中各药品质量为：称取200-400mg油酸包裹的fe3o4(oa–fe3o4)，溶于50ml-100ml去氧去离子水中，加入50mg-200mgpluronicf127。

作为进一步优化方案：步骤5中离心条件为1000rpm，10℃，20分钟。

作为进一步优化方案：步骤6中取5-50ml的oa–pluronic稳定的fe3o4溶胶，加入不同浓度的活化的mtx溶液,室温孵育24-48h后，将得到的纳米载药颗粒水洗、磁铁分离2-3次。

本发明还包括上述任一方法制得的新型纳米载药系统的使用方法，包括将得到的纳米载药颗粒通过低温间歇灭菌法灭菌后，溶于普通细胞培养液，再将培养液超声分散均匀。

作为一种优化方案：低温间歇灭菌法具体操作步骤为：将溶液加热到60℃保温12小时，然后再将溶液加热到37℃保温10小时；然后将上述所有步骤重复3次。

有益效果：本发明将化疗药物mtx加载到fe3o4磁性纳米载体上，依靠载体的磁靶向性，将复合物富集到肿瘤部位并释放mtx增强化疗的靶向性，提高治疗效率、降低毒性及不良反应；同时利用磁流体在交变磁场中的升温特性，对肿瘤部位进行热疗，进一步促进了治疗的效果。

附图说明

图1为fe3o4@mtx合成过程示意图；

图2为fe3o4@mtx载药量和包封率曲线示意图；

图3为微核试验检测fe3o4空白载体的组织相容性示意图；

图4为cck8检测fe3o4磁性纳米粒子及fe3o4@mtx复合制剂的细胞毒性示意图；

图5为普鲁士蓝染色法检测细胞内铁示意图；

图6为流式细胞仪检测细胞凋亡率对照组示意图；

图7为流式细胞仪检测细胞凋亡率mtx组示意图；

图8为流式细胞仪检测细胞凋亡率fe3o4@mtx组示意图；

图9为qpcr法检测caspase3、bax、bcl–2和dhfr基因转录水平示意图；

图10为westernblotting法检测caspase3、bax、bcl–2和dhfr蛋白表达水平示意图；

图11为tem下观察fe3o4磁性纳米粒子形态示意图；

图12为nta检测fe3o4@mtx复合磁性纳米粒子示意图；

图13为fe3o4@mtx磁滞回线示意图；

图14为不同温度下fe3o4@mtx药物释放曲线示意图；

图15为fe3o4@mtx的热动力学曲线示意图；

图16为水基分散的oa–pluronic稳定的fe3o4胶体溶液4℃不同时间静置后的稳定状态示意图；

图17为成品超顺磁性的表观示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

本发明一种具有加热、化疗和显像功能的新型纳米载药系统制备方法主要包括两大步：水基分散稳定的fe3o4磁性纳米粒子的制备以及fe3o4@mtx复合磁性纳米粒子制备：

水基分散稳定的fe3o4磁性纳米粒子的制备：用分析纯的fecl3·6h2o和feso4·7h2o溶于去离子水中，分别配制成0.1mol/l-1mol/l的fecl3溶液和feso4溶液，按:fe²⁺：fe³⁺摩尔浓度比在0.4至0.8之间，依次加入fecl3溶液和fecl2溶液于烧瓶中，通入n2并搅拌，同时水浴加热使反应液升温至60-80℃，剧烈搅拌下加入nh4oh，溶液中迅速出现黑色沉淀物，至反应液的ph＝9-10，5min后，逐滴加入1-10g油酸继续搅拌3-5h。然后于80℃水浴恒温30min进行熟化，待反应液冷却后用强磁铁吸住烧瓶底部，用乙醇和去离子水交替冲洗2-3次，将生成物真空干燥备用。称取上述200-400mg油酸包裹的fe3o4(oa–fe3o4)，溶于50ml-100ml去氧去离子水中，加入50mg-200mgpluronicf127，封闭磁力搅拌，室温过夜。将产物离心(1000rpm，10℃，20分钟)后，弃沉淀，得到上层oa–pluronic稳定的fe3o4胶体溶液，如图16所示，水基分散的oa–pluronic稳定的fe3o4胶体溶液，4℃静置3d，7d，14d，28d分别观察，均为黑色均一稳定状态；如图17所示，展示其具有良好的超顺磁性。

fe3o4@mtx复合磁性纳米粒子制备：取5-50ml的oa–pluronic稳定的fe3o4溶胶，加入不同浓度的活化的mtx溶液,室温下共同孵育24-48h，使得药物进入油酸层中，如图1所示，载药纳米颗粒水洗、磁铁分离2-3次，以充分洗去多余药物，同时检测载药量和包封率，选取包封效率最高的产物冷冻干燥备用，如图2所示。

本发明一种具有加热、化疗和显像功能的新型纳米载药系统使用方法为：用于细胞培养前，通过低温间歇灭菌法(60℃12小时，37℃，10小时，重复3次)灭菌后，溶于普通细胞培养液，超声分散均匀后使用。

实施例

fe3o4@mtx复合磁性纳米粒子制备：水基分散稳定的fe3o4磁性纳米粒子的制备：称取27g分析纯的fecl3·6h2o和17gfeso4·7h2o溶于100ml去离子水中并加入250ml三颈瓶中，通入n2并搅拌，同时水浴加热使反应液升温至70℃，剧烈搅拌下加入nh4oh，溶液中迅速出现黑色沉淀物，至反应液的ph＝9，5min后，逐滴加入5ml油酸继续搅拌3h。然后升温至80℃水浴恒温30min进行熟化，待反应液冷却后用强磁铁吸住烧瓶底部，用乙醇和去离子水交替冲洗2-3次，将生成物真空干燥备用。称取上述300mg油酸包裹的fe3o4(oa–fe3o4)，溶于50ml去氧去离子水中，加入100mgpluronicf127，封闭磁力搅拌，室温过夜。将产物离心(1000rpm，10℃，20分钟)后，弃沉淀，得到上层oa–pluronic稳定的fe3o4胶体溶液。

fe3o4@mtx复合磁性纳米粒子制备：邻二氮菲法测fe3o4胶体溶液浓度，取1mg/ml的oa–pluronic稳定的fe3o4溶胶10ml，加入15mg/ml的mtx溶液10ml,室温下共同孵育48h，使得药物进入油酸层中，载药纳米颗粒水洗、磁铁分离2-3次，以充分洗去多余药物，产物冷冻干燥备用。fe3o4@mtx复合磁性纳米粒子表征：如图11所示，tem下观察fe3o4磁性纳米粒子，近似圆形，电子密度高，大小较为均一；如图12所示，nta检测fe3o4@mtx复合磁性纳米粒子平均水合直径为113nm，单峰状，粒径分布窄；如图13所示，其磁滞回线接近为重合“s”型曲线，饱和磁化强度(ms)值为50emu/克，矫顽力及剩磁很低，具有良好的超顺磁性。

相关实验验证

fe3o4磁性纳米粒子生物相容性检测实验

如图3所示，微核试验检测fe3o4空白载体的组织相容性，微核试验检测fe3o4空白载体的组织相容性，可以认为该材料无致畸或致突变作用，统计分析显示各实验组与阴性对照组无显著性差异，p<0.05，且组内无差异；cck8检测fe3o4磁性纳米粒子及fe3o4@mtx复合制剂的细胞毒性，如图4所示；同时用普鲁士蓝染色法检测细胞内铁，如图11所示，可见fe3o4磁性纳米粒子可进入胞内作用；fe3o4@mtx纳米载药系统小鼠腹腔注射后的ld50确定为8.579g/kg，其95％ci为6.300-12.333g/kg，具有较宽的安全剂量范围。

fe3o4@mtx复合制剂体外促进人b淋巴瘤细胞株ly18细胞的凋亡作用实验

如图6-8所示，流式细胞仪检测细胞凋亡率，设置对照组，mtx组，fe3o4@mtx组，其中mtx组剂量与fe3o4@mtx组中包载的mtx剂量相同，对照组(图6)、mtx组(图7)、fe3o4@mtx组(图8)；对照组凋亡率为7.21±3.68％，mtx组凋亡率为28.5±0.99％，fe3o4@mtx组凋亡率为17.22±2.71％；与对照组相比fe3o4@mtx和mtx均能显著增加细胞凋亡率(p<0.05)；与mtx组相比，fe3o4@mtx组诱导细胞凋亡能力稍弱(p<0.05)。

qpcr法检测caspase3、bax、bcl–2和dhfr基因转录水平实验

如图9所示，qpcr法检测caspase3、bax、bcl–2和dhfr基因转录水平,结果显示fe3o4@mtx+h组caspase3基因与fe3o4@mtx组相比表达增高,差别有统计学意义(p<0.05),fe3o4+h组caspase3基因与fe3o4组相比表达增高,差别有统计学意义(p<0.05),fe3o4@mtx+h组caspase3基因与fe3o4+h组相比表达增高,差别有统计学意义(p<0.05)，fe3o4@mtx+h组bax基因与fe3o4@mtx组相比表达增高,差别有统计学意义(p<0.05),fe3o4+h组bax基因与fe3o4组相比表达增高(p＝0.079),fe3o4@mtx+h组bax基因与fe3o4+h组相比表达增高,差别有统计学意义(p<0.05)。fe3o4@mtx+h组bcl-2基因与fe3o4@mtx组相比表达增高,差别有统计学意义(p<0.05),fe3o4+h组bcl-2基因与fe3o4组相比表达增高,差别有统计学意义(p<0.05),fe3o4@mtx+h组bcl-2基因与fe3o4+h组相比表达增高(p＝0.94)。fe3o4@mtx+h组dhfr基因与fe3o4@mtx组相比表达增高,差别有统计学意义(p<0.05),fe3o4+h组dhfr基因与fe3o4组相比表达增高,差别有统计学意义(p<0.05),fe3o4@mtx+h组dhfr基因与fe3o4+h组相比表达增高,差别有统计学意义(p<0.05)。因此磁热疗能够促进凋亡基因的表达,fe3o4@mtx复合制剂联合热疗能够更加显著的促进凋亡基因的表达。

westernblotting法检测caspase3、bax、bcl–2和dhfr蛋白表达水平实验

如图10所示；westernblotting法检测caspase3、bax、bcl–2和dhfr蛋白表达水平，如图显示与pcr结果一致。

fe3o4@mtx体外释放实验

如图14所示，药物释放呈双相性模式，在最初的12h内mtx存在突释现象，释放出约21％的mtx，此后药物呈现良好的缓释特征，释放曲线的趋势平缓，释放时间较长，3天可累积释放达26.3％。

热动力学实验

如图15所示，当磁场强度一定时，不同浓度的fe3o4@mtx复合纳米磁粒在开始30分钟内温度可以迅速上升，60min后温度基本保持稳定在38.5℃，43.2℃，44.1℃，表明fe3o4@mtx复合制剂在amf作用下可快速升温达到恒定温度，在靶向部位进行热疗，促进肿瘤细胞凋亡。

结论：本研究使用pluronicf127改性油酸包裹的四氧化三铁(fe3o4)纳米粒子合成具有良好水溶性的运载体，然后加载化疗药甲氨蝶呤(商品名：甲氨喋呤注射液，mtx,1000mg/10ml，辉瑞制药有限公司生产)合成具有靶向性和磁热效应的fe3o4@mtx复合制剂；通过细胞和动物实验检测ld50，cck8实验，微核试验等对该复合制剂的生物毒性和生物相容性进行检测,结果显示该复合制剂具有良好的生物相容性，提高了治疗效率，降低了毒性及不良反应；同时利用磁流体在交变磁场中的升温特性，对肿瘤部位进行热疗，研究结果显示，复合制剂的联合热化疗作用优于单一治疗方法，能够起到1+1>2的效果，通过对照实验比较fe3o4@mtx复合制剂与单用化疗药和单独热疗对肿瘤凋亡的影响：结果显示复合制剂通过联合热化疗能够显著促进肿瘤细胞的凋亡。