一种抗菌止痒温敏复合水凝胶及其制备方法与流程

本发明涉及一种抗菌止痒温敏复合水凝胶及其制备方法，属于生物材料领域。

背景技术：

温敏性水凝胶是一类随着温度变化能够进行溶液-凝胶转变的软材料。目前有文献报道的有聚异丙基丙烯酰胺和聚酯-聚乙二醇共聚物两类温敏性水凝胶。聚酯-聚乙二醇共聚物水凝胶由于其良好的生物相容性和降解性，在生物医学领域得到了广泛的应用，已有大量研究报道聚酯-聚乙二醇共聚物温敏性水凝胶在药物缓控释、组织修复、皮肤敷料等方面应用的报道。

作为皮肤敷料的温敏性凝胶在体表温度下能够发生相变，由溶液转变为凝胶，对体表伤口起到封闭和保护作用，然而由于水环境的限制，伤口容易感染。通常通过在水凝胶中添加抗菌药物起到抗菌的作用。壳聚糖等带有正电荷的高分子材料可以以其自身的正电荷破坏病菌的细胞壁，杀死细菌，起到抗菌的作用，因此壳聚糖类敷料被认为具有自身抗菌功能。然而壳聚糖由于分子内和分子间强烈的氢键作用，使壳聚糖产品发硬，导致其成型加工困难，并且只能溶于酸性溶液，难以在如肠道等微碱性环境下使用。同时，壳聚糖本身也不具备温敏性功能。

贻贝粘蛋白是在海洋生物贻贝中存在的一类含有大量3,4-二羟基苯丙氨酸(dopa)和赖氨酸的蛋白质，水溶性好，dopa的结构使其具有良好的粘附性，大量赖氨酸带来的正电荷具有很好的抗菌功能。贻贝粘蛋白还具有良好的抗过敏和止痒功能，这些功能已被大量临床研究结果所证实。

技术实现要素：

发明目的：针对现有的聚酯-聚乙二醇共聚物温敏性水凝胶不具备抗菌性、需添加抗菌药物才能实现抗菌的问题，本发明提供一种抗菌止痒温敏复合水凝胶，并提高一种该复合水凝胶的制备方法。

技术方案：本发明所述的一种抗菌止痒温敏复合水凝胶，该复合水凝胶由质量比为100:1～1:1的聚酯-聚乙二醇-聚酯三嵌段共聚物与贻贝粘蛋白接枝反应得到。

其中，聚酯-聚乙二醇-聚酯三嵌段共聚物的分子量小于5000，聚乙二醇的分子量小于等于2000。

优选的，聚酯-聚乙二醇-聚酯三嵌段共聚物中，聚酯为聚l-丙交酯、聚dl-丙交酯、聚乙交酯、聚(ε-已内酯)的均聚物或他们的共聚物中的至少一种。

本发明所述的一种抗菌止痒温敏复合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

(1)将聚酯-聚乙二醇-聚酯三嵌段共聚物与酸酐在有机溶剂中回流1～72小时后，用低沸点有机溶剂沉淀；

(2)将步骤(1)所得沉淀产物溶于水，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌，然后加入贻贝粘蛋白，继续搅拌至完全溶解；

(3)将步骤(2)所得溶液用缓冲液于4℃透析1～3天，然后将透析液浓缩至3～60％的质量浓度，升温至28～40℃，即得具有抗菌止痒功能的温敏复合水凝胶。

上述步骤(1)中，酸酐可为乙二酸酐、丙二酸酐、琥珀酸酐、马来酸酐、甲基马来酸酐、二甲基马来酸酐中的至少一种。较优的，回流时使用的有机溶剂为丙酮、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯、1、4-二氧六环中的至少一种；沉淀时采用的低沸点有机溶剂为乙醚、己烷、环己烷、石油醚中的至少一种。

作为优选的，步骤(2)中，按照下述摩尔比加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺：聚酯-聚乙二醇-聚酯共聚物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为2:1:1～1:4:4。更优的，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺后，室温搅拌的时间为12～72小时，加入贻贝粘蛋白后，继续搅拌1～24小时。

上述步骤(3)中，缓冲液可采用磷酸缓冲液、醋酸缓冲液中的至少一种。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)本发明首次将贻贝粘蛋白与聚酯-聚乙二醇共聚物温敏性水凝胶结合，在保持聚酯-聚乙二醇共聚物水凝胶的温敏特性的同时，复合水凝胶还具有贻贝粘蛋白的抗菌止痒功能；(2)与现有技术中单纯采用壳聚糖类作为抗菌水凝胶或将壳聚糖与其他水凝胶简单复配制备抗菌水凝胶相比，本发明的制备方法通过化学接枝，利用酸酐将聚酯-聚乙二醇共聚物端基的羟基转化为羧基，通过催化剂与贻贝粘蛋白上的氨基键合，所得复合水凝胶具有更优的抗菌性能，而且，贻贝粘蛋白在聚酯-聚乙二醇温敏性水凝胶中能够更长时间地保持其生物活性。

附图说明

图1为实施例1制得的贻贝粘蛋白/plga-peg-plga温敏性水凝胶对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿农杆菌和白色念珠菌的抑菌性能评价；

图2为实施例1制得的贻贝粘蛋白在pbs与plga-peg-plga温敏性水凝胶中蛋白活性保持百分比；

图3为实施例2中不同浓度下贻贝粘蛋白/plga-peg-plga温敏性水凝胶照片，从左到右对应浓度别为30％和40％；

图4为实施例2中贻贝粘蛋白/plga-peg-plga温敏性水凝胶在不同温度下的照片，从左到右对应温度分别为33℃、34℃、35℃；

图5为对比例1制得的plga-peg-plga温敏性水凝胶对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿农杆菌和白色念珠菌的抑菌性能评价；

图6为对比例2制得的温敏性水凝胶对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿农杆菌和白色念珠菌的抑菌性能评价；

图7为对比例3制得的温敏性水凝胶对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿农杆菌和白色念珠菌的抑菌性能评价。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1

将聚(l-丙交酯-乙交酯)(600)-聚乙二醇(2000)-聚(l-丙交酯-乙交酯)(600)三嵌段共聚物与马来酸酐在甲苯中回流54小时后，用己烷沉淀，将沉淀产物溶于水，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，摩尔比为1:1:1，室温搅50小时后，加入贻贝粘蛋白，共聚物与贻贝粘蛋白的质量比为10:1，继续搅拌10小时，用醋酸缓冲液于4℃透析3天后，将透析液浓缩至15％质量浓度，升温至37℃，即可得到具有抗菌止痒功能的温敏复合水凝胶。

对制得的贻贝粘蛋白/plga-peg-plga温敏性水凝胶进行抗菌性和保持贻贝蛋白生物活性测试，测试结果如图1～2，可以看到，本发明制备的温敏性水凝胶具有优异的抗菌性能，而且，贻贝粘蛋白在水凝胶中能够长时间地保持其生物活性。

实施例2不同温度、不同质量浓度对水凝胶的影响

参照实施例1的制备方法，将用醋酸缓冲液于4℃透析3天后的产物冷冻干燥。

取冷冻干燥后的干凝胶重新溶于醋酸缓冲液中，配制成30％和40％质量浓度的溶液，升温至37℃，所得温敏复合水凝胶的外观形态如图3，可以看到，随着贻贝粘蛋白/plga-peg-plga水凝胶的质量浓度增大，水凝胶由透明变成乳白色。

另取冷冻干燥后的干凝胶重新溶于醋酸缓冲液中，配制成15％质量浓度的溶液，分别升温至33℃、34℃和35℃，所得温敏复合水凝胶的外观形态如图4，可以看到，三个温度下都可以形成水凝胶，随温度的升高，水凝胶越来越不透明，说明其相变程度越深。

实施例3

将聚l-丙交酯(1200)-聚乙二醇(2000)-聚l-丙交酯(1200)三嵌段共聚物与琥珀酸酐在氯仿回流72小时后，用乙醚沉淀，将沉淀产物溶于水，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，摩尔比为1:2:1，室温搅72小时后，加入贻贝粘蛋白，共聚物与贻贝粘蛋白的质量比为100:1，继续搅拌24小时，用磷酸缓冲液于4℃透析1天后，将透析液浓缩至3％质量浓度，升温至35℃，即可得到具有抗菌止痒功能的温敏复合水凝胶。

实施例4

将聚dl-丙交酯(800)-聚乙二醇(1500)-聚dl-丙交酯(800)三嵌段共聚物与乙二酸酐在1,4-二氧六环中回流1小时后，用环己烷沉淀，将沉淀产物溶于水，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，摩尔比为2:1:1，室温搅12小时后，加入贻贝粘蛋白，共聚物与贻贝粘蛋白的质量比为50:1，继续搅拌1小时，用醋酸缓冲液于4℃透析2天后，将透析液浓缩至30％质量浓度，升温至28℃，即可得到具有抗菌止痒功能的温敏复合水凝胶。

实施例5

将聚ε-已内酯(1000)-聚乙二醇(1000)-聚ε-已内酯(1000)三嵌段共聚物与丙二酸酐在丙酮中回流72小时后，用石油醚沉淀，将沉淀产物溶于水，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，摩尔比为1:4:4，室温搅36小时后，加入贻贝粘蛋白，共聚物与贻贝粘蛋白的质量比为20:1，继续搅拌24小时，用醋酸缓冲液于4℃透析3天后，将透析液浓缩至60％质量浓度，升温至40℃，即可得到具有抗菌止痒功能的温敏复合水凝胶。

实施例6

将聚(dl-丙交酯-乙交酯)(400)-聚乙二醇(1500)-聚(dl-丙交酯-乙交酯)(400)三嵌段共聚物与马来酸酐在四氢呋喃中回流30小时后，用石油醚沉淀，将沉淀产物溶于水，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，摩尔比为1:2:3，室温搅50小时后，加入贻贝粘蛋白，共聚物与贻贝粘蛋白的质量比为10:1，继续搅拌10小时，用醋酸缓冲液于4℃透析3天后，将透析液浓缩至15％质量浓度，升温至37℃，即可得到具有抗菌止痒功能的温敏复合水凝胶。

实施例7

将聚(l-丙交酯-ε-已内酯)(700)-聚乙二醇(2000)-(l-丙交酯-ε-已内酯)(700)三嵌段共聚物与甲基马来酸酐在四氢呋喃中回流20小时后，用己烷沉淀，将沉淀产物溶于水，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，摩尔比为1:2:1，室温搅23小时后，加入贻贝粘蛋白，共聚物与贻贝粘蛋白的质量比为1:1，继续搅拌5小时，用磷酸缓冲液于4℃透析1天后，将透析液浓缩至35％质量浓度，升温至33℃，即可得到具有抗菌止痒功能的温敏复合水凝胶。

实施例8

将聚(dl-丙交酯-ε-已内酯)(700)-聚乙二醇(1500)-(dl-丙交酯-ε-已内酯)(700)三嵌段共聚物与二甲基马来酸酐在二氯甲烷中回流30小时后，用己烷沉淀，将沉淀产物溶于水，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，摩尔比为2:2:1，室温搅32小时后，加入贻贝粘蛋白，共聚物与贻贝粘蛋白的质量比为70:1，继续搅拌24小时，用磷酸缓冲液于4℃透析3天后，将透析液浓缩至40％质量浓度，升温至30℃，即可得到具有抗菌止痒功能的温敏复合水凝胶。

实施例9

将聚(乙交酯-ε-已内酯)(700)-聚乙二醇(2000)-(乙交酯-ε-已内酯)(700)三嵌段共聚物与二甲基马来酸酐在二氯甲烷中回流20小时后，用乙醚沉淀，将沉淀产物溶于水，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，摩尔比为1:2:3，室温搅15小时后，加入贻贝粘蛋白，共聚物与贻贝粘蛋白的质量比为50:1，继续搅拌10小时，用磷酸缓冲液于4℃透析2天后，将透析液浓缩至36％质量浓度，升温至32℃，即可得到具有抗菌止痒功能的温敏复合水凝胶。

实施例10

将聚(l-丙交酯-乙交酯-ε-已内酯)(500)-聚乙二醇(2000)-(l-丙交酯-乙交酯-ε-已内酯)(500)三嵌段共聚物与琥珀酸酐在三氯甲烷中回流60小时后，用乙醚沉淀，将沉淀产物溶于水，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，摩尔比为1:1:1，室温搅12小时后，加入贻贝粘蛋白，共聚物与贻贝粘蛋白的质量比为25:1，继续搅拌5小时，用醋酸缓冲液于4℃透析3天后，将透析液浓缩至28％质量浓度，升温至37℃，即可得到具有抗菌止痒功能的温敏复合水凝胶。

对比例1

将聚(l-丙交酯-乙交酯)(600)-聚乙二醇(2000)-聚(l-丙交酯-乙交酯)(600)三嵌段共聚物溶于水，配成15％浓度的溶液，升温至37℃，即可得到温敏水凝胶。对其进行抗菌性实验，结果如图5，可以看到，聚(l-丙交酯-乙交酯)(600)-聚乙二醇(2000)-聚(l-丙交酯-乙交酯)(600)温敏性水凝胶本身不具有抗菌功能。

对比例2

参照实施例1的原料配比，将同等比例的贻贝粘蛋白以物理混合的方式分散到聚(l-丙交酯-乙交酯)(600)-聚乙二醇(2000)-聚(l-丙交酯-乙交酯)(600)温敏性水凝胶中。具体制备方法如下：将贻贝粘蛋白加入聚(l-丙交酯-乙交酯)(600)-聚乙二醇(2000)-聚(l-丙交酯-乙交酯)(600)三嵌段共聚物的水溶液中，共聚物与贻贝粘蛋白的质量比为10:1，继续搅拌10小时，溶液浓缩至15％质量浓度，升温至37℃，即可得到温敏水凝胶。

进行抗菌性和保持贻贝蛋白生物活性的对比实验。其中，实施例1和对比例2制得温敏水凝胶的抗菌性实验结果分别如图1和图6，贻贝蛋白生物活性实验结果见表1。

可以看到，与直接物理混合制得的温敏性水凝胶相比，采用本发明的方法制备的贻贝粘蛋白/plga-peg-plga温敏性水凝胶的抗菌性能显著提升，而且，贻贝粘蛋白在聚酯-聚乙二醇温敏性水凝胶中也能够更长时间地保持其生物活性。

表1实施例1和对比例2制得的水凝胶中贻贝粘蛋白生物活性测试结果

对比例3

参照实施例1的原料配比，以壳聚糖为抗菌成分，制备壳聚糖/聚(l-丙交酯-乙交酯)(600)-聚乙二醇(2000)-聚(l-丙交酯-乙交酯)(600)温敏性复合水凝胶。具体制备方法为：将聚(l-丙交酯-乙交酯)(600)-聚乙二醇(2000)-聚(l-丙交酯-乙交酯)(600)三嵌段共聚物与马来酸酐在甲苯中回流54小时后，用己烷沉淀，将沉淀产物溶于水，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，摩尔比为1:1:1，室温搅50小时后，加入壳聚糖的醋酸溶液，共聚物与壳聚糖的质量比为10:1，继续搅拌10小时，用醋酸缓冲液透析于4℃透析3天后，将透析液浓缩至15％质量浓度，升温至37℃，即可得到具有抗菌功能的壳聚糖温敏复合水凝胶，对其进行抗菌性实验，实验结果如图7。

对比图1和图7，可以看到，本发明的贻贝粘蛋白/plga-peg-plga温敏性水凝胶与壳聚糖温敏性复合水凝胶相比，抗菌性能有大幅度提升。