一种具有抗菌和促进伤口愈合功能的热诱导不可逆复合水凝胶的制备方法及其应用与流程

本发明涉及一种具有抗菌和促进伤口愈合功能的热诱导不可逆复合水凝胶的制备方法及其应用。

背景技术：

水凝胶是一种新型的伤口敷料材料，是由良好的生物相容性和生物可降解性的聚合物制成的一种三维交联多孔材料。水凝胶含有大量的水，具有可调控的机械性能，可以很容易地注射或喷涂在伤口表面，与伤口缝合线和胶带等常规伤口治疗方法相比，水凝胶可以快速粘附在伤口表面，减少缝合区出血，预防术后并发症，促进伤口愈合。以此为基础，水凝胶材料在抗菌和创伤类伤口敷料的应用引起了研究者的关注，并且一些水凝胶伤口敷料已得到商业化的应用，如bioglue(医用软组织粘合剂)、duraseal^tm(congluentsurgical公司)、coseal^tm(外科用封合剂)等。

水凝胶的形成机制主要是化学交联和物理交联。化学交联水凝胶是基质材料在外加交联剂或催化剂的作用下形成稳定的共价键构建高度交联结构形成的水凝胶，具有永久稳定性、良好的附着力和机械性能，但缺点也非常明显：交联剂需要单独储存并在形成水凝胶之前加入到基质中，若交联剂在反应之前与基质材料混合，则需要施加外部辐射以引发交联，在临床实践使用过程中很不方便，且残留的有机交联剂和催化剂存在潜在的细胞毒性。相比之下，物理交联水凝胶通常不需要额外的交联剂或辐射，是聚合物链之间受外部刺激(如温度变化、ph变化和离子的存在)通过物理相互作用(如氢键、链缠结或配位作用)形成的水凝胶，易于使用且毒性低，但物理交联水凝胶材料在外界刺激或者离子缺失情况下会由凝胶转化为液体，这意味着物理交联水凝胶不稳定且可逆。

这些缺点使水凝胶材料在促进伤口愈合和抗菌方面的应用受到了限制。因此，一种既具有促进伤口愈合和抗菌功能又具有不可逆性能、方便使用的水凝胶复合材料急需开发。

技术实现要素：

本发明为解决上述现有技术所存在的不足之处，提供了一种具有抗菌和促进伤口愈合功能的热诱导不可逆复合水凝胶的制备方法及其应用，将其作为创伤伤口敷料，以解决现有创伤伤口敷料作用单一、不能够同时兼顾抗菌和促进伤口愈合功能的问题。

本发明具有抗菌和促进伤口愈合功能的热诱导不可逆复合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：取10～30g聚乙二醇(mw＝4000)和1～5g三乙胺溶解在100～300ml二氯甲烷中，通入氩气保护后，加入2～8g2-溴代异丁酰溴，将溶液在0℃下搅拌1小时，然后在室温下再搅拌24～72小时，所得产物经铝柱分离(洗脱液为四氢呋喃)、透析(再生纤维素透析袋mwco：1000d)、冻干(冻干温度-60℃)后，获得原子转移自由基聚合引发剂；

步骤2：将步骤1获得的所述原子转移自由基聚合引发剂取0.1～0.5g溶解在1～10ml异丙醇/水混合溶剂中，放入至聚合瓶，然后加入1～10g温敏性单体(如n-异丙基丙烯酰胺、n,n-二乙基-2-丙烯酰胺、n-正丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸聚乙二醇酯等)、0.1～0.5g疏水性单体(如甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸二乙胺基乙酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯等)、10～50mg氯化亚铜，充分溶解，通入氩气保护，在三次冻融循环后，通过微量注射器注射50～150μl三(2-二甲氨基乙基)胺开始聚合。室温下反应24～72小时，所得产物经铝柱分离(洗脱液为四氢呋喃)、透析(再生纤维素透析袋mwco：4000d)、冻干(冻干温度-60℃)后，获得共聚物；

步骤3：取100～300mg氧化石墨烯片加入到100～300ml蒸馏水中，超声分散后，加入1～5g聚苯乙烯硫酸钠，搅拌溶解，再加入150～400μl水合肼，加热至100℃回流反应24小时，所得产物经抽滤、冻干(冻干温度-60℃)后，获得还原型氧化石墨烯-聚苯乙烯硫酸钠复合物。取50～200mg还原型氧化石墨烯-聚苯乙烯硫酸钠复合物加入至50～100ml水中，混合均匀，放入至反应瓶中，加热至60℃，然后将5～10ml浓度为0.02mol/l的硝酸银溶液以0.5ml/h的速度加入反应瓶中，加完后继续恒温搅拌5～10h，离心并去除上清液，获得载银石墨烯水溶液；

步骤4：将步骤2获得的共聚物溶解在载银石墨烯水溶液(载银石墨烯浓度为10～100mg/ml)中，即可获得热诱导不可逆复合水凝胶。

步骤2中，异丙醇/水混合溶剂中异丙醇/水的体积比为95:5。

步骤4中，共聚物与载银石墨烯水溶液的质量比为1:2～1:10。

本发明热诱导不可逆复合水凝胶具有高热诱导成胶低温不可回复性，这种性能可以使水凝胶保持稳定结构。

本发明热诱导不可逆复合水凝胶的应用，是将所述热诱导不可逆复合水凝胶作为创伤伤口敷料使用。将所述热诱导不可逆复合水凝胶喷涂在伤口表面，通过伤口表面温度刺激响应形成不可回复水凝胶。

与已有技术相比，本发明有益效果体现在：

1、本发明所提供的热诱导不可逆复合水凝胶，制备方法简单，且同时具有抗菌(如抗金葡萄球菌和抗大肠杆菌)和促进伤口愈合的功能，用于作为创伤伤口敷料，有明显的效果，具有较大的临床应用潜力。

2、本发明所提供的热诱导不可逆复合水凝胶，具有低毒、无污染、生物相容性好且细胞毒性低的优点，是一种安全性很高的材料；

3、本发明所提供的热诱导不可逆复合水凝胶，其结构稳定，实用性强，具有较高的临床和市场应用潜力。

附图说明

图1本发明实施例1所制备的热诱导不可逆复合水凝胶的(a)纯聚合物水凝胶截面扫描电镜图(sem,zeisssupra40,germany)、(b)掺杂载银石墨烯水凝胶截面扫描电镜图(sem,zeisssupra40,germany)、(c)xrd图谱、(d)紫外吸收图谱、(e-f)载银石墨烯溶液透射电子显微镜图(tem,hitachiht7700)、(g-j)扫描电镜能谱(eds,x-max,oxford)。

图2为本发明实施例1所制备的几种水凝胶的(a-b)黏流曲线、(c-d)储能模量、损耗模量升降温变化曲线。

图3为本发明实施例1所制备的几种不同水凝胶的(a)抗大肠杆菌和抗金黄色葡萄球菌效果图和(b)抑菌圈直径图。

图4为本发明实施例1所制备热诱导不可逆复合水凝胶促进伤口愈合的效果图。

图5为本发明实施例1所制备的热诱导不可逆复合水凝胶的生物相容性/生物降解性试验效果图。

具体实施方式

实施例1：

本实施例按如下步骤进行热诱导不可逆复合水凝胶的制备：

步骤1：取15g聚乙二醇(mw＝4000)和1.8g三乙胺溶解在150ml二氯甲烷中，通入氩气保护后，加入3.4g2-溴代异丁酰溴，将溶液在0℃下搅拌1小时，然后在室温下再搅拌72小时，所得产物经铝柱分离(洗脱液为四氢呋喃)、透析(再生纤维素透析袋mwco：1000d)、冻干(冻干温度-60℃)后，获得原子转移自由基聚合引发剂；

步骤2：将步骤1获得的所述原子转移自由基聚合引发剂取0.2g溶解在6ml异丙醇/水混合溶剂中，放入至聚合瓶，然后加入2.5gn-异丙基丙烯酰胺、0.16g丙烯酸丁酯、28.6mg氯化亚铜，充分溶解，通入氩气保护，在三次冻融循环后，通过微量注射器注射94μl三(2-二甲氨基乙基)胺开始聚合。室温下反应72小时，所得产物经铝柱分离(洗脱液为四氢呋喃)、透析(再生纤维素透析袋mwco：4000d)、冻干(冻干温度-60℃)后，获得聚n-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸丁酯-聚乙二醇-丙烯酸丁酯-n-异丙基丙烯酰胺共聚物；

步骤3：取100mg氧化石墨烯片加入到150ml蒸馏水中，超声分散后，加入2g聚苯乙烯硫酸钠，搅拌溶解，再加入150μl水合肼，加热至100℃回流反应24小时，所得产物经抽滤、冻干(冻干温度-60℃)后，获得还原型氧化石墨烯-聚苯乙烯硫酸钠复合物。取50mg还原型氧化石墨烯-聚苯乙烯硫酸钠复合物加入至100ml水中，混合均匀，放入至反应瓶中，加热至60℃，然后将5ml浓度为0.02mol/l的硝酸银溶液以0.5ml/h的速度加入反应瓶中，加完后继续恒温搅拌8h，离心并去除上清液，获得载银石墨烯水溶液；

步骤4：将步骤2获得的聚n-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸丁酯-聚乙二醇-丙烯酸丁酯-n-异丙基丙烯酰胺共聚物溶解在载银石墨烯水溶液(载银石墨烯浓度为40mg/ml)中，即可获得热诱导不可逆复合水凝胶。

步骤2中，异丙醇/水混合溶剂中异丙醇/水的体积比为95:5。

步骤4中，聚n-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸丁酯-聚乙二醇-丙烯酸丁酯-n-异丙基丙烯酰胺共聚物与载银石墨烯水溶液的质量比为1:3。

图1本发明实施例1所制备的热诱导不可逆复合水凝胶的(a)纯聚合物水凝胶截面扫描电镜图(sem,zeisssupra40,germany)、(b)热诱导不可逆复合水凝胶截面扫描电镜图(sem,zeisssupra40,germany)、(c)xrd图谱、(d)紫外吸收图谱、(e-f)载银石墨烯溶液透射电子显微镜图(tem,hitachiht7700)、(g-j)扫描电镜能谱(eds,x-max,oxford)。可以看出热诱导不可逆复合水凝胶为多孔结构，包含碳、氧、银三种特征元素，且在热诱导不可逆复合水凝胶的原始溶液中银颗粒分布均匀，银颗粒尺寸在10nm左右。

通过掺杂不同成分的水溶液溶解聚n-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸丁酯-聚乙二醇-丙烯酸丁酯-n-异丙基丙烯酰胺共聚物可以制备不同混合体系的复合水凝胶，通过分析，所获得的复合水凝胶展示出不同的性能。

为对比不同水凝胶的性能，本实施例按如下方式制作如下几种水凝胶：

纯水凝胶的制备方法：将2.5g制备的聚n-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸丁酯-聚乙二醇-丙烯酸丁酯-n-异丙基丙烯酰胺共聚物加入到7.5ml的去离子水中，然后静置溶解，直至共聚物彻底溶于去离子水中(共聚物与去离子水的质量比为1:3)，即获得纯水凝胶。

石墨烯复合水凝胶的制备方法：将制备的聚n-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸丁酯-聚乙二醇-丙烯酸丁酯-n-异丙基丙烯酰胺共聚物与石墨烯溶液混合后(共聚物与石墨烯溶液的质量比为1:3)，静置溶解，直至共聚物彻底溶于石墨烯溶液中，即获得石墨烯复合水凝胶。

纳米银复合水凝胶的制备方法：将制备的聚n-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸丁酯-聚乙二醇-丙烯酸丁酯-n-异丙基丙烯酰胺共聚物与纳米银颗粒水溶液混合(共聚物与纳米银颗粒水溶液的质量比为1:3)后静置溶解，直至共聚物彻底溶于纳米银颗粒水溶液中，即获得纳米银复合水凝胶。

热诱导不可逆复合水凝胶的制备方法：将制备的聚n-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸丁酯-聚乙二醇-丙烯酸丁酯-n-异丙基丙烯酰胺共聚物溶解在载银石墨烯水溶液中(共聚物与载银石墨烯水溶液的质量比为1:3)，静置溶解，直至共聚物彻底溶于载银石墨烯水溶液中，即获得热诱导不可逆复合水凝胶。

图1(a)为纯水凝胶的sem图，(b)为热诱导不可逆复合水凝胶的sem图，可以看出：纯水凝胶没有掺入石墨烯，所以其截面没有有序的多孔结构；而热诱导不可逆复合水凝胶因掺入石墨烯而使截面形成多孔结构。纳米级石墨烯片的掺入而形成的有序多孔结构增强了水凝胶的力学性能以及不可回复性。

图1(c)为热诱导不可逆复合水凝胶的xrd图，可以看出：热诱导不可逆复合水凝胶在2theta＝38.2°和2theta＝44.3°时出现了银的特征峰，又在2theta＝20°时出现了石墨烯的特征峰。证明了本实施例制备的热诱导不可逆复合水凝胶含有银和石墨烯的成分。

如图1(d)所示，利用紫外可见分光光度计对热诱导不可逆复合水凝胶和纯水凝胶进行分析，可以看出热诱导不可逆复合水凝胶在波长等于446nm处有明显的银的吸收峰，而作为对照的纯水凝胶则没有此峰。进一步证明了热诱导不可逆复合水凝胶含有银的成分。

如图2所示，将制备的纯水凝胶和热诱导不可逆复合水凝胶进行力学性质的测试，图2(a)可以看出，纯水凝胶溶液在30℃以上形成水凝胶，但温度降下来会重新变成溶液，通过，图2(c)可以看出，纯水凝胶的损耗模量和储能模量曲线在降到20℃以后会出现偏差说明水凝胶重新转变为液体。通过图2(b)和(d)可以看出，热诱导不可逆复合水凝胶溶液30℃以上形成水凝胶，但温度降低仍是凝胶状态，显示出不可逆性。

为测试4种水凝胶的抗菌性能，将四种水凝胶做成直径约为1公分大小的圆形，并分别与浓度为1×10⁶的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在温度为37℃培养基中共培养24小时，然后观察并拍照，如图3所示。可以看出：经过24小时的共培养，热诱导不可逆复合水凝胶和纳米银复合水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有抗菌效果。纯水凝胶和石墨烯复合水凝胶则基本上对两种菌的生长无抑制作用。纳米银复合水凝胶虽然对两种菌的生长都有抑制效果，但是膜的力学性质较热诱导不可逆复合水凝胶较差，发生了失水收缩的现象。

为测试热诱导不可逆复合水凝胶的促进伤口愈合功能，将成年雄性sd大鼠麻醉后剔除背部毛发，使用无菌手术剪在背部左右两侧各剪出直径约为0.8cm的圆形创口，其中，背部左侧伤口作为对照组，不作任何处理。右侧伤口敷上与伤口大小基本相同的热诱导不可逆复合水凝胶作为试验组，并分别于第二天、第四天、第六天、第八天、第十天和第十二天进行观察并拍照记录，如图4所示。可以看出，实验组的皮肤创口在第十二天时出现了明显的愈合迹象，并且新的表皮显著再生，而相比之下，对照组的皮肤创口在十二天后没有明显的愈合迹象且明显存在肿胀和炎症。这说明了热诱导不可逆复合水凝胶具有促进创口愈合的功能。

为测试热诱导不可逆复合水凝胶的生物降解性能，将成年雄性sd大鼠麻醉后剔除背部毛发，使用无菌手术剪在背部剪出直径约为1.3cm的圆形创口，在伤口内注射热诱导不可逆复合水凝胶。如图5所示，在注射后一周内，水凝胶保持完整，三周后水凝胶明显消失，在注射六周后几乎完全降解，这表明该材料具有良好的生物相容性和生物降解性。

因此，本发明的热诱导不可逆复合水凝胶，同时具备抗菌和促进伤口愈合功能的功能，具有很大的临床运用潜力。

实施例2：

本实施例按如下步骤制备热诱导不可逆复合水凝胶：

步骤1：取10g聚乙二醇(mw＝4000)和1g三乙胺溶解在150ml二氯甲烷中，通入氩气保护后，加入2g2-溴代异丁酰溴，将溶液在0℃下搅拌1小时，然后在室温下再搅拌72小时，所得产物经铝柱分离(洗脱液为四氢呋喃)、透析(再生纤维素透析袋mwco：1000d)、冻干(冻干温度-60℃)后，获得原子转移自由基聚合引发剂；

步骤2：将步骤1获得的所述原子转移自由基聚合引发剂取0.2g溶解在6ml异丙醇/水混合溶剂中，放入至聚合瓶，然后加入2.5gn-正丙基丙烯酰胺、0.16g甲基丙烯酸羟乙酯、28.6mg氯化亚铜，充分溶解，通入氩气保护，在三次冻融循环后，通过微量注射器注射94μl三(2-二甲氨基乙基)胺开始聚合。室温下反应72小时，所得产物经铝柱分离(洗脱液为四氢呋喃)、透析(再生纤维素透析袋mwco：4000d)、冻干(冻干温度-60℃)后，获得聚n-正丙基丙烯酰胺-甲基丙烯酸羟乙酯-聚乙二醇-甲基丙烯酸羟乙酯-n-正丙基丙烯酰胺共聚物；

步骤3：取50mg氧化石墨烯片加入到150ml蒸馏水中，超声分散后，加入1g聚苯乙烯硫酸钠，搅拌溶解，再加入100μl水合肼，加热至100℃回流反应24小时，所得产物经抽滤、冻干(冻干温度-60℃)后，获得还原型氧化石墨烯-聚苯乙烯硫酸钠复合物。取50mg还原型氧化石墨烯-聚苯乙烯硫酸钠复合物加入至100ml水中，混合均匀，放入至反应瓶中，加热至60℃，然后将5ml浓度为0.02mol/l的硝酸银溶液以0.5ml/h的速度加入反应瓶中，加完后继续恒温搅拌8h，离心并去除上清液，获得载银石墨烯水溶液；

步骤4：将步骤2获得的聚n-正丙基丙烯酰胺-甲基丙烯酸羟乙酯-聚乙二醇-甲基丙烯酸羟乙酯-n-正丙基丙烯酰胺共聚物溶解在载银石墨烯水溶液(载银石墨烯浓度为30mg/ml)中，即可获得热诱导不可逆复合水凝胶。

步骤2中，异丙醇/水混合溶剂中异丙醇/水的体积比为95:5。

步骤4中，聚n-正丙基丙烯酰胺-甲基丙烯酸羟乙酯-聚乙二醇-甲基丙烯酸羟乙酯-n-正丙基丙烯酰胺共聚物与载银石墨烯水溶液的质量比为1:4。

经x射线衍射(philipsx'pertprosuperx-raydiffractometer)和扫描电镜能谱(eds,x-max,oxford)证明，本实施例所制备的热诱导不可逆复合水凝胶含有碳、氧、银三种特征元素。经过抗菌实验和大鼠皮肤创伤愈合实验表明本实施例所制备的热诱导不可逆复合水凝胶具有良好的抗菌功能和良好的促进大鼠皮肤伤口愈合的功能。

实施例3：

本实施例按如下步骤制备热诱导不可逆复合水凝胶：

步骤1：取15g聚乙二醇(mw＝4000)和1.8g三乙胺溶解在150ml二氯甲烷中，通入氩气保护后，加入3.4g2-溴代异丁酰溴，将溶液在0℃下搅拌1小时，然后在室温下再搅拌72小时，所得产物经铝柱分离(洗脱液为四氢呋喃)、透析(再生纤维素透析袋mwco：1000d)、冻干(冻干温度-60℃)后，获得原子转移自由基聚合引发剂；

步骤2：将步骤1获得的所述原子转移自由基聚合引发剂取0.3g溶解在6ml异丙醇/水混合溶剂中，放入至聚合瓶，然后加入3gn-异丙基丙烯酰胺、0.3g甲基丙烯酸叔丁酯、50mg氯化亚铜，充分溶解，通入氩气保护，在三次冻融循环后，通过微量注射器注射150μl三(2-二甲氨基乙基)胺开始聚合。室温下反应72小时，所得产物经铝柱分离(洗脱液为四氢呋喃)、透析(再生纤维素透析袋mwco：4000d)、冻干(冻干温度-60℃)后，获得聚n-异丙基丙烯酰胺-甲基丙烯酸叔丁酯-聚乙二醇-甲基丙烯酸叔丁酯-n-异丙基丙烯酰胺共聚物；

步骤3：取150mg氧化石墨烯片加入到200ml蒸馏水中，超声分散后，加入3g聚苯乙烯硫酸钠，搅拌溶解，再加入150μl水合肼，加热至100℃回流反应24小时，所得产物经抽滤、冻干(冻干温度-60℃)后，获得还原型氧化石墨烯-聚苯乙烯硫酸钠复合物。取80mg还原型氧化石墨烯-聚苯乙烯硫酸钠复合物加入至100ml水中，混合均匀，放入至反应瓶中，加热至60℃，然后将8ml浓度为0.02mol/l的硝酸银溶液以0.5ml/h的速度加入反应瓶中，加完后继续恒温搅拌8h，离心并去除上清液，获得载银石墨烯水溶液；

步骤4：将步骤2获得的聚n-异丙基丙烯酰胺-甲基丙烯酸叔丁酯-聚乙二醇-甲基丙烯酸叔丁酯-n-异丙基丙烯酰胺共聚物溶解在载银石墨烯水溶液(载银石墨烯浓度为50mg/ml)中，即可获得热诱导不可逆复合水凝胶。

步骤2中，异丙醇/水混合溶剂中异丙醇/水的体积比为95:5。

步骤4中，聚n-异丙基丙烯酰胺-甲基丙烯酸叔丁酯-聚乙二醇-甲基丙烯酸叔丁酯-n-异丙基丙烯酰胺共聚物与载银石墨烯水溶液的质量比为1:3。

经x射线衍射(philipsx'pertprosuperx-raydiffractometer)和扫描电镜能谱(eds,x-max,oxford)证明，本实施例所制备的热诱导不可逆复合水凝胶含有碳、氧、银三种特征元素。经过抗菌实验和大鼠皮肤创伤愈合实验表明本实施例所制备的热诱导不可逆复合水凝胶具有良好的抗菌功能和良好的促进大鼠皮肤伤口愈合的功能。

实施例4：

本实施例按如下步骤制备热诱导不可逆复合水凝胶：

步骤1：取20g聚乙二醇(mw＝4000)和3g三乙胺溶解在200ml二氯甲烷中，通入氩气保护后，加入5g2-溴代异丁酰溴，将溶液在0℃下搅拌1小时，然后在室温下再搅拌72小时，所得产物经铝柱分离(洗脱液为四氢呋喃)、透析(再生纤维素透析袋mwco：1000d)、冻干(冻干温度-60℃)后，获得原子转移自由基聚合引发剂；

步骤2：将步骤1获得的所述原子转移自由基聚合引发剂取0.4g溶解在6ml异丙醇/水混合溶剂中，放入至聚合瓶，然后加入6gn,n-二乙基-2-丙烯酰胺、0.4g甲基丙烯酸叔丁酯、50mg氯化亚铜，充分溶解，通入氩气保护，在三次冻融循环后，通过微量注射器注射150μl三(2-二甲氨基乙基)胺开始聚合。室温下反应72小时，所得产物经铝柱分离(洗脱液为四氢呋喃)、透析(再生纤维素透析袋mwco：4000d)、冻干(冻干温度-60℃)后，获得聚n,n-二乙基-2-丙烯酰胺-甲基丙烯酸叔丁酯-聚乙二醇-甲基丙烯酸叔丁酯-n,n-二乙基-2-丙烯酰胺共聚物；

步骤3：取100mg氧化石墨烯片加入到150ml蒸馏水中，超声分散后，加入2.5g聚苯乙烯硫酸钠，搅拌溶解，再加入150μl水合肼，加热至100℃回流反应24小时，所得产物经抽滤、冻干(冻干温度-60℃)后，获得还原型氧化石墨烯-聚苯乙烯硫酸钠复合物。取100mg还原型氧化石墨烯-聚苯乙烯硫酸钠复合物加入至100ml水中，混合均匀，放入至反应瓶中，加热至60℃，然后将8ml浓度为0.02mol/l的硝酸银溶液以0.5ml/h的速度加入反应瓶中，加完后继续恒温搅拌8h，离心并去除上清液，获得载银石墨烯水溶液；

步骤4：将步骤2获得的聚n,n-二乙基-2-丙烯酰胺-甲基丙烯酸叔丁酯-聚乙二醇-甲基丙烯酸叔丁酯-n,n-二乙基-2-丙烯酰胺共聚物溶解在载银石墨烯水溶液(载银石墨烯浓度为60mg/ml)中，即可获得热诱导不可逆复合水凝胶。

步骤2中，异丙醇/水混合溶剂中异丙醇/水的体积比为95:5。

步骤4中，聚n,n-二乙基-2-丙烯酰胺-甲基丙烯酸叔丁酯-聚乙二醇-甲基丙烯酸叔丁酯-n,n-二乙基-2-丙烯酰胺共聚物与载银石墨烯水溶液的质量比为1:4。

经x射线衍射(philipsx'pertprosuperx-raydiffractometer)和扫描电镜能谱(eds,x-max,oxford)证明，本实施例所制备的热诱导不可逆复合水凝胶含有碳、氧、银三种特征元素。经过抗菌实验和大鼠皮肤创伤愈合实验表明本实施例所制备的热诱导不可逆复合水凝胶具有良好的抗菌功能和良好的促进大鼠皮肤伤口愈合的功能。

以上所述仅为本发明的示例性实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。