用噬菌体治疗肥胖症、炎症或代谢病症的方法和组合物与流程

本申请要求2017年3月14日提交的美国临时申请号62/471,248的权益，其公开内容通过引用整体并入本文。

本公开大体上涉及用噬菌体治疗肥胖症、炎症或肥胖症相关代谢病症的方法和组合物以及制备该组合物的方法。

背景技术：

肥胖症已成为全世界的流行病。在过去的几十年里，美国的超重率和肥胖率急剧上升，最高有37％的美国人(即1.2亿人)符合肥胖的标准²。在美国，2013年至2014年，男性的肥胖症患病率为35％，女性为40％²。6％的美国成年人是病态肥胖，这自1986年以来增加了400％^9,10。在儿童和青少年中，肥胖症的患病率在2010年为17％⁷。肥胖症通常是许多其他慢性疾病如糖尿病、心脏病发作(heartattacks)、中风和某些癌症的主要原因³。肥胖症导致心脏病、脂肪肝、骨关节炎、抑郁症和某些癌症，导致生活质量下降和医疗成本飞涨^4,5。

技术实现要素：

在多种实施方案中公开的本公开内容涉及用噬菌体治疗肥胖症、炎症或肥胖症相关代谢病症的方法和组合物以及制备该组合物的方法。

在多种实施方案中，公开了用于改变受试者的肠道微生物组以治疗肥胖症、炎症或肥胖症相关代谢病症的组合物，其包括有效降低受试者的肠道微生物组中的病原体的浓度的一定量的噬菌体株和药学上可接受的赋形剂，其中所述病原体的浓度诱导肥胖症、炎症或肥胖症相关代谢病症，并且噬菌体株具有对病原体物种特异的感染性。在多种实施方案中，公开了制备多种实施方案的组合物的方法，其包括：通过将病原体暴露于噬菌体株并检测病原体的感染或裂解来表征噬菌体株；以及当检测到病原体的感染或裂解时，将噬菌体株与药学上可接受的赋形剂组合。

在多种实施方案中，公开了用于改变受试者的肠道微生物组以治疗肥胖症、炎症或肥胖症相关代谢病症的方法，该方法包括：向具有如下的肠道微生物组的受试者施用一定量的噬菌体株，所述肠道微生物组具有诱导肥胖症、炎症或肥胖症相关代谢病症的病原体浓度，其中一定量的噬菌体株降低了病原体的浓度，并且噬菌体株具有对病原体物种特异的感染性。

在多种实施方案中，公开了制备用于改变受试者的肠道微生物组以治疗肥胖症、炎症或肥胖症相关代谢病症的组合物的方法，该方法包括：鉴定病原体，其中受试者的肠道微生物组中的病原体浓度诱导肥胖症、炎症或肥胖症相关代谢病症；通过将病原体暴露于噬菌体株并检测病原体的感染或裂解来表征噬菌体株；以及当检测到病原体的感染或裂解时，通过将噬菌体株与药学上可接受的赋形剂组合，来制备用于改变受试者的肠道微生物组以治疗肥胖症、炎症或肥胖症相关代谢病症的组合物。

附图说明

为了进一步理解本公开的本质、目的和优点，应参考以下详细描述，并结合以下附图阅读。其中：

图1a、1b、1c、1d、1e、1f、1g、1h和1i是显示各种实施方案的不同噬菌体株对阴沟肠杆菌(enterobactercloacae)菌株b29的裂解活性的图示。

图2是显示，与具有阴沟肠杆菌菌株b29定殖(colonized)的肠道微生物组的对照小鼠相比，用噬菌体处理的、具有阴沟肠杆菌菌株b29定殖的肠道微生物组的小鼠体重增加停滞的图示。

图3是显示设计用于测量噬菌体处理功效的研究的图示，所述噬菌体处理在暴露于阴沟肠杆菌菌株b29之前、在暴露于阴沟肠杆菌菌株b29之后但在肥胖症发生之前、以及在由于阴沟肠杆菌菌株b29对肠道微生物群的定殖而发生肥胖症之后施用。

具体实施方式

根据需要，本文公开了本公开的详细实施方案；然而，应该理解，所公开的实施方案仅仅是示例性的，并且可以以多种形式和替代形式实施。附图不一定按比例；某些特征可能被扩大或最小化以显示特定组件的细节。因此，本文公开的具体结构和功能细节不应被解释为限制性的，而仅仅作为用于教导本领域技术人员的代表性基础。

除了在实施例中或另外明确指出之外，本说明书中表示反应和/或用途的条件或材料的量的所有数值应理解为由“约”修饰。首字母缩写或其他缩写的第一个定义适用于本文相同缩写的所有后续用法，并经必要的变更适用于最初定义的缩写的正常语法变体。并且，除非另有明确说明，否则性能的测量是通过之前或之后引用的用于相同性能的相同技术确定的。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

还应理解，本公开不限于下面描述的具体实施方案和方法，因为具体的组分和/或条件当然可以变化。此外，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案，并不旨在以任何方式进行限制。

还必须注意，如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。例如，以单数形式对组分的引用旨在包括多个组分。

术语“或”与“和”可以互换使用，并且可以理解为表示“和/或”。

术语“包含”与“包括”、“具有”、“含有”或“由......表征”同义。这些术语是包含性的和开放式的，并且不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。

短语“由......组成”排除了权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。当该短语出现在权利要求主体的条款中，而不是紧接在序言之后时，它仅限制该条款中规定的要素；其他要素不被排除在整个权利要求之外。

短语“基本上由......组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤，以及不会实质上影响所要求保护的主题的基本和新颖特征的那些材料或步骤。

可以替代地使用术语“包含”、“由......组成”和“基本上由......组成”。当使用这三个术语中的一个时，当前公开和要求保护的主题可以包括使用其他两个术语中的任一个。

术语“多个”和“至少两个”可互换使用。

术语“病原体”应理解为意指能够成为受试者的微生物组的一部分并且能够在成为微生物组的一部分时诱导肥胖症、炎症和/或肥胖症相关的代谢病症的任何微生物，例如细菌、真菌或原生生物。

术语“微生物组”是指在特定环境中的微生物(细菌、真菌、原生生物)、它们的遗传元件(基因组)的总体。微生物组可以是肠道微生物组(gutmicrobiome)(即，肠道微生物组(intestinalmicrobiome))。

除非另有说明，否则术语“噬菌体(bacteriophage)”和“噬菌体(phage)”可互换使用，并且可包括天然存在的噬菌体和重组的噬菌体。或者，术语“噬菌体”可以指能够感染真菌或原生生物的病毒。“天然存在的”噬菌体是从天然或人造环境中分离的、未经基因工程修饰的噬菌体。“重组噬菌体”是包含通过将异源核酸序列插入基因组或从基因组中去除核酸序列而进行遗传修饰的基因组的噬菌体。在一些实施方案中，天然存在的噬菌体的基因组通过重组dna技术修饰以将异源核酸序列引入基因组的确定位点。在其他实施方案中，天然存在的噬菌体的基因组通过重组dna技术修饰以去除例如编码毒素的核酸序列。

术语“菌株”是指微生物或噬菌体，具有其在本领域中使用的常规含义，即通常是指示微生物(在确定的物种内)或噬菌体(在确定的物种内)的遗传变体或亚型的低分类学等级。最可能但非必要的是，不同菌株的噬菌体对于细菌的不同菌株的感染具有不同的特异性。

术语“多核苷酸”、“核苷酸”或“核苷酸序列”在本公开中可互换使用。它们是指任意长度的聚合形式的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，或其类似物。多核苷酸可以具有任意三维结构，并且可以执行已知或未知的任意功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：单链、双链或多链dna或rna、基因组dna、cdna、dna-rna杂合体或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。如适用于所描述的实施方案的，术语“多核苷酸”和“核酸”应理解为包括单链(例如正义或反义链)和双链多核苷酸。多核苷酸可包含一种或多种修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸序列可被非核苷酸组分中断。

如本文所用的术语“肽”或“蛋白质”是指任何肽、寡肽、多肽、基因产物、表达产物或蛋白质。肽由连续的氨基酸组成。术语“肽”或“蛋白质”包括天然存在的或合成的分子。

术语“序列同一性”或“同一性”是指，如通过序列比较算法或通过视觉检查所测量的，当在指定的比较窗口内比对以获得最大对应性时，两个核酸序列或氨基酸序列中的指定百分比的残基是相同的。当序列在保守取代方面不同时，可以向上调整序列同一性百分比以校正取代的保守性质。差别在于这种保守取代的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调节的方法是本领域技术人员所熟知的。通常，这涉及将保守取代评分为部分错配而非完全错配，从而增加序列同一性百分比。

术语“治疗”是指降低疾病或病症的一种或多种症状特征；降低疾病或病症的进展速度；从疾病或病症中恢复、从疾病或病症中治愈、维持缓解和预防，例如预防复发。

术语“受试者”是指任何哺乳动物物种的任何哺乳动物受试者的受试者，例如但不限于人、狗、猫、马、啮齿动物、任何家养动物或任何野生动物。

术语“‘#’病原体”，其中“#”包括例如第一、第二、第三或第四，可以理解为意指“‘#’或更多不同的病原体”。例如，第四病原体可以理解为意指四种或更多种不同的病原体。

在各种实施方案中公开的本公开内容涉及用噬菌体治疗肥胖症、炎症或肥胖症相关代谢病症的方法和组合物以及制备该组合物的方法。噬菌体是通过利用一些或所有宿主生物合成装置(machinery)在细菌内繁殖的细胞内寄生生物。噬菌体通常含有核酸和蛋白质，并且可以被脂质膜覆盖。噬菌体的描述可以在美国专利号9,617,522中找到，其公开内容通过引用整体并入本文。

最近的研究表明，肠道微生物群的生态失调(不平衡)会促进肥胖症^11,12，并且正在鉴定致病细菌菌株。它们似乎通过增加会损害胰岛素反应性的全身的低水平炎症来促进肥胖症^13,14,15。有些还可能增加从食物获取和储存能量。从肥胖人的肠道分离的革兰氏阴性条件致病菌阴沟肠杆菌菌株b29是第一个在移植到无菌小鼠中时显示会导致肥胖症的人肠道细菌¹。特别是，使用koch假设进行的研究显示，阴沟肠杆菌菌株b29在其宿主中引起肥胖症和慢性炎症¹。研究还显示，肥胖人^16,17和2型糖尿病女性¹⁸的肠道微生物群中的多枝梭菌(clostridiumramosum)浓度升高。当移植到无菌小鼠体内时，多枝梭菌也会诱发肥胖症¹⁹。目前正在进行与另外两种致胖(obesogenic)人肠道细菌相关的进一步研究。研究还表明，由于这些肥胖型肠道微生物群的持续存在，节食诱导的体重减轻后体重迅速恢复²⁰。该研究²⁰强调肠道微生物群的组成对变化具有抗性。节食可以导致暂时的体重减轻，而不会在肠道微生物群中产生结构性变化。益生菌食品和药丸也不太可能产生持久的变化，因为已经在肠道生态系统中稳定建立的细菌物种比新引进的物种具有强大的优势。

为了解决这些问题，如在不同实施方案中所述的本公开内容靶向并消除了有害的、促进肥胖症(致胖)的肠道微生物。通过消除这些肠道微生物，为有益细菌的繁殖创造了生态空间。这改善了肠道微生物群的平衡。沿着这些方面，如在不同实施方案中描述的本公开可以例如作为营养补充剂销售。

各种实施方案的组合物和方法包括噬菌体。噬菌体(噬菌体)是通过在细胞表面上的特定且独特的结合位点上结合而感染细菌的病毒。噬菌体这种特异性地杀死细菌而不感染人体细胞或不杀死非靶细菌的能力使它们成为从肠道消除病原菌(例如阴沟肠杆菌b29或多枝梭菌)以创造更多的生态空间从而使有益细菌可以繁殖的潜在选择。与广谱抗生素不同，每种噬菌体只能杀死特定细菌，因此可以仅根除肠道中的病原菌(如阴沟肠杆菌b29或多枝梭菌)，而使有益细菌(益生菌)繁殖，从而治疗肥胖症、炎症和/或肥胖症相关的代谢病症。

在多种实施方案中，公开了用于改变受试者的肠道微生物组以治疗肥胖症、炎症或肥胖症相关代谢病症的组合物，其包括有效降低受试者的肠道微生物组中的病原体的浓度的一定量的噬菌体株和药学上可接受的赋形剂，其中所述病原体的浓度诱导肥胖症、炎症或肥胖症相关的代谢病症，并且噬菌体株具有对病原体的物种特异的感染性。多种实施方案的一定量的噬菌体株可有效降低受试者的肠道微生物组中的病原体产生的内毒素浓度。

在多种实施方案中，病原体能够诱导肥胖症、炎症或肥胖症相关代谢病症。多种实施方案的病原体的实例包括属于肠杆菌属的病原体，例如阴沟肠杆菌菌株b29，或属于梭菌属的病原体，其包括如多枝梭菌的病原体。多种实施方案的病原体可产生内毒素，例如诱导肥胖症、炎症或肥胖症相关代谢病症的脂多糖，或者病原体可增加从食物中获取或储存能量。

各种实施方案的噬菌体的实例包括肌尾噬菌体科(myoviridae)(t4样病毒；p1样病毒；p2样病毒；mu样病毒；spo1样病毒；phih样病毒)；长尾噬菌体科(siphoviridae)(λ样病毒、γ样病毒、t1样病毒；t5样病毒；c2样病毒；l5样病毒；.psi.m1样病毒；phic31样病毒；n15样病毒)；短尾噬菌体科(podoviridae)(t7样病毒；phi29样病毒；p22样病毒；n4样病毒)；复层噬菌体科(tectiviridae)(复层噬菌体属(tectivirus))；覆盖噬菌体科(corticoviridae)(覆盖噬菌体属(corticovirus))；脂毛噬菌体科(lipothrixviridae)(α脂毛噬菌体属(alphalipothrixvirus)、β脂毛噬菌体属(betalipothrixvirus)、γ脂毛噬菌体属(gammalipothrixvirus)、δ脂毛噬菌体属(deltalipothrixvirus))；芽生噬菌体科(plasmaviridae)(芽生噬菌体属(plasmavirus))；古噬菌体科(rudiviridae)(古噬菌体属(rudivirus))；微小纺锤形噬菌体科(fuselloviridae)(微小纺锤形噬菌体属(fusellovirus))；丝状噬菌体科(inoviridae)(丝状噬菌体属(inovirus)、短杆状噬菌体属(plectrovirus)、m13样病毒、fd样病毒)；微小噬菌体科(microviridae)(微小噬菌体属(microvirus)、螺旋体微小噬菌体属(spiromicrovirus)、蛭弧菌微小噬菌体属(bdellomicrovirus)、衣原体微小噬菌体属(chlamydiamicrovirus))；光滑噬菌体科(leviviridae)(光滑噬菌体属(levivirus)、异光滑噬菌体属(allolevivirus))；囊状噬菌体科(cystoviridae)(囊状噬菌体属(cystovirus))；瓶状病毒科(ampullaviridae)；双尾病毒科(bicaudaviridae)；clavaviridae；球状病毒科(globuloviridae)；以及滴状病毒属(guttavirus)。在多种实施方案中，噬菌体株不能感染所述病原体以外的其它微生物或细胞或来自所述病原体的物种的其他病原体。

在多种实施方案中，噬菌体通过感染和裂解病原体来降低病原体的浓度。通过感染病原体或病原体物种特有的结合位点或表面受体来实现多种实施方案的感染。

多种实施方案的噬菌体株是病原体的裂解噬菌体，所述病原体在被感染时在一段时间或甚至更多时间内不会对噬菌体株产生抗性。在多种实施方案中，所述时间包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48小时或无限期。在多种实施方案中，所述时间选自上述任意两个时间之间。

多种实施方案的噬菌体株不具有编码细菌毒素和/或毒力因子(包括例如霍乱毒素、肉毒杆菌毒素和白喉毒素)的基因。毒素或毒力因子包括与例如白喉、霍乱、痢疾、肉毒中毒、食物中毒、烫伤皮肤综合征、坏死性肺炎或猩红热相关的毒素或毒力因子。多种实施方案的噬菌体株是能够感染和裂解病原体的分离的噬菌体株的突变或重组噬菌体株。例如，通过将分离的噬菌体株暴露于诱变剂(如化学诱变剂)或电磁辐射来制备多种实施方案的突变体。通过将多核苷酸插入分离的噬菌体株的基因组中来制备多种实施方案的重组噬菌体株，其中所述多核苷酸编码抗菌蛋白质或治疗性蛋白质。抗菌蛋白质和治疗性蛋白质的实例公开于pct申请公开号wo2018/174810和wo2018/030323中，其公开内容通过引用整体并入本文。在另一个实例中，多种实施方案的噬菌体株的基因组与分离的噬菌体株(如肌尾噬菌体科pg7)的同一性不超过50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。多种实施方案的噬菌体基因组与分离的噬菌体株的相似性百分比选自上述任意两个百分比之间。

多种实施方案的噬菌体株对于掺入到多种食品和药物组合物中而言是稳定的，并且能有效地接触和感染在受试者(例如人、犬科动物、猫科动物等)的肠道中定殖的微生物(例如阴沟肠杆菌)。在多种实施方案中，每克或每毫升各种组合物中噬菌体株的量包括、包括多于或包括少于10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁵、10¹⁶、10¹⁷、10¹⁸、10¹⁹以及10²⁰个噬菌斑形成单位。在多种实施方案中，每克或毫升的噬菌斑形成单位选自上述任意两点之间。

在多种实施方案中，噬菌体株以任意方式制备，作为药物、食品、饲料添加剂或液体添加剂的组分掺入，并且可以是各种形式，例如液态或干燥状态(包括粉末)。在其他实施例中，多种实施方案的噬菌体株通过空气干燥方法、自然干燥方法、喷雾干燥方法、冷冻干燥方法等干燥。噬菌体株的制备也可用于增强组合物的性质，包括稳定性。术语“食品”应理解为在加工、部分加工或未加工状态下旨在或合理预期由人摄取的任意物质或产品。“食品”还可以包括饮料、口香糖和任意物质——包括在制造、制备或处理期间有意添加到食品中的水。术语“饲料”应理解为涵盖所有形式的动物食物。食品也可以用作饲料。术语“药物”应理解为涵盖物质或物质组合物，其用作具有治愈或预防人或动物疾病性质的药剂，或者其可用于人体或动物体内或之上或施用于人或动物，以通过药理学、免疫学或代谢作用恢复、纠正或影响人或动物生理功能，或产生医学诊断。药物可用于非治疗性目的，特别是化妆用目的。

在各种实施方案中，公开了包括任意实施方案的化合物的药物组合物，其中所述药物组合物是凝胶胶囊、片剂、丸剂、锭剂、胶囊、微胶囊、液体或糖浆。

在多种实施方案中，公开了包括任意实施方案的组合物的口服产品，其中所述口服产品是半固体食品、固体食品、半固体或固体的可匙取的食品、糖果、饮料或乳制品。多种实施方案的乳制品是冰淇淋、牛奶、奶粉、酸奶、开菲尔(kefir)或夸克(quark)。

在多种实施方案中，公开了制备多种实施方案的组合物的方法，其包括：通过将病原体暴露于噬菌体株并检测病原体的感染或裂解来表征噬菌体株；以及，当检测到病原体的感染或裂解时，将噬菌体株与药学上可接受的赋形剂组合。在多种实施方案中，所述表征包括将来自病原体的物种的第二病原体暴露于噬菌体株并检测该第二病原体的感染或裂解，并且所述组合包括当检测到该第二病原体被噬菌体株感染或裂解时，将噬菌体株与药学上可接受的赋形剂组合。在其他的实施方案中，所述表征包括将与病原体的物种不同的物种的第二病原体暴露于噬菌体株并检测该第二病原体的感染或裂解，并且所述组合包括当没有检测到该第二病原体被噬菌体株感染或裂解时，将噬菌体株与药学上可接受的赋形剂组合。例如，使用病原体和有益微生物来表征噬菌体株。此外，所述第二病原体应理解为至少两种不同的病原体。

当施用时，多种实施方案的组合物用于降低不同和多种病原体菌株、病原体物种和病原体属的浓度。多种实施方案的组合物包括用于病原体或病原体物种或多种不同病原体的多种噬菌体株。

在多种实施方案中，组合物包含至少两种不同的噬菌体株，其中每种噬菌体株具有对病原体物种特异的感染性。在各种实施方案中，不同噬菌体株的数量包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20种不同的噬菌体株。在多种实施方案中，不同噬菌体株的数量选自上述任意两点之间。对于多种实施方案的至少两种不同的噬菌体株，每种噬菌体株的基因组与其他噬菌体株的基因组的核苷酸序列同一性小于100％，或与其他噬菌体株的基因组的核苷酸序列同一性小于50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在多种实施方案中，核苷酸序列同一性是上文列出的任意两个百分比之间的范围。

在多种实施方案中，公开了制备具有至少两种不同噬菌体株的组合物的方法，其包括：通过将病原体分别暴露于每种噬菌体株并检测病原体的感染或裂解来表征噬菌体株；从感染或裂解病原体的噬菌体株中选择至少两种不同的噬菌体株；以及将该至少两种不同的噬菌体株与药学上可接受的赋形剂组合。

在多种实施方案中，组合物包括一定量的第二噬菌体株，其有效降低受试者的肠道微生物组内的、与病原体的物种不同的物种的第二病原体的浓度，其中第二病原体诱导肥胖症、炎症或者与肥胖症相关的代谢病症，并且第二噬菌体株具有对第二病原体的物种特异的感染性。一定量的第二噬菌体株也应理解为是指具有一定量的多种噬菌体株的多种实施方案的组合物，其中多种噬菌体株中的每一种具有对不同病原体和不同病原体的物种特异的感染性。例如，组合物具有一定量的或多于1、2、3、4、5、6、7或8种不同的噬菌体株，其中每种噬菌体株具有对不同病原体和不同病原体的物种特异的感染性。在多种实施方案中，对不同病原体特异的噬菌体株的数量是上文列出的任意两个数字之间的范围。而且，对多种实施方案的不同病原体特异的每种噬菌体株包括至少两种或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同的噬菌体株。在多种实施方案中，对病原体特异的不同噬菌体株的数量是上文列出的任意两个数字之间的范围。在多种实施方案中，每种噬菌体株的基因组与其他噬菌体株的基因组的核苷酸序列同一性小于100％，或与其他噬菌体株的基因组的核苷酸序列同一性小于50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在多种实施方案中，核苷酸序列同一性是上文列出的任何两个百分比之间的范围。

多种实施方案的组合物是对第一病原体、第二病原体、第三病原体和第四病原体的物种特异的噬菌体株的鸡尾酒(cocktail)，其中每种病原体与其他病原体不同。例如，第一病原体可以来自阴沟肠杆菌物种，第二病原体可以来自多枝梭菌物种。应理解，第四病原体应理解为意指四种或更多种不同的病原体。同样对于每种病原体，不同噬菌体株的数量包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同的噬菌体株。在一个实施例中，所述组合物包括：含有1至20种不同噬菌体株的鸡尾酒，其具有对第一病原体的物种特异的感染性；含有1至20种不同噬菌体株的鸡尾酒，其具有对第二病原体的物种特异的感染性；含有1至20种不同噬菌体株的鸡尾酒，其具有对第三病原体的物种特异的感染性；含有1至20种不同噬菌体株的鸡尾酒，其具有对第四病原体的物种特异的感染性；以及，任选地，含有1至20种不同噬菌体株的另外的(多种)鸡尾酒，其具有对另外的(多种)病原体的物种特异的一种或多种感染性。

如在多种实施方案中公开的以下内容强调了具有不同噬菌体株的组合物。

在多种实施方案中，组合物包括一定量的第二噬菌体株，其有效降低受试者的肠道微生物组内的、与病原体的物种不同的物种的第二病原体的浓度，其中第二病原体诱导肥胖症、炎症或者与肥胖症相关的代谢病症，并且第二噬菌体株具有对第二病原体的物种特异的感染性。在多种实施方案中，公开了制备多种实施方案的组合物的方法，其包括：通过将病原体暴露于噬菌体株并检测病原体的感染或裂解来表征噬菌体株；通过将第二病原体暴露于第二噬菌体株并检测第二病原体的感染或裂解来表征第二噬菌体株；以及当检测到病原体和第二病原体的感染或裂解时，将噬菌体株和第二噬菌体株与药学上可接受的赋形剂组合。

在多种实施方案中，组合物包括一定量的第三噬菌体株，其有效降低受试者的肠道微生物组内与病原体和第二病原体的物种不同的物种的第三病原体的浓度，其中第三病原体诱导肥胖症、炎症或者与肥胖症相关的代谢病症，并且第三噬菌体株具有对第三病原体的物种特异的感染性。在多种实施方案中公开了制备多种实施方案的组合物的方法，其包括：通过将病原体暴露于噬菌体株并检测病原体的感染或裂解来表征噬菌体株；通过将第二病原体暴露于第二噬菌体株并检测第二病原体的感染或裂解来表征第二噬菌体株；通过将第三病原体暴露于第三噬菌体株并检测第三病原体的感染或裂解来表征第三噬菌体株；以及当检测到病原体、第二病原体和第三病原体的感染或裂解时，将噬菌体株、第二噬菌体株和第三噬菌体株与药学上可接受的赋形剂组合。

在多种实施方案中，组合物包括一定量的第四噬菌体株，其有效降低受试者的肠道微生物组内与病原体、第二病原体和第三病原体的物种不同的物种的第四病原体的浓度，其中第四病原体诱导肥胖症、炎症或者与肥胖症相关的代谢病症，并且第四噬菌体株具有对第四病原体的物种特异的感染性。如之前所强调的，第四病原体应理解为意指四种或更多种不同的病原体。在多种实施方案中公开了制备多种实施方案的组合物的方法，其包括：通过将病原体暴露于噬菌体株并检测病原体的感染或裂解来表征噬菌体株；通过将第二病原体暴露于第二噬菌体株并检测第二病原体的感染或裂解来表征第二噬菌体株；通过将第三病原体暴露于第三噬菌体株并检测第三病原体的感染或裂解来表征第三噬菌体株；通过将第四病原体暴露于第四噬菌体株并检测第四病原体的感染或裂解来表征第四噬菌体株；以及当检测到病原体、第二病原体、第三病原体和第四病原体的感染或裂解时，将噬菌体株、第二噬菌体株、第三噬菌体株和第四噬菌体株与药学上可接受的赋形剂组合。

在多种实施方案中，药学上可接受的赋形剂是适合口服的载体。载体的实例包括二氧化硅(硅石、硅胶)、碳水化合物或碳水化合物聚合物(多糖)、环糊精、淀粉、降解淀粉(淀粉水解物)、化学或物理改性淀粉、改性纤维素、阿拉伯树胶、印度胶、黄蓍胶、刺梧桐胶、角叉菜胶、瓜尔胶、刺槐豆胶、藻酸盐、果胶、菊粉或黄原胶、或麦芽糖糊精和糊精的水解产物。在多种实施方案中，噬菌体株分散在整个载体中。

在多种实施方案中，药学上可接受的赋形剂能够将至少一部分量的噬菌体株以活性状态递送到受试者的肠道微生物组，使得至少一部分量的噬菌体株能够感染和裂解病原体。

在多种实施方案中，药学上可接受的赋形剂包括延长释放相(extendedreleasephase)，其能够在一段时间内将至少一部分量的噬菌体株释放到受试者的肠道微生物组。在其他实施方案中，药学上可接受的赋形剂包括立即释放相(immediatereleasephase)，其能够基本上立即将至少一部分量的噬菌体株释放到受试者的肠道微生物组。

在多种实施方案中，组合物包括能够定殖受试者的肠道微生物组的益生菌微生物或能够刺激具有有益性质的微生物生长的物质。益生菌微生物的实例包括：乳杆菌(lactobacillus)如植物乳杆菌(l.plantarum)、副干酪乳杆菌(l.paracasei)、嗜酸乳杆菌(l.acidophilus)、干酪乳杆菌(l.casei)、鼠李糖乳杆菌(l.rhamnosus)、卷曲乳杆菌(l.crispatus)、格式乳杆菌(l.gasseri)、洛德乳杆菌(l.reuteri)、保加利亚乳杆菌(l.bulgaricus)；双歧杆菌(bifidobacterium)如长双歧杆菌(b.longum)、齿双歧杆菌(b.catenulatum)、短双歧杆菌(b.breve)、动物双歧杆菌(b.animalis)、比菲德氏菌(b.bifidum)；链球菌(streptococcus)如血链球菌(s.sanguis)、口腔链球菌(s.oralis)、缓症链球菌(s.mitis)、嗜热链球菌(s.thermophilus)、唾液链球菌(s.salivarius)；芽孢杆菌(bacillus)如凝结芽孢杆菌(b.coagulans)、枯草芽孢杆菌(b.subtilis)、侧孢短芽胞杆菌(b.laterosporus)；乳球菌(lactococcus)如乳酸乳球菌(l.lactis)；肠球菌(enterococcus)如粪肠球菌(e.faecium)；片球菌(pediococcus)如乳酸片球菌(p.acidilactici)；丙酸杆菌(propionibacterium)如詹氏丙酸杆菌(p.jensenii)、费氏丙酸杆菌(p.freudenreichii)；消化链球菌(peptostreptococcus)如产生消化链球菌(p.productus)；以及酿酒酵母(saccharomyces)如布拉酵母菌(s.boulardii)。

在多种实施方案中，公开了用于改变受试者的肠道微生物组以治疗肥胖症、炎症或与肥胖症相关的代谢病症的方法，其包括：向具有如下的肠道微生物组的受试者施用一定量的噬菌体株，所述肠道微生物组具有诱导肥胖症、炎症或与肥胖症相关的代谢病症的一定浓度的病原体，其中该一定量的噬菌体株降低了病原体的浓度，并且噬菌体株具有对病原体的物种特异的感染性。多种实施方案的噬菌体株是至少两种不同的噬菌体株，其中每种噬菌体株具有对病原体的物种特异的感染性。

施用时多种实施方案的一定量的噬菌体株将病原体的浓度降低或至少降低1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在多种实施方案中，一定量的噬菌体株将病原体的浓度降低上述任意两个百分比之间的百分比。

施用时多种实施方案的一定量的噬菌体株将炎症降低或至少降低1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在多种实施方案中，一定量的噬菌体株将受试者的炎症降低上述任意两个百分比之间的百分比。炎症的降低包括，例如，各种炎性因子的降低，所述炎性因子例如细胞因子、趋化因子、类二十烷酸等。

当施用时多种实施方案的一定量的噬菌体株优选地使受试者的体重降低或至少降低11％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在多种实施方案中，一定量的噬菌体株将受试者的体重降低上述任意两个百分比之间的百分比。

在多种实施方案中，噬菌体株的施用用于治疗例如慢性疾病，例如糖尿病、心脏病发作、中风和癌症。

在多种实施方案中，噬菌体株的施用用于治疗肥胖症相关的代谢病症，包括例如胰岛素不敏感、2型糖尿病、肝脏脂肪变性(脂肪肝病)、动脉粥样硬化、心脏病和癌症。

在多种实施方案中，施用包括向具有如下的肠道微生物组的受试者施用一定量的第二噬菌体株，所述肠道微生物组具有一定浓度的第二病原体，所述第二病原体的物种与所述病原体的物种不同，并诱导肥胖症、炎症或肥胖症相关的代谢病症，其中所述一定量的第二噬菌体株降低第二病原体的浓度，并且第二噬菌体株具有对第二病原体的物种特异的感染性。一定量的第二噬菌体株也应理解为是指具有一定量的多种噬菌体株的多种实施方案的组合物，其中多种噬菌体株中的每一种具有对不同病原体和不同病原体的物种特异的感染性。

在多种实施方案中，施用包括向具有如下的肠道微生物组的受试者施用一定量的第三噬菌体株，所述肠道微生物组具有一定浓度的第三病原体，所述第三病原体的物种与所述病原体和所述第二病原体的物种不同，并诱导肥胖症、炎症或肥胖症相关的代谢病症，其中所述一定量的第三噬菌体株降低第三病原体的浓度，并且第三噬菌体株具有对第三病原体的物种特异的感染性。

在多种实施方案中，施用包括向具有如下肠道微生物组的受试者施用一定量的第四噬菌体株，所述肠道微生物组具有一定浓度的第四病原体，所述第四病原体的物种与所述病原体、所述第二病原体和所述第三病原体的物种不同，并诱导肥胖症、炎症或肥胖症相关的代谢病症，其中所述一定量的第四噬菌体株降低第四病原体的浓度，并且第四噬菌体株具有对第四病原体的物种特异的感染性。如之前所强调的，第四病原体应理解为意指四种或更多种不同的病原体。

在多种实施方案中，公开了用于制备用于改变受试者的肠道微生物组以治疗肥胖症、炎症或肥胖症相关的代谢病症的组合物的方法，所述方法包括：鉴定病原体，其中受试者的肠道微生物组中的一定浓度的该病原体诱导肥胖症、炎症或肥胖症相关的代谢病症；通过将该病原体暴露于噬菌体株并检测病原体的感染或裂解来表征噬菌体株；以及当检测到病原体的感染或裂解时，通过将噬菌体株与药学上可接受的赋形剂组合，来制备用于改变受试者肠道微生物组以治疗肥胖症、炎症或肥胖症相关的代谢病症的组合物。在多种实施方案中，噬菌体株是多种不同的噬菌体株，所述表征包括通过将病原体分别暴露于每种噬菌体株并检测病原体的感染或裂解来表征每种噬菌体株，并且所述制备包括将感染或裂解病原体的至少两种不同的噬菌体株与药学上可接受的赋形剂组合。多种实施方案的方法包括分离病原体或噬菌体株。

在多种实施方案中，所述表征包括将来自病原体的物种的第二病原体暴露于噬菌体株并检测该第二病原体的感染或裂解，并且所述组合包括当检测到该第二病原体的感染或裂解时，将噬菌体株与药学上可接受的赋形剂组合。在其他的实施方案中，所述表征包括将来自与病原体的物种不同的物种的至少一种第二病原体暴露于噬菌体株并检测该第二病原体的感染或裂解，并且所述组合包括当没有检测到该第二病原体被噬菌体株感染或裂解时，将噬菌体株与药学上可接受的赋形剂组合。例如，使用病原体和有益微生物来表征噬菌体株。此外，所述第二病原体应理解为至少两种不同的病原体。

多种实施方案的方法包括：鉴定与病原体不同的物种的第二病原体，其中受试者的肠道微生物组中一定浓度的第二病原体诱导肥胖症、炎症或肥胖症相关的代谢病症；并且通过将第二病原体暴露于第二噬菌体株并检测第二病原体的感染或裂解来表征第二噬菌体株；其中制备包括当检测到第二病原体的感染或裂解时，将第二噬菌体株与噬菌体株和药学上可接受的赋形剂组合。多种实施方案的第二噬菌体株也应理解为是指多种噬菌体株，其中多种噬菌体株中的每一种都具有对不同病原体和不同病原体的物种特异的感染性。在多种实施方案中，第二噬菌体株是多种不同的第二噬菌体株，第二噬菌体株的表征包括通过将第二病原体分别暴露于每种第二噬菌体株并检测第二病原体的感染或裂解来表征每种第二噬菌体株，并且制备包括将感染或裂解第二病原体的至少两种不同的第二噬菌体株与噬菌体株和药学上可接受的赋形剂组合。

多种实施方案的方法包括：鉴定与病原体和第二病原体不同的物种的第三病原体，其中受试者的肠道微生物组中一定浓度的第三病原体诱导肥胖症、炎症或肥胖症相关的代谢病症；并且通过将第三病原体暴露于第三噬菌体株并检测第三病原体的感染或裂解来表征第三噬菌体株；其中制备包括当检测到第三病原体的感染或裂解时，将第三噬菌体株与第二噬菌体株、噬菌体株和药学上可接受的赋形剂组合。在多种实施方案中，第三噬菌体株是多种不同的第三噬菌体株，第三噬菌体株的表征包括通过将第三病原体分别暴露于每种第三噬菌体株并检测第三病原体的感染或裂解来表征每种第三噬菌体株，并且制备包括将感染或裂解第三病原体的至少两种不同的第三噬菌体株与第二噬菌体株、噬菌体株和药学上可接受的赋形剂组合。

多种实施方案的方法包括：鉴定与病原体、第二病原体和第三病原体不同的物种的第四病原体，其中受试者的肠道微生物组中一定浓度的第四病原体诱导肥胖症、炎症或肥胖症相关的代谢病症；并且通过将第四病原体暴露于第四噬菌体株并检测第四病原体的感染或裂解来表征第四噬菌体株；其中制备包括当检测到第四病原体的感染或裂解时，将第四噬菌体株与第三噬菌体株、第二噬菌体株、噬菌体株和药学上可接受的赋形剂组合。如之前所强调的，第四病原体应理解为意指四种或更多种不同的病原体。在多种实施方案中，第四噬菌体株是多种不同的第四噬菌体株，第四噬菌体株的表征包括通过将第四病原体分别暴露于每种第四噬菌体株并检测第四病原体的感染或裂解来表征每种第四噬菌体株，并且制备包括将感染或裂解第四病原体的至少两种不同的第四噬菌体株与第三噬菌体株、第二噬菌体株、噬菌体株和药学上可接受的赋形剂组合。

以下实施例说明了本发明的多种实施方案。本领域技术人员将认识到在本发明的精神和权利要求的范围内的许多变化。

实施例1

裂解活性测定

从盐湖城和犹他州当地的污水处理厂分离出13种噬菌体。还获得了阴沟肠杆菌菌株b29。通过使用噬斑测定法感染阴沟肠杆菌菌株b29来分析这些菌株。图1a、1b、1c、1d、1e、1f、1g、1h和1i是显示噬菌体株(pr1、pp1、pp2、r1、r2、tssd-c、tssd-g、ori和mri)对阴沟肠杆菌菌株b29的裂解活性的图示。如图1a-1i所示，以100的moi进行的裂解活性测定显示，许多噬菌体株对阴沟肠杆菌菌株b29具有强烈裂解性，并且可用于杀死肠道中的阴沟肠杆菌。

实施例2

噬菌体分离

从污水处理机构收集环境样品，并通过与阴沟肠杆菌菌株b29生长两天来富集。然后将培养物离心并过滤以除去碎片和细菌并分离噬菌体。通过噬斑形成测定法使滤液经过三轮纯化。纯化后，分离噬菌体基因组dna并测序，并通过生物信息学方法组装基因组。通过使用blast搜索与现有数据库的比较确定噬菌体是新的，并且发现所有噬菌体与数据库中最接近的相关噬菌体具有不超过99％的同一性。使用geparddotplotter2对2(two-by-two)比较基因组相关性，并且证实这些噬菌体彼此不相同或与现有基因组数据库中的任何噬菌体不相同。鉴定的所有裂解噬菌体的基因组都被全面地注释，其中特别注意鉴定可能存在于噬菌体基因组中的任意毒素基因。只有不含毒素基因的噬菌体才被考虑用于后续治疗性鸡尾酒的开发。

肠道生存能力测试

噬菌体(或噬菌体)是可以感染和裂解细菌而不感染和裂解其他种类细胞的病毒。因为它们没有感染人体细胞的能力，所以它们被认为是抗生素的潜在治疗替代品，用于治疗人类肠道微生物群的特定细菌感染和生态失调。最近已显示肠道微生物群的生态失调在肥胖症的发展中起重要作用。一个目标是分离具有针对已被证明在人和小鼠模型中引起肥胖症的细菌物种(阴沟肠杆菌菌株b29)的特异性和靶向裂解活性的噬菌体，以便最终开发可抑制肠道中的这种细菌生长的噬菌体鸡尾酒。我们通过噬斑形成测定从环境样品中分离出几种具有针对该细菌的裂解活性的噬菌体株。正在努力分离代表广泛噬菌体家族和裂解活性的更多噬菌体。然而，为了将这些噬菌体视为潜在的治疗剂，我们证明它们可以在胃肠道条件中存活。该方案的目的是通过口服灌胃法对小鼠施用噬菌体溶液，然后收集粪便样品以测量噬菌体浓度，从而测量我们的各种噬菌体分离物的噬菌体存活能力。通过这些测试显示的在消化道中存活的噬菌体被考虑用于随后的治疗性鸡尾酒的开发。

对于每种待测试的噬菌体，购买雄性c57小鼠(6周龄)并分成阴性对照组(n＝3)和测试组(n＝7)。通过口服灌胃法给予对照组无菌luria培养液(lb)(0.2ml)一次。通过口服灌胃法给予测试组10¹⁰pfu/ml(在0.2mllb培养液中)噬菌体一次。该剂量的噬菌体是基于majewska²¹的在先出版物(其通过引用并入)选择的，其测量了c57/b16小鼠消化道中不同噬菌体的存活力，其证明2x10¹⁰噬菌体的剂量足以通过标准噬斑试验检测噬菌体存活。使噬菌体在宿主细菌中生长并从宿主细菌中纯化，并且通过标准噬斑试验测定滴度，然后将噬菌体在luria培养液中稀释至规定浓度。在口服灌胃前，立即从所有小鼠收集粪便样品。还每6小时从所有小鼠收集粪便样品直至口服灌胃后第24小时。收集后立即将每个粪便样品重悬于磷酸盐缓冲盐水中，并通过0.45um过滤器过滤以分离噬菌体。在标准噬斑形成测定中，过滤的溶液与宿主细菌一起生长，以计算粪便样品中的噬菌体浓度，并从而确定噬菌体在消化道中的存活情况。表1显示了9种阴沟肠杆菌菌株b29噬菌体在通过小鼠胃肠道后的存活能力。例如，如表1所示，多种不同的噬菌体能够在消化道内存活一段延长的时间。

表1

裂解活性测定

温和噬菌体经历溶原状态并整合到宿主基因组中。相反，裂解噬菌体在宿主细胞内复制然后使宿主细胞破裂，摧毁它。我们需要裂解噬菌体用于我们的目的。为了鉴定裂解噬菌体，将阴沟肠杆菌菌株b29从过夜培养物稀释至浓度为10⁶cfu/ml，并用浓度为10⁸pfu/ml的噬菌体接种，得到100的感染复数(moi)。从烧瓶中取出1ml样品，立即连续稀释，并在lb-琼脂上铺展用于过夜培养。第二天通过菌落计数确定存活细菌的数量。在接种后的最初的12小时内每2小时从培养物中取出另外1ml样品，然后在接种后第24小时再次取出，以检测噬菌体是否是裂解性的并检测细菌在最初24小时内是否产生抗性(图1)。

通过测量其裂解一系列细菌(从关系密切的细菌菌株到关系疏远的细菌菌株)的能力来测试每种噬菌体株的靶特异性。例如，表2和3说明了基于它们裂解阴沟肠杆菌菌株b29的能力最初分离的9种噬菌体株的宿主范围测试。将每种噬菌体针对另外两种阴沟肠杆菌菌株atcc13047和23855，以及关系更疏远的鲍氏志贺氏菌(shigellaboydiiewing)、肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、大肠杆菌(escherichiacoli)、粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)和铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)进行测试。通过将100μl含有10⁹pfu/ml的噬菌体溶液滴加到细菌菌苔上并在37℃下孵育过夜来进行斑点试验。表2和3显示了使用斑点试验对9种阴沟肠杆菌菌株b29噬菌体的宿主范围测试，其中斑点中细菌的清除表明噬菌体在细菌菌株中的裂解活性。例如，如表2和3中所示，不同的噬菌体显示对不同的阴沟肠杆菌菌株特异的感染性，并且能够裂解不同的阴沟肠杆菌菌株。

表2

表3

通过以下方法进一步定量噬菌体对每种易受伤害的细菌菌株的裂解活性：将100μl的10⁹pfu/ml噬菌体与500μl10⁹cfu/ml细菌混合并在37℃振荡孵育过夜，然后在第二天进行连续稀释铺板并计数噬斑以评估每种噬菌体在宿主细菌中复制的能力(表4和5)。表4和5显示了使用细菌感染然后进行噬斑测定的9种阴沟肠杆菌菌株b29噬菌体的宿主范围测试。例如，如表4和5所示，不同的噬菌体显示对不同的阴沟肠杆菌菌株特异的感染性，并且能够在不同的阴沟肠杆菌菌株内复制并将其裂解。

表4

表5

动物测试

进行体内原理验证测试以确定肠道阴沟肠杆菌菌株b29的噬菌体治疗是否可以减少动物模型中的炎症、肥胖症或相关的代谢病症。无菌小鼠被口服接种阴沟肠杆菌菌株b29，其显示在小鼠中引起炎症和肥胖症。通过口服施用噬菌体来治疗小鼠，所述噬菌体被发现是裂解性的并且不含有毒素基因。将噬菌体单独测试并以两种或更多种噬菌体的组合进行测试，以确定炎症或肥胖症是否减少，并指导鸡尾酒的配制，细菌不太可能对鸡尾酒产生抗性，因为鸡尾酒含有多种彼此不密切相关的噬菌体。

实施例3

选择阴沟肠杆菌菌株b29作为概念验证研究的致胖肠道微生物。在小鼠中建立阴沟肠杆菌菌株b29诱导的肥胖模型，可以在该模型上测试噬菌体，使用广谱抗生素以首先耗尽天然小鼠微生物群，以便植入通常不定殖小鼠的阴沟肠杆菌菌株b29。分离出9种阴沟肠杆菌菌株b29特异性噬菌体，其被证实为裂解性的，并显示在哺乳动物胃肠道(gi)中存活。使用通过不同表面受体攻击其靶标的多种噬菌体，因此细菌不太可能产生抗性。

图2是显示与具有用阴沟肠杆菌菌株b29定殖的肠道微生物组的对照小鼠相比，用噬菌体处理的具有用阴沟肠杆菌菌株b29定殖的肠道微生物组的小鼠体重增加停滞的图示。如图2所示，噬菌体鸡尾酒抑制b29诱导的体重增加。用口服抗生素处理小鼠以耗尽其天然肠道微生物群。在第1周期间，所有小鼠通过口服灌胃法接受每日剂量的b29，并置于高脂肪饮食以诱导体重增加。在第3周，处理组(黑线)通过口服灌胃法接受7个每日剂量的噬菌体鸡尾酒。在第5周重复该噬菌体处理。在整个研究中每周监测体重，并且在第5周和第6周与对照组相比，噬菌体处理组中的体重显著不同(*，p<0.05)。

活体动物研究

该研究包括6组，每组8只小鼠。研究组包括：

第1组：肥胖对照-正常的肠道微生物群；发生肥胖症。

第2组：瘦对照-抗生素耗尽的肠道微生物群；不发生肥胖症，因为需要肠道微生物群。

第3组：肥胖对照-抗生素耗尽然后用b29接种以重建肠道微生物群；发生肥胖症。

第4组：实验-在第一次接种b29前一周，在抗生素耗竭期间的第3周开始时施用噬菌体鸡尾酒；噬菌体可防止b29植入并防止肥胖症的发生。

第5组：实验-在b29移植后第7周开始时但在肥胖症发生之前，施用噬菌体鸡尾酒；噬菌体通过降低b29水平来防止肥胖症和炎症的发生。

第6组：实验-在肥胖症发生后的第17周开始时施用噬菌体鸡尾酒；噬菌体通过降低b29水平来减少全身炎症并诱导体重减轻。

图3是显示设计用于测量噬菌体处理功效的研究的图示，所述噬菌体处理在暴露于阴沟肠杆菌菌株b29之前、在暴露于阴沟肠杆菌菌株b29之后但在肥胖症发生之前、以及在由于阴沟肠杆菌菌株b29对肠道微生物群的定殖而发生肥胖症之后施用。在第1-3周期间对第2-6组(见上述组的描述)施用广谱抗生素以耗尽其天然肠道微生物群，然后在第4周期间通过每天两次口服灌胃10¹⁰菌落形成单位的阴沟肠杆菌菌株b29来重建它们的微生物群(第2组除外)。所有小鼠在第5周开始时被喂食高脂肪饮食(hfd)并在研究期间保持。测试了抗生素耗尽和阴沟肠杆菌菌株b29重建肠道微生物群的方法并证明其有效。当在研究期间第3组对照中阴沟肠杆菌菌株b29水平降低时，对第3-6组施用每两周一次的“加强”剂量的阴沟肠杆菌菌株b29。在整个研究期间每周一次测量体重。噬菌体处理在图3所示的时间点开始，并且在第一周期间通过每日口服灌胃施用，然后在研究期间通过包含在饮用水中施用。从第4周末开始每两周一次收集和培养粪便样品以追踪阴沟肠杆菌菌株b29水平。如下所示，每4周测量葡萄糖耐量和胰岛素，以检测2型糖尿病。到12周时，我们在对照小鼠中证明了肥胖症。到24周时，确立了关于以下的结论：当在阴沟肠杆菌菌株b29暴露之前，在阴沟肠杆菌菌株b29植入之后但在肥胖症发生之前，或在阴沟肠杆菌菌株b29植入之后且在肥胖症之后施用时，阴沟肠杆菌菌株b29噬菌体鸡尾酒对体重和葡萄糖耐量的影响。

对小鼠组织的炎症和胰岛素抗性标志物的分子水平分析

在研究结束时解剖每只小鼠并保存各种组织。使用qrt-pcr检测肝脏、肠和脂肪组织中炎症的分子标志物如肿瘤坏死因子α(tnfα)、白细胞介素1β(il-1β)、白细胞介素(il-6)、toll样受体4(tlr4)和ikappab激酶ε(ikkε)。使用elisa测定来测量影响血糖和食欲的蛋白质(胰岛素、瘦蛋白和脂联素)和影响炎症的蛋白质(血清淀粉样蛋白a和lps结合蛋白)的血清水平。炎症和葡萄糖失调的一些或所有分子标志物响应于噬菌体鸡尾酒的施用而改善。在rna和蛋白质水平检查组织中胰岛素活性(acci、fas、fiaf、srebp1、pparq)和肠通透性(zo1、闭锁蛋白(occludin)、密封蛋白(claudin))的其他标志物。通过量化小鼠中响应于噬菌体鸡尾酒而发生的分子水平变化来推断体重变化的机制。

针对另外两种致胖性人类肠道细菌的噬菌体的分离

为了扩大有可能从噬菌体鸡尾酒中受益的人群范围，分离并表征了针对另外三种常见的致胖肠道微生物的噬菌体，用于包含在鸡尾酒中。细菌候选物包括多枝梭菌以及两种其他细菌菌株，所述多枝梭菌被发现在患有肥胖症和2型糖尿病的患者中升高，并且当移植到无菌小鼠中时引起肥胖症^17-19。使用与用于阴沟肠杆菌菌株b29噬菌体相同的标准技术分离和表征噬菌体。在体外测试每种的裂解活性和宿主范围，并且仅将具有高宿主特异性的裂解噬菌体留作鸡尾酒的候选物。最后，在小鼠中测试每种噬菌体在哺乳动物胃肠道条件中存活的能力。因此，对于另外三种致胖肠道细菌特异的10-20种另外的噬菌体各自被证实为裂解性的，宿主范围窄，并且能够在哺乳动物胃肠道中存活。

意图用于鸡尾酒的所有噬菌体的基因组测序和注释

噬菌体不能感染人或其他真核细胞类型，它们的狭窄宿主范围确保它们不会感染有益的肠道微生物，因此噬菌体鸡尾酒不存在脱靶感染的风险。然而，一些噬菌体在其进化历史的某些时候已经获得了细菌毒素基因。为了确保噬菌体鸡尾酒中不包含携带细菌毒素基因的噬菌体，进行了每种噬菌体的全基因组测序。被发现含有毒素基因的噬菌体株从进一步的考虑中除去。在毒素基因比预期更频繁地出现并且针对每种细菌靶标少于3种噬菌体留在鸡尾酒中的不太可能的情况下，使用与上述相同的技术来分离和表征另外的噬菌体。因此，提供了噬菌体鸡尾酒的最终制剂，其包括针对三种不同的致胖性人类肠道细菌物种中的每一种的约3-6种完全表征的且验证了安全性的噬菌体，总共约9-18种噬菌体。

商业化与经济影响

噬菌体鸡尾酒与益生菌补充剂结合使用，选择性消除了有害肠道微生物，为益生菌的繁殖创造了生态空间。因此，益生菌市场是噬菌体鸡尾酒潜在经济影响的最佳指标。2015年全球益生菌补充剂市场为33亿美元，预计将继续以每年7.6％的速度增长直至2025年²²。它是营养补充剂市场中增长最快的部分。在膳食补充剂中，针对减肥、胃肠道健康和糖尿病的补充剂构成了5个增长最快的销售类别中的3个²³。

如在多种实施方案中公开的本公开可以按比例放大并优化递送系统。包括任意实施方案的组合物的药物组合物的实例可以是软胶囊或液体形式，或胶囊、粉末或泡腾片剂中的冻干噬菌体。肠溶包衣是可能的，但可能不是必需的——裸阴沟肠杆菌菌株b29噬菌体通过小鼠胃的途径导致噬菌体活力轻微或没有减少。从那以后，当发现另外的致胖细菌时，可以将新的噬菌体添加到鸡尾酒中。

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虽然以上描述了示例性实施方案，但并不意味着这些实施方案描述了本发明的所有可能形式。相反，说明书中使用的词语是描述性词语而非限制性词语，并且应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种改变。另外，可以组合各种实现的实施方案的特征以形成本发明的其他实施方案。