一种mTOR抑制剂、药物组合物及其应用的制作方法

本发明属于药物领域，具体地说，涉及一种mtor抑制剂、药物组合物及其应用。

背景技术：

肿瘤是一类常见病和多发病，是机体组织细胞在内外各种致瘤因素长期作用下，发生基因突变失去对其生长和分化的正常调控，引起克隆性异常增生和分化所形成的新生物或赘生物。肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤，恶性肿瘤又细分为来源于上皮组织的癌、来源于间叶组织的肉瘤和癌肉瘤三类。通常人们所说的“癌症”是泛指所有的恶性肿瘤。

恶性肿瘤是威胁人类健康最主要的恶性疾病之一，是目前全球人口的第一死因，最新数据统计，2007年，全球有约790万人死于各类癌症，占死亡总数的13％，有超过1200万个肿瘤病例被确诊，其中72％以上肿瘤患者和致死病例都发生在不发达国家，且呈不断上升的趋势，2015年，全球肿瘤致死人数增至900万人，预计2030年将超过1200万人；目前，我国每年癌症发病人数约280万，死亡人数超过40万人，位列我国各类疾病致死原因之首，并呈不断上升趋势。随着社会生活节奏加快，竞争压力增大，以及人类的生活方式和环境的改变，肿瘤发病率和死亡人数正逐年增长，已成为现代社会的常见病和高发病，不仅严重影响患者的生活质量，而且给家庭和社会带来沉重的经济和精神负担，也是困扰全球的重大社会问题，癌症的治疗和预防始终是全球范围内最为迫切的问题之一。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin，mtor)是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，为磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide3kinase，pi3k)相关蛋白激酶家族成员之一。mtor在生物体内以mtorc1和mtorc2两种复合物的形式存在。mtor可整合营养、能量及生长因子等多种细胞外信号，参与基因转录、蛋白质翻译、核糖体合成及细胞骨架合成等生物过程，在细胞生长、增殖、凋亡和代谢中发挥极为重要的作用。信号通路活化的起始激动因素主要是氨基酸、各种生长因子和缺氧等。mtor在生物体内以mtorc1和mtorc2两种复合物的形式存在。

pi3k/akt/mtor通路是哺乳动物中调节细胞活动的信号通路，这条通路对细胞的生存、生长和增殖具有重要意义。重要的有丝分裂原(胰岛素、荷尔蒙、生长因子等)激活位于细胞膜上靠近细胞质一侧的分子，进而活化mtor通路中的重要分子pi3k。活化的pi3k促进磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(pip2,phosphatidylinositol(4,5)-biphosphate)转化为磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(pip3,phosphatidylinositol(3,4,5)-triphosphate)，后者与akt的ph结构域结合，同时还伴随着其它激酶对akt的磷酸化，最终导致结节性硬化复合物1和2(tsc1/2,tuberoussclerosiscomplex1and2)解聚或/和磷酸化pras40(prolinerichaktsubstrate40000)来上调mtorc1。pi3k/akt/mtor信号通路的异常在多种肿瘤类型中频繁发生，包括非小细胞肺癌、子宫内膜癌和宫颈癌等等。

此外，其他的环境应激源也能调节mtor信号通路。如长期缺乏细胞代谢中必不可少的氧，导致能量匮乏，有助于丝氨酸/苏氨酸激酶肝激酶b1(lkb1,liverkinaseb1)或ampk介导mtorc1抑制。能量的可供应性也是mtor活性的重要调节因素。amp活化的蛋白激酶(ampk,amp-activatedproteinkinase)可以作为mtorc1的“能量感应器”。当能量缺乏时，细胞内的amp水平上升，与ampk结合，通过上游激酶来活化ampk。ampk一旦激活后，可以磷酸化tsc2，增加产能的分解过程并降低耗能的合成过程，如蛋白质的合成等。

mtorc1激活的最重要特征是蛋白质合成。mtorc1直接磷酸化核糖体蛋白s6激酶1(p70ribosomalproteins6kinase1，s6k1)的疏水基团thr389，从而通过作用pdk1使随后的蛋白磷酸化。s6k1的磷酸化激活下游的几个底物从而促进了mrna的翻译开始，包括eif4b，一个eif4f复合体的正向调节器。mtorc1直接磷酸化下游的真核翻译起始因子结合蛋白(eukaryoticinitiationfactor4e-bindingprotein1,4e-bp1)，4e-bp1磷酸化阻止其结合到帽结合蛋白eif4e，从而使其能够参与启动帽蛋白依赖性翻译所需的eif4f复合体的形成。s6k1以及4e-bp1的磷酸化激活mrna的翻译，从而使各种效应物活性水平增加。mtorc1在mrna的翻译中具有非常重要的意义，mtor的活性位点抑制剂可以完全抑制mtorc1功能，从而降低细胞中的蛋白质合成。除了调节蛋白质的合成，mtorc1还控制细胞膜所需的脂质的合成，同时，mtorc1也积极调解细胞代谢和atp的合成。

mtorc2由mtor、mlst8、deptor、rictor(rapamycin-insensitivecompanionofmtor)、哺乳动物应激激活蛋白激酶反应蛋白1(mammalianstressactivatedproteinkinaseinteractingprotein1，msin1)及protor1/2(proteinobservedwithrictor-1/2)组成。通过msin1和蛋白激酶c-α(pkcα)可参与肌动蛋白的调节和细胞骨架的形成。mtorc2高表达可促进细胞存活，低表达则诱导细胞凋亡。

mtorc2通路的关键步骤是通过蛋白磷酸酶(pten,phosphataseandtensinhomologuedeletedonchromosome10)来调节和抑制pip2向pip3的转化。mtorc1通过激活核糖体生物合成、抑制自噬介导的核糖体翻转可间接激活mtorc2。mtorc2激活将引起akt473位丝氨酸(ser473)磷酸化，akt激活进一步诱导sin1-t86的磷酸化，mtorc2活性增强，促使mtorc2正向环路形成，但抑制tsc1/2复合物时则会削弱该过程。

在人类多种肿瘤中，mtor均异常激活。使用mtor抑制剂可有效抑制肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、黑色素瘤、胶质瘤、肝癌等多种肿瘤细胞异常激活的pi3k/akt/mtor信号通路，进而抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭及上皮间质转化。高比例的癌症患者都存在mtorc1上游致癌通路的突变，包括pi3k/akt/mtor通路以及ras/raf/mek/erk通路，以上两个通路突变引起mtorc1过度激活。另外，常见的肿瘤抑制因子tp53和lbk1是mtorc1上游tsc1和tsc2的负调控因子。mtorc1的下游因子也参与肿瘤的发生，eif4e和s6k1基因和蛋白的过度表达在许多癌症中存在，其中4e-bp1的磷酸化最为关键，一些akt以及erk驱动的肿瘤细胞株均依赖于4ebp的磷酸化，mtor抑制剂可以改变4ebp与eif4e表达的比值，从而对这类细胞产生较强的抑制增殖作用。

mtorc2信号也涉及癌症，很大程度上是由于其激活akt的作用，激活后的akt促进增殖过程如葡萄糖摄取和糖酵解，同时还抑制细胞凋亡。实际上，一些pi3k/akt诱导的肿瘤也依赖于mtorc2活性，前列腺癌小鼠模型中存在pten缺失，同样人前列腺癌细胞系中pten也是缺失的。

pi3k/akt/mtor信号转导通路活化可以抑制多种刺激诱发的细胞凋亡，促进细胞周期进展、细胞生存和增殖，同时参与血管形成、肿瘤的侵袭和转移，在肿瘤的形成过程中扮演重要角色。akt可调控多个凋亡相关蛋白抑制细胞凋亡，akt过表达使细胞凋亡蛋白抑制因子1(dap-1)表达增加从而发挥抑制凋亡的作用。akt也能通过磷酸化mtor及其下游分子s6k1、4e-bp1下传生存信号，抑制不依赖p53的细胞凋亡，促进细胞生存。近年来，在多种肿瘤中发现，eif-4e在体外有转化细胞和抗凋亡活性，eif-4e过表达可使细胞免某些前凋亡效应的影响。

细胞外调节蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases,erk)，包括erk1和erk2，是将信号从表面受体传导至细胞核的关键。磷酸化激活的erk1/2由胞质转位到核内，进而介导elk-1、atf、ap-1、c-fos和c-jun的转录活化，参与细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架的构建、细胞凋亡和细胞的癌变等，erks调节着细胞的增殖、分化和存活，是多种生长因子(egf、ngf、pdgf等)的下游蛋白，erk和其信号途径在肿瘤侵袭和转移过程中起中介和放大信号的作用，一方面接受大量来自生长因子、丝裂原、环境刺激等的信号，另一方面通过erk信号级联反应作用于核转录因子如ap-1、nf-кb等，调控基因表达。在许多人类的癌症(如口腔癌、黑色素瘤、乳腺癌等)中都可发现erk的过度激活。其经典通路为ras/raf/mer/erk。

更为值得关注的是pi3k/akt/mtor和erk/mapks信号通路之间存在多个串话现象而形成复杂的相互作用。这两条通路之间的相互作用既可能是相互抑制，也可以相互激活。pi3k/akt/mtor和erk/mapks信号通路对肿瘤细胞的生长、増殖、分化、侵袭、转移和耐药具有重要的作用，其功能和调控机制异常复杂，抑制其中一条通路并不能取得理想的疗效，主要原因在于它们之间形成的复杂串话关系。

mtor抑制剂，例如雷帕霉素及其衍生似物“rapalogs”，能特异性抑制mtorc1，对多种肿瘤细胞的生长具有浓度和时间依赖性抑制作用，可以增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，诱导凋亡的发生，同时产生协同增效作用。

可利霉素(carrimycin)，又称必特螺旋霉素(bitespiramycin)、生技霉素(shengjimycin)是由中国医科院生物技术研究所与本申请人合作，通过转基因技术将碳霉素产生菌的4”异戊酰基转移酶基团(4”-o-acyl-transferase)克隆至螺旋霉素产生菌中，定向酰化螺旋霉素4”-oh，在4”位加入异戊酰基侧链所形成的以4”位异戊酰基螺旋霉素为主要组分的新型抗生素。

可利霉素是由多种螺旋霉素衍生物组成，主要活性成分异戊酰螺旋霉素(i+ii+iii)总含量不低于60％，酰化螺旋霉素的总含量不低于80％，于药学上是一种可接受的药物组合物。中心结构为16元内酯环，与一分子福洛胺糖、一分子碳霉胺糖和一分子碳霉糖连接而成，其主要成分异戊酰螺旋霉素i、ii、iii与螺旋霉素结构不同之处在于碳霉糖4”位上连接的基团为异戊酰基而不是羟基。化学结构，如式(1)所示，共包含十余种组分。目前可利霉素成品组成标准为异戊酰螺旋霉素iii≥30％，异戊酰螺旋霉素i、ii、iii的比例总和≥60％，总酰化螺旋霉素的比例≥80％，其它未知组分的总和≤5％。

可利霉素属于16元大环内酯类抗生素，具有活性基团羧基、烷氧基、环氧基、酮基和醛基以及一对共轭的c＝c，分子量约为884～982。由于具有相似的化学结构，可利霉素与大环内酯类抗生素具有很多共性：易溶于酯类、丙酮、氯仿、醇类等大多数有机溶剂，微溶于石油醚，难溶于水；分子结构中含有两个二甲胺基而呈弱碱性，易溶于酸性水溶液；具有溶解度随温度的升高而降低的“负溶解度”质。由于可利霉素主要组分异戊酰螺旋霉素4”位碳链较长，亲水性差，其水中溶解度比螺旋霉素及4”-乙酰螺旋霉素小。

可利霉素是一种白色非结晶粉末，略有引湿性，比旋度约为-80.8°，紫外最大吸收波长为231～232nm，本身带有弱荧光发色基团，遇浓硫酸或盐酸呈紫色反应，产生强紫色荧光，在231～232nm处有最大吸光值。该药具有亲脂性好，组织渗透能力强，口服吸收快，体内维持时间长，有持续的抗生素后效应。根据药效与化学构象的关系，大环内酯类抗生素4”位酰化后，其亲脂性和体内活性提高，体内抗菌活性与临床治疗效果均得到了显著提升，并且抗生素在体内的稳定性随着4”羟基酯的碳链增长而增强，即异戊酰螺旋霉素＞丁酰螺旋霉素＞丙酰螺旋霉素＞乙酰螺旋霉素。

初步体内外药效学试验表明，该药不仅对多数g⁺菌有较好抗菌活性，对部分g^-菌也有一定作用，各项技术指标明显优于阿奇霉素、红霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素，尤其对肺炎支原体的抗菌活性最强，对红霉素耐药菌、淋球菌、肺炎球菌、金葡菌、绿脓假单胞菌、流感杆菌、流感嗜血杆菌、脆弱拟杆菌、军团菌、多行杆菌和产气荚膜梭菌也有一定抗菌活性，对临床耐红霉素的金葡球菌仅有极少交叉耐药性。可利霉素将主要用于治疗革兰氏阳性菌感染性疾病，尤其是上呼吸道感染，并可能用于泌尿系统感染等。

药代动力学研究结果表明，可利霉素中具有活性的有效组分主要为异戊酰螺旋霉素i、ii、iii。可利霉素进入体内后很快代谢为螺旋霉素，以母体药物异戊酰螺旋霉素i、ii、iii和活性代谢物螺旋霉素i、ii、iii的auc0-t总和计算，其口服绝对生物利用度平均为91.6％。文献报道，螺旋霉素人体口服绝对生物利用度为30-40％[frydmanametaljantimicrobchemother.1988，22(supplb):90-103]。说明异戊酰螺旋霉素的结构明显改善了活性成分螺旋霉素的生物利用度。单次服药可利霉素消除较慢，t1/2β在23-27小时之间。

本申请人近期研究惊喜的发现，可利霉素、可利霉素中的单一活性成分或者组合，能够抑制pi3k/akt/mtor信号通路的蛋白，可以作为mtor抑制剂使用，对pi3k/akt/mtor信号通路相关的疾病具有治疗效果，具有重要的经济效益和社会效益。

有鉴于此特提出本发明。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种mtor抑制剂、药物组合物及其应用。本发明提供的mtor抑制剂对mtor通路相关的疾病的细胞有明显的抑制作用，为mtor抑制剂在制备治疗和/或预防mtor通路相关的疾病的药物中的应用及临床推广提供了理论依据，而且具有重要的经济效益和社会效益。

为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

本发明的第一目的是提供一种mtor抑制剂，所述的mtor抑制剂包括可利霉素、异戊酰螺旋霉素ⅰ、异戊酰螺旋霉素ⅱ、异戊酰螺旋霉素ⅲ之一，或者异戊酰螺旋霉素ⅰ、异戊酰螺旋霉素ⅱ、异戊酰螺旋霉素ⅲ两种或三种的组合。

可利霉素为多种活性成分的混合物，除了包括异戊酰螺旋霉素ⅰ、异戊酰螺旋霉素ⅱ、异戊酰螺旋霉素ⅲ这三种活性成分，还含有其他的杂质。

可利霉素、异戊酰螺旋霉素ⅰ、异戊酰螺旋霉素ⅱ、异戊酰螺旋霉素ⅲ，这四种均可以单独作为mtor抑制剂使用。异戊酰螺旋霉素ⅰ、异戊酰螺旋霉素ⅱ、异戊酰螺旋霉素ⅲ也可以任意组合使用。

进一步的方案，所述的mtor抑制剂是pi3k/akt/mtor信号通路中蛋白的别构抑制剂或催化抑制剂。

进一步的方案，所述的催化抑制剂是激酶抑制剂，例如为akt抑制剂。

进一步的方案，所述的mtor抑制剂抑制mtorc1和mtorc2的活化；

进一步的方案，所述的mtor抑制剂至少抑制pi3k/akt/mtor信号通路中的pi3k蛋白、akt蛋白、mtor蛋白、s6k1蛋白、4ebp1蛋白中一种或几种的活化。

进一步的方案，所述的mtor抑制剂为通过mtor信号通路途径起作用的抗肿瘤药物、和/或治疗糖尿病药物、和/或治疗阿尔茨海默的药物、和/或延缓衰老的药物。

进一步的方案，所述的mtor抑制剂为通过mtor信号通路途径起作用的抗肿瘤药物，且至少抑制pi3k/akt/mtor信号通路中的pi3k蛋白、akt蛋白、mtor蛋白、s6k1蛋白、4ebp1蛋白中一种或几种的活化。

进一步的方案，所述的mtor抑制剂为通过mtor信号通路途径起作用的治疗糖尿病药物，且至少抑制pi3k/akt/mtor信号通路中的pi3k蛋白、akt蛋白、mtor蛋白、s6k1蛋白、4ebp1蛋白中一种或几种的活化。

进一步的方案，所述的mtor抑制剂为通过mtor信号通路途径起作用的治疗阿尔茨海默的药物，且至少抑制pi3k/akt/mtor信号通路中的pi3k蛋白、akt蛋白、mtor蛋白、s6k1蛋白、4ebp1蛋白中一种或几种的活化。

进一步的方案，所述的mtor抑制剂为通过mtor信号通路途径起作用的延缓衰老的药物，且至少抑制pi3k/akt/mtor信号通路中的pi3k蛋白、akt蛋白、mtor蛋白、s6k1蛋白、4ebp1蛋白中一种或几种的活化。

本发明的第二目的是提供一种药物组合物，所述的药物组合物包括如上所述任一方案的mtor抑制剂以及药学上可接受的载体；

优选的，mtor抑制剂的剂量范围为1～10000mg/kg；优选10～5000mg/kg，优选50～1000mg/kg；更优选100～500mg/kg。

另一种方案，一种药物组合物，所述的药物组合物包括第一活性成分和第二活性成分，所述的第一活性成分包括如上所述的mtor抑制剂，所述的第二活性成分包括治疗和/或预防mtor通路相关的疾病的药物。

进一步的，在制成复方制剂时，第一活性成分与第二活性成分的用量比为1～99：99～1，优选5～95：95～5，更优选10～90：90～10，再优选20～80：80～20。

进一步的方案，所述的药物组合物包括药学上可接受的任何剂型；优选的，剂型包括散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂等。

本发明中，所述的mtor抑制剂中的活性成分异戊酰螺旋霉素ⅰ可按照现有技术的方法分离制备得到，如按照cn101785778a实施例1的方法分离制备得到。

本发明的第三目的是提供一种组合产品，所述的组合产品包括第一药剂，所述的第一药剂包括如上所述的mtor抑制剂或者如上所述的药物组合物。

进一步的方案，所述的组合产品还包括第二药剂。

进一步的方案，所述的第二药剂包括治疗和/或预防mtor通路相关的疾病的药物。

该方案中的治疗和/或预防mtor通路相关的疾病的药物是指治疗这些疾病的主要药物，例如，对于糖尿病，第二药剂可以为胰岛素及其类似物、磺酰脲类促泌剂、二甲双胍类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类衍生物促敏剂、苯茴酸类衍生物促泌剂、glp-1受体激动剂、dpp-4酶抑制剂和中成药。

在联合用药时，第一药剂和第二药剂的用量比为1～99：99～1，优选5～95：95～5，更优选10～90：90～10，再优选20～80：80～20。

在联合用药时，第一药剂与第二药剂的用药顺序不分先后，可以先用第一药剂，也可以先用第二药剂，也可以两个药剂同时使用。

本发明的第四目的是提供一种抗肿瘤药物，包括mtor抑制剂，所述的mtor抑制剂包括可利霉素、异戊酰螺旋霉素ⅰ、异戊酰螺旋霉素ⅱ、异戊酰螺旋霉素ⅲ之一，或者异戊酰螺旋霉素ⅰ、异戊酰螺旋霉素ⅱ、异戊酰螺旋霉素ⅲ两种或三种的组合；

优选的，所述的mtor抑制剂是pi3k/akt/mtor信号通路中蛋白的别构抑制剂或催化抑制剂；

优选的，所述的催化抑制剂是激酶抑制剂；

优选的，所述的mtor抑制剂至少抑制pi3k/akt/mtor信号通路中的pi3k蛋白、akt蛋白、mtor蛋白、s6k1蛋白、4ebp1蛋白中一种或几种的活化。

与肿瘤密切相关的多项细胞功能如细胞增殖、细胞周期、蛋白合成、细胞迁移等均受控于mtor的凋节。现已发现许多肿瘤如乳腺癌、的列腺癌、肺癌中都有mtor信号通路的调节异常。可利霉素、异戊酰螺旋霉素ⅰ、异戊酰螺旋霉素ⅱ、异戊酰螺旋霉素ⅲ之一，或者异戊酰螺旋霉素ⅰ、异戊酰螺旋霉素ⅱ、异戊酰螺旋霉素ⅲ两种或三种的组合作为mtor抑制剂，抑制mtorc1的活性，进而影响其下游且受mtorc1调控的靶分子，包括p70s6k，atg13，4ebp1，hif-1，pgc-1α，pparr等。当mtorc1的活性下降时，p70s6k受负调节，细胞生长受阻滞，而atg13不再受到抑制，从而促进细胞的凋亡及自噬作用。本发明的抑制剂除了可以引起细胞周期阻滞以外，还能通过凋亡和自噬作用引起肿瘤细胞死亡。

本发明的第五目的是提供一种治疗糖尿病的药物，包括mtor抑制剂，所述的mtor抑制剂包括可利霉素、异戊酰螺旋霉素ⅰ、异戊酰螺旋霉素ⅱ、异戊酰螺旋霉素ⅲ之一，或者异戊酰螺旋霉素ⅰ、异戊酰螺旋霉素ⅱ、异戊酰螺旋霉素ⅲ两种或三种的组合；

优选的，所述的mtor抑制剂是pi3k/akt/mtor信号通路中蛋白的别构抑制剂或催化抑制剂；

优选的，所述的催化抑制剂是激酶抑制剂；

优选的，所述的mtor抑制剂至少抑制pi3k/akt/mtor信号通路中的pi3k蛋白、akt蛋白、mtor蛋白、s6k1蛋白、4ebp1蛋白中一种或几种的活化。

另外，mtor可以形成不同的功能复合物(mtorc1和mtorc2)调控胰岛素信号通路活性，影响胰岛β细胞发育、凋亡以及胰岛素分泌，调节与糖代谢密切相关激素如ghrelin/nesfatin-1的分泌，影响骨骼肌、脂肪等外周组织糖摄取等多种途径调控血糖。mtorc1对胰岛素敏感性作用机制复杂，一方面，生长因子可通过经典的pi3k-akt信号通路激活mtor，另一方面mtor/s6k1信号可通过负反馈机制降低胰岛素敏感性。本发明的mtor抑制剂抑制mtor和s6k1的过度磷酸化，逆转胰岛素抵抗状态下irs丝氨酸磷酸化，增强脂肪细胞糖吸收，抑制脂肪积累。

本发明的第六目的是提供一种治疗阿尔茨海默的药物，包括mtor抑制剂，所述的mtor抑制剂包括可利霉素、异戊酰螺旋霉素ⅰ、异戊酰螺旋霉素ⅱ、异戊酰螺旋霉素ⅲ之一，或者异戊酰螺旋霉素ⅰ、异戊酰螺旋霉素ⅱ、异戊酰螺旋霉素ⅲ两种或三种的组合；

优选的，所述的mtor抑制剂是pi3k/akt/mtor信号通路中蛋白的别构抑制剂或催化抑制剂；

优选的，所述的催化抑制剂是激酶抑制剂；

优选的，所述的mtor抑制剂至少抑制pi3k/akt/mtor信号通路中的pi3k蛋白、akt蛋白、mtor蛋白、s6k1蛋白、4ebp1蛋白中一种或几种的活化。

在神经系统中，mtor的过度活化会导致脑肿瘤的发生。另外，很多证据都显示在一些神经退行性疾病如艾尔茨海默病(ad)、帕金森病、亨廷顿舞蹈症等中mtor信号通路都存在异常。这些疾病都存在一个共同的特征：大脑中一定区域存在大量的神经元丢失，这可能都与mtor通络的异常有关。ad是一种主要在老年期发生的以进行性痴呆为主要特征的神经退行性疾病。ad最典型的病理特征为：神经元外的β-淀粉样蛋白(β-amyloidprotein，aβ)聚集形成老年斑、神经元内高度磷酸化的蛋白形成神经纤维缠结和神经元的丢失，临床上表现为学习与记忆功能的改变。由于ad的发病机制是非常复杂的，目前研究中mtor通路出现两种不同的改变情况(上调/下调)，mtor通路的下调可以减少一些具有神经毒性作用的蛋白(如:tau蛋白)合成，因此mtor的抑制剂有可能成为治疗神经退行性疾病的有效药物。

本发明的第七目的是一种延缓衰老的药物，包括mtor抑制剂，所述的mtor抑制剂包括可利霉素、异戊酰螺旋霉素ⅰ、异戊酰螺旋霉素ⅱ、异戊酰螺旋霉素ⅲ之一，或者异戊酰螺旋霉素ⅰ、异戊酰螺旋霉素ⅱ、异戊酰螺旋霉素ⅲ两种或三种的组合；

优选的，所述的mtor抑制剂是pi3k/akt/mtor信号通路中蛋白的别构抑制剂或催化抑制剂；

优选的，所述的催化抑制剂是激酶抑制剂；

优选的，所述的mtor抑制剂至少抑制pi3k/akt/mtor信号通路中的pi3k蛋白、akt蛋白、mtor蛋白、s6k1蛋白、4ebp1蛋白中一种或几种的活化。

抑制mtor/s6k信号通路可延缓衰老，还可增加线粒体产生及改善呼吸链活性，减轻内质网应激，促进自噬作用清除细胞内的受损结构。mtor抑制剂抑制mtor/s6k信号通路可显著增强自噬相关信号通路，mtorc1受到抑制后，自噬作用增强，清除代谢副产物能力随之增强，最终致寿命延长。另外，mtor是线粒体氧化呼吸功能的维护者，通过上调pparr及pgc1水平促进线粒体相关基因表达、线粒体生成及增加组织氧耗。mtorc1受抑制后可致发挥保护功能的基因群活化，通过限制线粒体呼吸减少氧自由基造成的损伤，从而致机体寿命延长。

本发明的第八目的是提供一种上述的mtor抑制剂或者药物组合物或组合产品在制备治疗和/或预防mtor通路相关的疾病的药物中的应用。

进一步的方案，所述的可利霉素、异戊酰螺旋霉素ⅰ、异戊酰螺旋霉素ⅱ或异戊酰螺旋霉素ⅲ通过靶向mtor的方式操纵代谢微环境，从而抑制mtor通路相关的疾病。

进一步的方案，mtor通路相关的疾病选自与年龄相关的疾病、与移植排斥相关的疾病、慢性炎性疾病、与糖原贮积相关的疾病、亨廷顿舞蹈病、恶性肿瘤、转移癌、系统性红斑狼疮、与炎症和免疫激活相关的疾病、白细胞减少的相关疾病、贫血症、血小板减少症、与支架涂层相关的疾病、肾功能不全、肥胖症、糖尿病、与非酒精性脂肪肝相关的疾病、疾病导致的体重降低、多囊肾、帕金森氏病和纤维化中的至少一种。

进一步的方案，年龄相关的病症选自肌少症，皮肤萎缩，肌肉萎缩，脑萎缩，动脉粥样硬化，动脉硬化，肺气肿，骨质疏松症，骨关节炎，高血压，勃起功能障碍，痴呆症，阿尔茨海默氏病，白内障，年龄相关性黄斑变性，前列腺癌，中风，寿命减少，肾功能受损和年龄相关性听力损失，衰老相关的移动性残疾，认知功能减退，记忆损伤，腱僵硬，心脏功能障碍如心肌肥厚和收缩和舒张功能障碍，免疫功能衰老。

进一步的方案，所述纤维化包括肝纤维化、心肌纤维化、心血管纤维化、肺纤维化、胰腺纤维化、肾纤维化或脾纤维化。

进一步的方案，所述的恶性肿瘤选自淋巴系统的造血肿瘤、髓系造血肿瘤、间叶细胞源肿瘤、中枢和外周神经系统的肿瘤、黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、甲状腺滤泡癌症和卡波西氏肉瘤；

优选的，淋巴系统的造血肿瘤选自白血病、急性淋巴性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、b-细胞淋巴瘤、t-细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、骨髓瘤和伯基特氏淋巴瘤；髓系造血肿瘤包括急性和慢性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合症和早幼粒细胞白血病；间叶细胞源肿瘤包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；中枢和外周神经系统的肿瘤包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤。

进一步的方案，恶性肿瘤还包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、间皮瘤、肾癌、肝癌、肺癌、头颈癌、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、淋巴癌、宫颈癌、结肠癌、甲状腺癌、前列腺癌、皮肤癌、口腔癌。

进一步的方案，mtor抑制剂抑制的恶性肿瘤细胞包括：人乳腺癌细胞mcf-7及mda-mb-231，人肝癌细胞hepg2或鼠肝癌细胞h22，人非小细胞肺癌细胞a549，人大细胞肺癌细胞h460及h1299，人肾透明细胞腺癌细胞786-o，人肾细胞腺癌细胞769-p，人胶质瘤细胞u251，人胶质母细胞瘤细胞a172，人组织淋巴瘤细胞u937，人宫颈癌细胞hela，人前列腺癌细胞pc3，人胰腺癌细胞panc-1，人食管癌细胞te-1，人胃腺癌细胞sgc-7901，人结肠癌细胞ht-29，人早幼粒白血病细胞hl-60。

作为最优选方案，人非小细胞肺癌a549引起的肺癌。

本发明进一步通过体内试验表明异戊酰螺旋霉素i对于鼠肝癌细胞h22、非小细胞肺癌细胞a549的生长均有明显的抑制作用。

根据本发明使用的mtor抑制剂进行的治疗，可以与一种或多种其他癌症治疗组合进行，所述其他癌症治疗包括外科治疗、放疗治疗(如γ-辐射、中子束放疗、电子束放疗、质子疗法、近距离放射疗法(brachytherapy)和全身性放射性同位素治疗等等)、内分泌治疗、生物反应调节剂治疗(例如，其中一些名称为干扰素、白介素、肿瘤坏死因子(tnf))、热疗、冷冻治疗、缓解药物(如抗吐药)和其他癌症化疗药物的不良反应。所述其他药物可在使用本发明提供的mtor抑制剂之前、过程中或之后给药，并且以与本文提供的mtor抑制剂相同或不同的制剂、给药途径和剂量安排来给药。

本发明的mtor抑制剂和药物组合物可与其他药物一起使用以缓解副作用(如抑制素、止痛药、止吐剂、g-csf、gm-csf等等)，和/或与其他合适的化疗药物。所述的其他的药物包括但不限于以下的一种或多种：抗癌烷化或嵌入药物(如氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、美法仑和异环磷酰胺)；代谢拮抗药物(如甲氨蝶呤)；嘌呤拮抗药物或嘧啶拮抗药物(如6-巯基嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、卡培他滨和吉西他滨)；纺锤体毒素(如长春碱、长春新碱、长春瑞滨和紫杉醇)；鬼臼毒素(如依托泊苷、伊立替康、托泊替康)；抗生素(如多柔比星、博来霉素和丝裂霉素)；亚硝基脲(如卡莫司汀、洛莫司汀)；无机离子(例如顺铂、卡铂、奥沙利铂或oxiplatin)；酶(如门冬酰胺酶)；激素(如他莫昔芬、醋酸亮丙瑞林、氟他胺和甲地孕酮)；蛋白酶体抑制剂(诸如velcade、其他蛋白酶体抑制剂或其他nf-kb抑制剂，包括如ikk抑制剂；其他激酶抑制剂(如src、brc/abl、kdr、flt3、aurora-2和糖原合成酶激酶3(“gsk-3”)、egf-r激酶(如iressa，tarceva等)、vegf-r激酶、pdgf-r激酶等；抗体，拮抗在癌症中涉及的受体或激素的可溶性受体或其他受体(包括的受体有egfr、erbb2、vegfr、pdgfr和igf-r，和药物诸如赫赛汀(或其他抗-her2抗体)，阿瓦斯丁，爱必妥等)等。

其他治疗药物的例子包括：别嘌醇、阿仑单抗、六甲密胺、氨磷汀、nastrozole，前列腺特异性膜抗原的抗体(如mln-591、mln591rl和mln2704)，三氧化二砷、贝沙罗汀、博来霉素、白消安、卡培他滨、gliadelwafer、塞来考昔、苯丁酸氮芥、顺铂-肾上腺素凝胶、克拉屈滨、阿糖胞苷脂质体、柔红霉素脂质体、柔红霉素、道诺霉素、右雷佐生、多西紫杉醇、多柔比星、elliottb溶液、表柔比星、雌莫司汀、磷酸依托泊苷、依托泊苷，、依西美坦、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、氟维司群、吉西他滨、吉姆单抗-奥佐米星、醋酸高锡林、羟基脲、依达比星、伊达比星、去甲氧柔红霉素、异环磷酰胺、甲磺酸伊马替尼、依立替康(或替他拓扑异构酶抑制剂，包括抗体如mln576(xr11576))、来曲唑、亚叶酸、左旋咪唑亚叶酸、柔红霉素脂质体、美法仑、l-pam、美司钠、甲氨喋呤、甲氧沙林、丝裂霉素c、米托蒽醌、mln518或mln608(或flt-3受体酪氨酸激酶、pdfg-r、c-kit其他抑制剂)、itoxantrone、紫杉醇、培加酶、喷司他丁、卟吩姆钠、美罗华()、滑石、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、vm-26、托泊替康、托瑞米芬、2c4(或干扰her2介导的信号传递的其他抗体)、维a酸、维甲酸、戊柔比星、长春瑞滨或帕米膦酸盐或唑来膦酸盐(zoledronate)或二膦酸盐化合物。

本发明中的mtor抑制剂治疗可以与细胞毒性剂的一种或多种组合一起使用作为治疗方案的一部分。细胞毒性剂的组合选自：chopp(环磷酰胺，多柔比星，长春新碱，泼尼松和丙卡巴肼)；chop(环磷酰胺，多柔比星，长春新碱和泼尼松)；cop(环磷酰胺，长春新碱，泼尼松)；cap-bop(环磷酰胺，多柔比星，丙卡巴肼，博来霉素，长春新碱和泼尼松)；m-bacod(甲氨喋呤，博来霉素，多柔比星，环磷酰胺，长春新碱，地塞米松和亚叶酸)；promace-mopp(泼尼松，甲氨喋呤，多柔比星，环磷酰胺，依托泊苷，亚叶酸，氧氮芥，长春新碱，泼尼松和丙卡巴肼)；promace-cytabom(泼尼松，甲氨喋呤，多柔比星，环磷酰胺，依托泊苷，亚叶酸，阿糖胞苷，博来霉素和长春新碱)；macop-b(甲氨喋呤，多柔比星，环磷酰胺，长春新碱，泼尼松，博来霉素和亚叶酸)；mopp(氧氮芥，长春新碱，泼尼松和丙卡巴肼)；abvd(多柔比星/多柔比星，博来霉素，长春碱和达卡巴嗪)；mopp(氧氮芥，长春新碱，泼尼松和丙卡巴肼)与abv(多柔比星/多柔比星，博来霉素和长春碱)交替使用；mopp(氧氮芥，长春新碱，泼尼松和丙卡巴肼)与abvd(多柔比星/多柔比星，博来霉素，长春碱和达卡巴嗪)交替使用；chlvpp(苯丁酸氮芥、长春碱、丙卡巴肼与泼尼松)；imvp-16(异环磷酰胺，甲氨喋呤和依托泊苷)；mime(米托胍腙，异环磷酰胺，甲氨喋呤和依托泊苷)；dhap(地塞米松，高剂量cytaribine和顺铂)；eshap(依托泊苷，甲泼尼龙，高剂量阿糖胞苷和顺铂)；cepp(b)(环磷酰胺，依托泊苷，，丙卡巴肼，泼尼松和博来霉素)；camp(洛莫司汀，米托蒽醌，阿糖胞苷和泼尼松)；cvp-1(环磷酰胺，长春新碱和泼尼松)；eshop(依托泊苷，甲泼尼龙，高剂量阿糖胞苷，长春新碱和顺铂)；epoch(依托泊苷，长春新碱和多柔比星，使用96小时同时伴随大剂量的环磷酰胺和口服泼尼松)；ice(异环磷酰胺，环磷酰胺和依托泊苷)，cepp(b)(环磷酰胺，依托泊苷，丙卡巴肼，泼尼松和博来霉素)，chop-b(环磷酰胺，多柔比星，长春新碱，泼尼松和博来霉素)，cepp-b(环磷酰胺，依托泊苷，丙卡巴肼和博来霉素)，和p/doce(表柔比星或多柔比星，长春新碱，环磷酰胺和泼尼松)。

采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1、本发明mtor抑制剂包括可利霉素、异戊酰螺旋霉素ⅰ、异戊酰螺旋霉素ⅱ、异戊酰螺旋霉素ⅲ之一，或者异戊酰螺旋霉素ⅰ、异戊酰螺旋霉素ⅱ、异戊酰螺旋霉素ⅲ两种或三种的组合。上述各活性成分可以分别或者组合对pi3k/akt/mtor信号通路中的某些蛋白活性起到抑制作用，因此本发明的mtor抑制剂对mtor通路相关的疾病的细胞有明显的抑制作用，为其在制备治疗和/或预防mtor通路相关的疾病的药物中的应用及临床推广提供了理论依据。

2、本发明的mtor抑制剂尤其具有较好的抗肿瘤作用，尤其对乳腺癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、宫颈癌、前列腺癌、结肠癌或白血病等肿瘤具有较好的疗效，可以通过抑制pi3k/akt/mtor信号通路中的蛋白活性抑制肿瘤细胞增殖，为该mtor抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用及其临床推广提供了理论依据，而且具有重要的经济效益和社会效益。

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。

附图说明

附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：

图1为蛋白免疫印迹法测定p-pi3k/pi3k、p-akt/akt、p-mtor/mtor、p-s6k1/s6k1、p-4ebp1/4ebp1、β-actin等pi3k/akt/mtor信号通路相关蛋白及磷酸化蛋白水平的定量结果。其中，a1-a2是p-pi3k/pi3k的结果b1-b2是p-akt/akt的结果，c1-c2是p-mtor/mtor的结果，d1-d2是p-s6k1/s6k1的结果，e1-e2是p-4ebp1/4ebp1的结果。

图2为蛋白免疫印迹法测定p-pi3k/pi3k、p-akt/akt、p-mtor/mtor、p-s6k1/s6k1、p-4ebp1/4ebp1、β-actin等pi3k/akt/mtor信号通路相关蛋白表达水平。

图3为可利霉素处理24h和48h后，对a549细胞的生长抑制结果；

图4为蛋白免疫印迹法测定可利霉素处理24h和48h后，对a549细胞的pi3k/akt/mtor信号通路相关蛋白表达水平结果；

图5为蛋白免疫印迹法测定可利霉素对a549细胞的pi3k/akt/mtor信号通路相关蛋白表达水平的定量结果；a-e分别为p-pi3k/pi3k、p-mtor/mtor、p-4ebp1/4ebp1、p-akt/akt、p-s6k1/s6k1的结果。

图6为流式细胞检测可利霉素诱导a549细胞自噬结果，诱导后mdc染色阳性率增加；其中图6a为24h结果，图6b为48h结果。

图7为蛋白免疫印迹法测定可利霉素处理a549细胞24h和48h后，p62和lc3表达水平定量检测结果；

图8为加入自噬抑制剂3-ma后可利霉素对a549细胞的生长抑制结果；

图9为相差显微镜观察处理24h和48h后的细胞形态变化结果；

图10为可利霉素处理a549细胞24h和48h后，av-pi染色后流式细胞术测定结果；

图11为可利霉素处理a549细胞24h和48h后，westernblot检测pro-caspse3、cpase3、parp蛋白水平结果；

图12为a549细胞内caspe3的酶活性检测结果；

图13为不同浓度可利霉素处理a549细胞24小时和48小时后，hif-1αvegf-a蛋白水平定量分析结果；

图14为不同浓度可利霉素处理a549细胞24小时和48小时后，ras,raf,p-erk/erk蛋白水平定量分析结果。

需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1、异戊酰螺旋霉素i或异戊酰螺旋霉素ii或异戊酰螺旋霉素iii片

规格：200mg/350mg

片芯处方：

包衣液处方：

制备工艺：

片芯的制备：主药和辅料分别过100目筛，将处方量异戊酰螺旋霉素i或异戊酰螺旋霉素ii或异戊酰螺旋霉素iii、微晶纤维素与1/2处方量的羧甲淀粉钠混合均匀，然后加入5％聚维酮k30水溶液制软材，以18目筛制粒，湿颗粒在60℃通风条件下干燥2h；干燥后以18目筛整粒，再加入1/2处方量的处方量羧甲淀粉钠与硬脂酸镁混合均匀后，用直径11mm的浅凹冲模压片，制得片重350mg、硬度6.5kg的含药片芯。

包衣液的配制：称好所需的欧巴代ii(白色)在配液容器中加入所需量的水，分次加入，待全部加入后，降低搅拌速度，使蜗旋消失，继续搅拌30min，即得。

薄膜包衣片的制备：将片芯置包衣锅内，确定包衣条件，主机速度为20r/min，进风温度40℃，出风温度30℃，喷雾压力0.02mpa，喷浆流量为1ml/min进行包衣，恒定后持续喷包1.5h，至片粒表面光滑、色泽均匀，符合薄膜衣检验标准为合格。包衣增重5％左右。

实施例2、异戊酰螺旋霉素i或异戊酰螺旋霉素ii或异戊酰螺旋霉素iii素片(按10000片计算)

处方：

异戊酰螺旋霉素i或异戊酰螺旋霉素ii或异戊酰螺旋霉素iii原粉1000g

低取代羟丙基纤维素(5％)92.5g

羧甲基淀粉钠(3％)55.5g

硬脂酸镁(1％)18.5g

淀粉总重-其它原辅料重量

总重1850g

制备工艺：称取适量淀粉，稀释至15％浓度，加热至糊状，制成粘合剂；主料异戊酰螺旋霉素i或异戊酰螺旋霉素ii或异戊酰螺旋霉素iii、辅料淀粉、低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁分别过100目筛，按处方量，称取所需主料和辅料；异戊酰螺旋霉素i、淀粉、低取代羟丙基纤维素充分混合均匀后，用15％淀粉浓度的淀粉糊制成软材，14目筛制粒，50-60℃干燥，水份控制在3-5％，14目筛整粒，加羧甲基淀粉钠，硬脂酸镁混合，测定颗粒含量；根据颗粒含量，计算片重，压片(φ9mm浅凹冲头)，检测片重差异；经检验合格后进行包装。

实施例3、异戊酰螺旋霉素i或异戊酰螺旋霉素ii或异戊酰螺旋霉素iii胶囊剂(按10000粒计算)

处方：

异戊酰螺旋霉素i或异戊酰螺旋霉素ii或异戊酰螺旋霉素iii原粉1000g

淀粉1080-异戊酰螺旋霉素i原粉重量

药用3号胶囊1000粒

液体石蜡50ml

制备工艺：将主料异戊酰螺旋霉素i或异戊酰螺旋霉素ii或异戊酰螺旋霉素iii、辅料药用淀粉按工艺配方量分别称取后，装入混合器充分混合后1.5-2小时；取样检测含量所得数据应和理论数据基本一致(每粒胶囊所装重量约为0.105g)，将经检验合格的药用3号胶囊及混合好的待装原料按全自动胶囊机操作要求，分别填入装料器进行填充，将填充好的胶囊进行差异检验(±10％以内，＜0.3g)，溶出度符合要求，将检验后符合要求的胶囊，放入打光机内加入液体石蜡进行15-20分钟的打光，然后取出进行成品包装盒检验。

实施例4、异戊酰螺旋霉素i或异戊酰螺旋霉素ii或异戊酰螺旋霉素iii干糖浆(按10000袋计算)

处方：

异戊酰螺旋霉素i或异戊酰螺旋霉素ii或异戊酰螺旋霉素iii原粉1250g

柠檬酸(0.5％)15g

蔗糖总重-其它原辅料

总重约5000g

色素(姜黄素)约1g

制备工艺：异戊酰螺旋霉素i或异戊酰螺旋霉素ii或异戊酰螺旋霉素iii原粉，柠檬酸、蔗糖分别用高速气流粉碎机粉碎成颗粒85％通过300目，15％通过180目，然后将粉碎后的细粉按处方量称取后充分混合1-1.5小时，测其含量，计算装量(理论装量为每袋500mg)，然后将混合物装入袋装机中，装好铝箔纸，按分装机操作要求分装，装量差异在±5％以内，装好后进行检验合格后外包装。

实施例5、异戊酰螺旋霉素i或异戊酰螺旋霉素ii或异戊酰螺旋霉素iii颗粒剂(按10000袋计算)

处方：

异戊酰螺旋霉素i或异戊酰螺旋霉素ii或异戊酰螺旋霉素iii原粉1250g

糖粉20000g

糊精9000g

5％pvp-k30适量

制备工艺：异戊酰螺旋霉素i或异戊酰螺旋霉素ii或异戊酰螺旋霉素iii原粉、糖粉、糊精过120目筛，按处方量称取异戊酰螺旋霉素i、糖粉、糊精混合均匀，将混合均匀的上述物料用5％pvp-k30胶浆制成软材，摇摆式颗粒剂制粒70℃干燥、整粒，送检合格后分装。

实施例6、异戊酰螺旋霉素i或异戊酰螺旋霉素ii或异戊酰螺旋霉素iii冻干粉针剂

称取异戊酰螺旋霉素i或异戊酰螺旋霉素ii或异戊酰螺旋霉素iii原粉500mg与等摩尔的己二酸混合均匀后溶解于5ml水中，得到淡黄色澄明溶液，ph在4.6-5.6之间。再加入甘露醇40mg作为冻干支撑剂，低温快速冷冻9h后，冷冻干燥，获得淡黄色疏松块状物，使用前用10ml无菌水溶解。

实施例7、异戊酰螺旋霉素i和异戊酰螺旋霉素ii冻干粉针剂

称取异戊酰螺旋霉素i250mg和异戊酰螺旋霉素ii原粉250mg，与等摩尔的己二酸混合均匀后溶解于5ml水中，得到淡黄色澄明溶液，ph在4.6-5.6之间。再加入甘露醇40mg作为冻干支撑剂，低温快速冷冻9h后，冷冻干燥，获得淡黄色疏松块状物，使用前用10ml无菌水溶解。

实施例8、可利霉素冻干粉针剂

称取可利霉素500mg，与等摩尔的己二酸混合均匀后溶解于5ml水中，得到淡黄色澄明溶液，ph在4.6-5.6之间。再加入甘露醇40mg作为冻干支撑剂，低温快速冷冻9h后，冷冻干燥，获得淡黄色疏松块状物，使用前用10ml无菌水溶解。

试验例1、抗肿瘤活性的生物测定

所测定的目的是评价被测试样品的体外细胞增殖抑制作用或细胞毒活性。

细胞株：

人乳腺癌细胞mcf-7及mda-mb-231，人肝癌细胞hepg2，人非小细胞肺癌细胞a549，人细胞肺癌h460及h1299，人肾透明细胞腺癌细胞786-o，人肾细胞腺癌细胞769-p，人胶质瘤细胞u251，人胶质母细胞瘤细胞a172，人组织淋巴瘤细胞u937，人宫颈癌细胞hela，人前列腺癌细胞pc3，人胰腺癌细胞panc-1，人食管癌细胞te-1，人胃腺癌细胞sgc7901，人结肠癌细胞ht-29，人早幼粒白血病细胞hl-60购于americantypeculturecollection(atcc,manassas,va,usa)。

试剂：

rpmi1640培养液、mem培养液、dmem低糖培养液、胎牛血清购于美国gibco公司，胰蛋白酶、谷氨酰胺、青霉素、链霉素、二甲基亚砜(dmso)、四甲基偶氮唑(mtt)购于美国sigma公司。

仪器：

二氧化碳培养箱(sanyo，japan)、酶联免疫分析仪(tecan，austria)、96孔培养板(corning，usa)、倒置显微镜(motic，china)。

操作步骤如下：

贴壁细胞：

mcf-7，mda-mb-231，hepg2，a549，h460，h1299，786-o，769-p，u251，a172，hela，pc3，panc-1，te-1，sgc7901，ht-29为贴壁细胞，选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞，用胰酶消化后，用含10％胎牛血清的培养基配成4～5×10⁴/ml的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔100μl，37℃，5％co2培养24h。实验组更换新的含不同浓度被测样品可利霉素的培养液，对照组则更换含等体积溶剂的培养液，每组设3个平行孔，37℃，5％co2培养48h。弃去上清液，用pbs小心洗3次，每孔加入100μl新鲜配制的含0.5mg/mlmtt的培养基，37℃继续培养4h。小心弃去上清，并加入150mldmso，用微型振荡器混匀10min后，用酶标仪在492nm处测定光密度值。

悬浮细胞：

u937、hl-60为悬浮细胞，选用对数生长期的细胞，用含10％小牛血清的rpmil640培养基配成2×10⁵/ml的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔50μl，37℃，5％co2培养24h。实验组加入含不同浓度被测样品可利霉素的培养液50μl，对照组则加入含等体积溶剂的培养液，每组设3个平行孔，37℃，5％co2培养48h，每孔加入10μl新鲜配制的含5mg/mlmtt的培养基，37℃继续培养4h。用三联液(sds10g，10mhcl0.1ml，异丁醇5ml，用蒸馏水稀释至100ml)100μl溶解结晶，37℃孵育12h。用酶标仪在492nm处测定光密度值。

结果评定：按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：

肿瘤细胞生长抑制率(％)＝[a492(阴性对照)－a492(加药组)]/a492(阴性对照)×100％

从中求出样品的半数抑制浓度(ic50)。

结果：以人乳腺癌细胞mcf-7及mda-mb-231，人肝癌细胞hepg2，人非小细胞肺癌细胞a549，人大细胞肺癌细胞h460及h1299，人肾透明细胞腺癌细胞786-o，人肾细胞腺癌细胞769-p，人胶质瘤细胞u251，人胶质母细胞瘤细胞a172，人组织淋巴瘤细胞u937，人宫颈癌细胞hela，人前列腺癌细胞pc3，人胰腺癌细胞panc-1，人食管癌细胞te-1，人胃腺癌细胞sgc-7901，人结肠癌细胞ht-29，人早幼粒白血病细胞hl-60为实验对象。对样品进行的体外抗增殖活性评价结果如下表1：

表1、可利霉素对肿瘤细胞的增殖抑制作用

现有结果显示，样品对所测试细胞均显示了良好的抗增殖活性。

试验例2、异戊酰螺旋霉素i抑制pi3k/akt/mtor通路

细胞株：

a549细胞购自americantypeculturecollection(atcc,manassas,va,usa)。细胞培养于含有10％胎牛血清、2％谷氨酰胺、青霉素(100u/ml)的dmem培养基中，在5％co2，37℃培养箱中培养。实验中所用细胞均是处于对数期的细胞。

试剂：

雷帕霉素(rapamycin)购于美国sigma公司(st.louis，mo,usa)

操作步骤如下：

a549为贴壁细胞，选用对数生长期的细胞，加入不同浓度(0.05、5、17、50μg/ml)的异戊酰螺旋霉素i以及对照药物雷帕霉素(rapamycin，20μg/ml)，在5％co2，37℃培养箱中培养24h，收集细胞，进行蛋白免疫印迹法测试。

蛋白免疫印迹法：

1工作液的配制

1)30％聚丙烯酰胺溶液：

需加入ddh2o定容至1,000ml，放置在棕色瓶中，于4℃保存。

2)tris缓冲液，用tris碱完全溶于去离子水后，用hcl调节溶液的ph值。

分离胶缓冲液：1.5mtris-hcl(ph8.8)；

积层胶缓冲液：1mtris-hcl(ph6.8)。

3)十二烷基硫酸钠(sds)：用去离子水配成10％的储存液置于室温保存，备用。

4)过硫酸铵(ap)：用去离子水配制少量的10％(w/v)的储备液保存于4℃，由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔周新鲜配制。

5)5×tris-甘氨酸电泳缓冲液：

4℃冰箱储存备用，使用时用ddh2o稀释成1×缓冲液使用。

6)细胞裂解液：50mmhepes(ph7.4)，1％triton-x100，100mmnaf，1mmedta，1mmegta，2mm正钒酸钠，1mmpmsf，10mg/mlaprotinin，10mg/mlleupeptin，10mg/mlpepstatina。

7)5×上样缓冲液：

8)转移缓冲液：

9)封闭液：

试剂名称用量

脱脂奶粉5g

pbst100ml

2蛋白质电泳

1)每管细胞加60-100μl裂解液，于4℃冰箱内冰浴1h。12,000r/min离心10-15min，吸出上清至0.5mlep管，用bio-rad检测定量蛋白后，加5×上样缓冲液，沸水浴3-5min，-80℃冻存。

2)按tab.2-1配制15％，12％或10％的丙烯酰胺分离胶，依次混合各成分，一旦加入temed及ap，立即快速旋转混合物灌制在电泳槽的两玻璃板之间，留出灌制积层胶所需的空间。在分离胶上覆盖一层异丙醇，将凝胶垂直放置在室温约30min。

3)分离胶完全聚合后，清除异丙醇，用去离子水洗10次，用滤纸吸去水，按tab.2-2配制积层胶，加入到电泳槽后立即插入干净的样品梳。

4)积层胶聚合完全后，在电泳仪中加满1×的电泳缓冲液，将样品按预定的顺序加到样品孔中开始电泳，样品在积层胶时电压为50--60v，待样品泳到分离胶时将电压调至100-140v。

3免疫印迹

1)sds聚丙稀胺凝胶电泳结束后，将胶放置到转移缓冲液中浸泡30min，切8张whatman3mm滤纸和1张硝酸纤维素膜，与凝胶大小相符合。将硝酸纤维素膜浸在甲醇中1min，将硝酸纤维素膜浸在去离子水中除去气泡。

2)将凝胶按叠成“三明治”状，插入转移池中，凝胶一面接阴极，100ma，3h。

3)转移后的硝酸纤维素膜进入丽春红s染液中5-10min，期间轻轻摇动，蛋白带子出现后用去离子水漂洗数次，用放水墨汁标记出标准蛋白分子量的位置。

4)将膜放入加有封闭液的培养皿中，封闭2h。

5)再按0.1ml/cm²加入含第一抗体的封闭液，4℃过夜，(各种抗体稀释倍数如tab.2-2)

6)回收一抗，用pbst漂洗膜3次，每次10min，将膜转移到含150mmnacl，50mmtris-hcl(ph7.5)的溶液中摇动10min。

7)按0.1ml/cm2加入含第二抗体的无磷酸盐及无叠氮化钠的封闭液中，其中以辣根过氧化酶标记的二抗稀释1,000倍。

8)以用150mmnacl，50mmol/ltris-hcl(ph7.5)溶液漂洗3次，每次10min。于暗室用ecl试剂盒显色，扫描图片并保存。

表2-a配制电泳分离胶所用溶液

表2-b配制tris-甘氨酸sds聚丙稀酰胺凝胶电泳5％积层胶所用溶液

表2-1c蛋白质电泳使用抗体

结果：

异戊酰螺旋霉素i作用于a549细胞24小时后，采用免疫印迹法考察了pi3k/akt/mtor信号通路蛋白及其磷酸化型式的水平，结果如图1和图2所示。

异戊酰螺旋霉素i对pi3k、akt、mtor及mtor底物s6k1、4ebp1，及其活化型式p-pi3k、p-akt、p-mtor、p-s6k1、p-4ebp1的蛋白水平的表达的影响如图1和图2所示，结果表明，异戊酰螺旋霉素i可抑制pi3k/akt/mtor信号通路蛋白活化，尤其是抑制pi3k蛋白、4ebp1蛋白、mtor蛋白的活化，抑制akt蛋白、s6k1蛋白的表达及其活化蛋白的表达。

另外，从图1和图2中还可以看出，与雷帕霉素相比，本发明的mtor抑制剂异戊酰螺旋霉素i对akt、s6k1和4ebp1的抑制作用更加优异，表明本发明的mtor抑制剂异戊酰螺旋霉素i能够起到优异的pi3k/akt/mtor信号通路抑制作用，为mtor抑制剂在制备治疗和/或预防mtor通路相关的疾病的药物中的应用及临床推广提供了理论依据，具有重要的经济效益和社会效益。

此外，申请人还单独利用可利霉素、异戊酰螺旋霉素ⅱ以及异戊酰螺旋霉素ⅲ，或者组合利用异戊酰螺旋霉素ⅰ、异戊酰螺旋霉素ⅱ、异戊酰螺旋霉素ⅲ中的两种或三种，作用于a549细胞24小时后，采用免疫印迹法考察了pi3k/akt/mtor信号通路蛋白及其磷酸化型式的水平，其结果与试验例2中类似，可以抑制pi3k蛋白、4ebp1蛋白、mtor蛋白的活化，抑制akt蛋白、s6k1蛋白的表达及其活化蛋白的表达，在此不再详述。

试验例3、可利霉素抑制抑制非小细胞肺癌a549增殖

(1)mtt法检测可利霉素体外对肿瘤细胞存活率的影响

a549细胞按照4×10³个/ml的密度接种于96孔板，每孔100μl，培养24或48h后。加入不同浓度的可利霉素，放在5％co2培养箱37℃继续培养不同时间之后，每孔加入100μl浓度为5mg/mlmtt培养2-3h后，吸弃上清液，加入150μldmso，微量振荡器振荡10min将结晶完全溶解，使用酶标仪检测每孔的吸光值(a值)，发射波长为492nm，同时以雷帕霉素作为阳性对照，根据以下公式计算药物对细胞的生长抑制率：抑制率(％)＝[a492(control)-a492(可利霉素)]/[a492(control)-a492(blank)]×100％

结果显示：可利霉素可以浓度依赖性抑制a549细胞增殖，其24和48h的ic50分别为24.88μg/ml和17.84μg/ml。

(2)可利霉素可抑制pi3k/akt/mtor通路

pi3k/akt/mtor信号通路的异常在多种肿瘤类型中频繁发生。pi3k是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，pi3ks蛋白家族参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。akt(蛋白激酶b)是pi3k下游主要的效应物，akt可以通过直接磷酸化mtor或通过失活tsc2(结节性硬化复合物2)从而激活mtorc1。mtorc1直接磷酸化下游的真核翻译起始因子结合蛋白4e-bp1和核糖体蛋白s6激酶1s6k1，从而调节细胞的生物合成以及增殖。

使用不同浓度的可利霉素处理a549细胞24和48h，通过westernblot方法对细胞中的mtor蛋白水平及其上下游蛋白水平进行考察。结果发现，5μg/ml以上的可利霉素作用a549细胞24h，可以降低mtor以及下游4e-bp1和s6k1的蛋白磷酸化水平，同时，也下调了pi3k、akt的磷酸化水平。

5、17、50μg/ml的可利霉素处理a549细胞48h后，mtor的磷酸化水平显著性降低，并显著性抑制mtor下游蛋白磷酸化水平，但5、17μg/ml的可利霉素升高了pi3k和akt的磷酸化水平，50μg/ml的可利霉素却可以显著性地降低pi3k和akt的磷酸化水平。

上述结果证明，可利霉素通过抑制mtor以及下游蛋白的磷酸化水平，抑制细胞的蛋白质合成，从而抑制a549细胞增殖。结果说明中低浓度的可利霉素对mtorc1的抑制程度较高，作用48h存在对于mtorc2的负反馈激活。而大浓度的可利霉素可以同时作为mtorc1和mtorc2的双重抑制剂，并且不会引起负反馈激活作用(图4和图5所示)。

(3)可利霉素诱导a549细胞发生自噬

方法：荧光显微镜和流式细胞术检测细胞自噬

单丹磺酰尸胺(dansylcadaverine,mdc)是一种荧光色素，是嗜酸性染色剂，通常被用于检测自噬体形成的特异性标记染色剂酸性溶酶体的聚集在一定程度上能反映自噬的水平。

取对数生长期的a549细胞接种于6孔板中，每孔2×105个细胞。培养24h后，弃去培养液，加入不同的药物作用24或48h后，pbs洗涤一次，加入含有0.05mmmdc等体积的培养液于37℃避光孵育20min，pbs洗涤1次，使用荧光显微镜进行观察或用流式细胞术检测。

结果：mtorc1可以通过结合ulk1复合物抑制自噬，因此，我们对可利霉素处理24和48h的细胞自噬水平进行了考察。通过mdc染色结果可以发现，对照组细胞发出均匀的绿色荧光，随着可利霉素浓度升高，细胞出现了明显的亮绿色荧光聚集颗粒。流式细胞术结果显示药物处理后，mdc染色阳性率增加，24h和48h的结果一致(如图6a和图6b所示)。

lc3是自噬标记性蛋白，当细胞发生自噬时，细胞内lc3ⅰ型向ⅱ型的转化水平会明显增加。p62是自噬的底物，当细胞自噬发生时，p62会介导自噬底物与自噬体的结合，进而会同自噬底物一同被包裹进入溶酶体而降解。因此，当细胞发生自噬时，细胞内p62的表达水平会降低。通过westernblot方法检测发现，可利霉素加入后可以使自噬底物p62水平降低，自噬相关蛋白lc3ⅰ型向ⅱ型转化增加，24h和48h的结果一致(如图7)。以上结果均证明可利霉素能诱导a549细胞发生自噬。

由于细胞自噬对肿瘤细胞有双重作用，既可保护细胞，也可杀伤细胞。因此，我们使用了自噬的抑制剂3-ma对可利霉素诱导的细胞自噬在a549细胞死亡过程中所发挥的作用进行考察。加入自噬抑制剂3-ma后，降低了可利霉素对a549细胞生长抑制作用(图8)，说明可利霉素诱导的自噬抑制了a549细胞增殖。

(4)可利霉素诱导a549细胞发生凋亡

方法：annexinv是一种分子量为35kda的ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能够特异性结合磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine,ps)。磷酯酰丝氨酸主要分布在细胞膜内侧，当细胞发生凋亡时，细胞会把磷酯酰丝氨酸外翻到细胞表面，即细胞膜外侧。fitc标记annexinv探针，即annexinv-fitc，能够特异性的结合这些外翻的磷酯酰丝氨酸，通过流式细胞仪或荧光显微镜非常简单而直接地检测到细胞发生凋亡的情况。

碘化丙啶(propidiumiodide,pi)，是一种核酸染料，它不能通过正常细胞膜，当细胞处于坏死或凋亡中晚期状态下，细胞丧失膜完整性，碘化丙啶进入细胞内部，与细胞核内的核酸发生结合，通过流式细胞仪或荧光显微镜检测，反映细胞膜完整状态的信息。故将annexinv-fitc与pi联合使用，将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

取对数生长期的a549细胞接种于6孔板中，每孔2×10⁵个细胞。培养24h后，弃去培养液，加入不同的药物作用24或48h后，pbs洗涤一次，加入配置好的凋亡染色液(250μlbindingbuffer,7.5μlannexinv-fitc,10μlpropidiumiodide,混匀)，室温避光孵育15min，随即进行荧光显微镜观察及流式细胞术检测。

结果：为了确认可利霉素作用于a549细胞的机制，采用av-pi染色考察并使用流式细胞术区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及坏死细胞。caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中，caspase3作为凋亡的下游执行蛋白，它与dna断裂、染色质凝聚和凋亡小体形成有关。因此，我们使用试剂盒和westernblot方法对caspase3的蛋白酶活力和蛋白水平进行了考察。

结果发现，可利霉素处理a549细胞24h，17、50μg/ml开始出现绿色荧光，并无红色荧光，流式细胞术发现50μg/ml浓度的细胞出现早期凋亡的细胞(图10)，caspase3的蛋白水平无明显增加，parp原型未被剪切(图11a)。可利霉素处理a549细胞48h，随着浓度增加，细胞开始胞质皱缩，出现凋亡小体(图9)，av-pi结果显示，5及17μg/ml出现了明显的绿色荧光、50μg/ml的细胞核出现明显的红色荧光，流式细胞术细胞术发现5及17μg/ml出现早期凋亡的细胞数升高，50μg/ml出现大量晚期凋亡细胞(图10)，caspase3由前体向活化形式的转化增加，作为底物的parp被剪切(图11b)，caspase3的酶活力增加(图12)，证明了细胞发生了凋亡。

(5)可利霉素降低hif-1α蛋白水平

缺氧及其它因素如胰岛素、生长因子可诱导hif-1α的表达，而过度活化的mtor在氧气充足的条件下也可从转录水平激活hif-1α的表达，进而导致其下游血管内皮生长因子vegf等血管形成基因的转录，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。

通过westernblot方法检测发现，可利霉素处理a549细胞24及48h，血管生物合成蛋白hif-1α、vegf-a的蛋白水平显著性降低(图13)，提示可利霉素可能通过抑制a549缺氧诱导因子的蛋白水平，起到抑制肿瘤细胞增殖的作用。

(6)可利霉素对erk信号传导通路的影响

ras/raf/mek/erk信号通路是将胞外信号传递到细胞核内最重要的信号通路之一，在调控细胞存活、増殖、分化、凋亡、代谢等功能中具有关键的作用。

可利霉素处理a549细胞24h，可以升高ras、raf蛋白水平和erk的蛋白磷酸化水平；同时，可利霉素处理a549细胞48h，可以升高ras、raf蛋白水平，中浓度药物可以使erk的磷酸化水平显著升高，高浓度的药物处理却降低了erk的磷酸化水平，结果如图14。

(7)可利霉素对a549细胞周期的影响

不同浓度的可利霉素分别处理a54924及48h后，使用pi流式细胞术对其细胞周期分布进行检测。发现药物处理24h，对细胞周期无明显影响。药物处理48h后，与对照组相比1.7μg/ml、5μg/ml、17μg/ml及50μg/ml的s期细胞分别增加了1.86％、9.39％、4.75％、24.38％。综上数据，可利霉素处理48h呈浓度依赖性诱导a549细胞s期阻滞。

由以上试验例中可以看出，a549细胞中加入可利霉素24h后，mtor的磷酸化水平显著性降低，并显著性抑制mtor下游的真核翻译起始因子结合蛋白4e-bp1和核糖体蛋白s6激酶1s6k1的磷酸化水平，通过降低肿瘤细胞的蛋白生物合成减慢肿瘤细胞的增殖速度，且下调pi3k的磷酸化水平，对akt的磷酸化水平无明显影响。可利霉素处理a549细胞48h后，仍可以下调mtor通路的蛋白磷酸化水平，但在中浓度反馈性地激活了pi3k/akt通路，导致pi3k和akt的磷酸化水平显著升高。然而却在大浓度(50μg/ml)时重新抑制了pi3k和akt蛋白的磷酸化水平。因此，大胆推测，可利霉素可能为mtorc1和mtorc2的双重抑制剂，中小浓度条件下，可利霉素对mtorc1的抑制程度较强，但药物作用48h存在较强的负反馈调节；在大浓度条件下，对mtorc2也有一定的抑制作用。

通过相差显微镜观察经可利霉素处理后的a549细胞48h，可以观察到细胞皱缩、染色质凝聚，形成明显的凋亡小体和凋亡小花，jc-1染色结果显示，随着药物浓度增加，呈现绿色荧光的细胞比例逐渐增加，表明可利霉素可以浓度依赖性地降低a549细胞线粒体膜电位。我们使用westernblot方法检测凋亡相关蛋白的水平。procaspase-3蛋白水平降低，cleaved-caspase3蛋白水平升高，同时，caspase-3底物parp降解，表明可利霉素诱导a549细胞凋亡激活了caspase级联反应。bax水平增加，bcl-xl和bcl-2水平降低。因此，可利霉素处理48h通过诱导a549细胞发生凋亡，从而抑制肿瘤细胞增殖。以上数据表明可利霉素处理24h，产生的凋亡现象不明显，48h出现明显的浓度依赖性的凋亡现象，并从早期凋亡向晚期凋亡转变。

可利霉素作为mtor的抑制剂，可以明显地提高a549细胞lcⅰ型向ⅱ型转化，下调自噬底物p62的蛋白水平，同时mdc染色和流式也证明了自噬的增加。加入自噬抑制剂3-ma后，可利霉素对a549的抑制作用降低，证明，可利霉素诱导a549细胞自噬为损伤性自噬，即可利霉素通过增加细胞自噬水平抑制a549细胞增殖，而24h和48h均出现了较明显的自噬现象，在细胞发生凋亡前，可利霉素可能主要通过诱导自噬抑制细胞存活。本发明中可利霉素处理a549细胞24h，erk的蛋白磷酸化水平显著性升高，因此考虑为抑制pi3k/akt/mtor通路激活了ras/raf/mek/erk通路。

总之，可利霉素可以浓度依赖性抑制人非小细胞肺癌a549增殖，诱导细胞凋亡；可以作为mtorc1和mtorc2的双重抑制剂，在中低浓度下，以抑制mtorc1为主，会引起pi3k，akt的负反馈激活，在高浓度下，可以抑制mtorc2，下调pi3k，akt的蛋白磷酸化水平；可以诱导a549细胞发生自噬，而自噬发挥杀伤细胞的作用；可以引起a549细胞发生s期阻滞；另外，可利霉素还激活了ras/raf/erk途径，ras、raf蛋白水平上调，erk的磷酸化水平升高。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。