二氢杨梅素在制备铁过载疾病治疗药物中的应用的制作方法

本发明属于制药领域，具体涉及二氢杨梅素在制备铁过载疾病治疗药物中的应用。

背景技术：

铁过载主要由基因突变导致，这些基因包括编码hepcidin的基因hamp，各种各样调节hepcidin表达的基因以及hepcidin目标蛋白fpn的基因。hepcidin的缺少或者fpn对hepcidin出现抗性均能导致血色沉着病。遗传血色沉着病的典型特征是肠道吸收过多的铁，机体组织器官出现铁沉积并伴有损伤出。根据血色沉着病发病的年龄和严重程度的不同，会出现不同的病理症状。在肝脏中会出现肝硬化和肝癌，心脏铁过载会导致心脏衰竭，而一些内分泌腺的铁过载会导致生长受阻、性成熟推迟以及糖尿病等症状。

铁过载还可以出现在铁代谢调节相关基因未发生突变的情况下，一般主要由输血或病理情况导致的过量铁摄入。输血是治疗β-地中海贫血症或者镰刀型贫血症的主要手段，输入的红细胞中含有大量的铁可被巨噬细胞循环利用，然而机体缺少铁的排泄机制，因此会导致过多的铁沉积在患者体内。其中心脏铁沉积较为明显，会导致心脏铁毒性。在红细胞形成障碍过程中，机体能够抑制hepcidin的表达，从而导致过量铁的吸收。此外，由其它疾病诱导的次级铁过载是加快相关疾病恶化的主要因素。丙型肝炎、肝细胞癌、非酒精性脂肪肝以及遗传型的ⅰ型酪氨酸血症等均能够诱导肝脏的铁沉积。

二氢杨梅素(dihydromyricetin)属于一种多酚类化合物，也是较为特殊的一种黄酮类化合物，除具有黄酮类化合物的一般特性外，还具有解除醇中毒、预防酒精肝、脂肪肝、抑制肝细胞恶化、降低肝癌的发病率等作用。外观:纯白色粉末。溶解性：25℃。水中溶解度为4％，热水中溶解度更大，易溶于乙醇及丙酮，极微溶于醋酸乙酯。多酚类是指一组植物中化学元素的统称，因具有多个酚基团而得名，包括黄酮类、单宁类、酚酸类以及花色苷类等。多酚类物质具有抗氧化、强化血管壁、促进肠胃消化、降低血脂、增加机体抵抗力，阻止动脉硬化、抑制血栓形成等功效。多酚化合物的共同特点是具有良好的抗氧化活性，能与维生素c、e和胡萝卜素等其他抗氧化物在体内一起发挥抗氧化功效，清除有害人体健康的自由基。因为铁过载带来的直接损伤是其催化生成的活性氧自由基，而多酚类的抗氧化特性可能具有对抗活性氧自由基的效果。

然而大部分的多酚类物质并没有预想中的作用效果。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有技术缺陷，并提供一种二氢杨梅素在制备铁过载疾病治疗药物中的应用。

本发明所采用的具体技术方案如下：

所述二氢杨梅素分子式如下所示：

作为优选，铁过载疾病为铁过载导致的细胞死亡。

作为优选，所述的铁过载由8-羟基喹啉铁诱导引起。

作为优选，所述的细胞死亡为过量铁离子催化生成的大量活性氧自由基导致。

作为优选，所述的二氢杨梅素通过清除活性氧的生成、螯合自由铁从而抑制细胞死亡。

本发明的研究思路为:

1)通过对细胞培养液中添加8-羟基喹啉铁诱导细胞铁过载，以建立铁过载导致的细胞死亡模型。

2)细胞活性实验表明二氢杨梅素能够有效地保护fe-8hq诱导的aml12细胞和ht-1080细胞死亡。

3)在此基础上，发现其保护效果主要是通过清除活性氧的生成，螯合自由铁，维持细胞内铁蛋白的水平进而实现细胞免受损伤。

本发明相对于现有技术而言，具有以下有益效果：

本发明为制备铁过载疾病治疗药物提供了一种新的技术方案。通过二氢杨梅素抑制铁过载引发的铁离子刺激生成的活性氧。二氢杨梅素可以通过清除活性氧的生成，螯合自由铁，维持细胞内铁蛋白的水平进而实现细胞免受损伤。因此二氢杨梅素可以运用于治疗铁过载的相关疾病。本发明为后续新型治疗药物的制备提供了借鉴。

附图说明

图1为用对照、10μmfe-8hq、10μmfe-8hq+二氢杨梅素处理aml12细胞4小时后的细胞活性。

图2为用对照、10μmfe-8hq、10μmfe-8hq+二氢杨梅素处理ht1080细胞4小时后的细胞活性。

图3为用dmso、10μmfe-8hq、10μmfe-8hq+10μm二氢杨梅素、10μm二氢杨梅素处理细胞4小时后，细胞胞质活性氧的生成情况。

图4为用dmso、10μmfe-8hq、10μmfe-8hq+10μm二氢杨梅素、10μm二氢杨梅素处理细胞4小时后，细胞线粒体活性氧的生成情况。

图5为用dmso、10μmfe-8hq、10μmfe-8hq+10μm二氢杨梅素、10μm二氢杨梅素的培养基处理aml12细胞2小时后，ferritin-h和ferritin-l的蛋白表达情况。

图6为用dmso、10μmfe-8hq、10μmfe-8hq+10μm二氢杨梅素、10μm二氢杨梅素培养基处理60分钟后，细胞胞内铁含量。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。

实施例所用的aml12细胞(小鼠肝脏细胞)和ht-1080细胞(nras突变的人成纤维肉瘤癌细胞购)自atcc细胞库。

实施例所用的主要试剂为：

氯化铁六水合物、8-羟基喹啉(8hq)、dmso(dimethylsulfoxide，二甲基亚砜)、地塞米松购自sigma公司(上海，中国)；calcein-am(钙黄绿素-乙酰羟甲基酯)购自abcam公司；dmem/f12细胞培养基、fbs(胎牛血清)、pbs、赤霉素链霉素溶液、its(胰岛素-转铁蛋白-硒)试剂、edta-胰蛋白酶购自gibco公司；accutase细胞消化液购自bd公司；细胞活性检测cck-8(cellcountingkit-8)试剂、二氢杨梅素购自medchemexpress公司；hbss缓冲液；ros检测试剂cm-h2dcfda购自invitrogen公司；哺乳动物蛋白提取试剂盒，5×loadingbuffer蛋白酶抑制剂购自弗德生物技术有限公司(杭州，中国)；bca蛋白测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司(海门，中国)；fth1(a1144)，ftl(a1768)均购自爱博泰克生物科技有限公司(武汉，中国)；其余未提及试剂均购自sigma(上海，中国)。

以下实施例的主要仪器为：

sanyo细胞培养箱(日本)，超净台，leicadcf295显微镜(意大利)，bdfacscalibur流式细胞仪(美国)，eppendorf离心机(德国)，spectramaxm5微孔板检测系统(moleculardevices公司，美国)，25cm²细胞培养瓶，96孔、6孔细胞培养板。

流式数据采用flowjo_v10软件分析并作图，其他所有数据均以平均值±标准差(means±sd)或means+sd表示。数据分析采用graphpadprism(version5.01)的one-wayanova进行统计分析，多重比较采用bonferroni检验。p<0.05为差异显著。

细胞培养的方法为：

将aml12细胞培养在含有10％fbs，100nm地塞米松，1％its,100μg/ml链霉素和100iu/ml青霉素的dmem/f12培养基中。将ht1080细胞培养在含有10％fbs，100μg/ml链霉素和100iu/ml青霉素的dmem培养基中。所有细胞培均养于37℃，5％co2的细胞培养箱内，生长融合至80％～90％时用胰酶消化传代。

fe-8hq母液的配置：按铁：8-羟基喹啉1:2摩尔比将氯化铁六水合物与8-羟基喹啉溶解于dmso，混匀至完全溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤即为fe-8hq母液。

培养基的配置及使用方法为：aml12细胞要用dmem/f12培养基培养；ht-1080细胞要用dmem培养基培养。若需在培养基中添加fe-8hq等化合物，只需将上述化合物以大于10000的稀释倍数稀释于所需培养基中即可。所述对照即为不添加任何化合物的培养基。

实施例1：细胞活性检测

1)将生长融合至80％～90％的ht1080细胞和aml12细胞，消化离心后，以每孔1×10⁴个细胞数接种至96孔细胞培养板培养24小时；

2)向含有细胞的96孔板中分别加入对照、10μm二氢杨梅素；然后向每个孔板中加入fe-8hq10μm处理4h，每组设置6个重复；

3)在37℃，5％co2条件细胞培养箱中培养；

4)小心吸取96孔板中的处理液，并添加提前配制好的含有10％cck-8细胞活性检测试剂的细胞培养基，继续在37℃，5％co2条件细胞培养箱中培养1～4小时；

5)在spectramaxm5微孔板检测系统上检测细胞活性，cck-8检测参数为450nm。

6)计算细胞活性，各组细胞活力为各组测定数值比上对照组数值并乘以100％。

细胞活性测定结果如图1、图2所示。

实施例2：细胞胞质活性氧ros测定。

细胞内存在着各种各样的ros，能够被特异的试剂染色，其中细胞质ros可以用cm-h2dcfda染色。

1)试验前一天，将生长融合至80％～90％的人成纤维肉瘤癌ht1080细胞，消化离心后，以每孔2×10⁵个细胞数，接种至6孔细胞培养板，细胞生长24小时；

2)用含dmso、10μmfe-8hq、10μmfe-8hq+10μm二氢杨梅素、10μm二氢杨梅素处理细胞4小时；

3)处理时间到后，弃去六孔板中培养液，用pbs轻轻洗涤两次，每孔加入600μlaccutase细胞消化液消化细胞，之后加入培养基终止消化，轻微吹打并收集细胞，在2500rpm转速下离心5分钟；

4)弃去上清后加入含有5μmcm-h2dcfda的hbss缓冲液500μl重新悬浮避光染色10分钟，染色在37℃细胞培养箱中进行；

5)染色时间到后，在2500rpm转速下离心5分钟后弃去上清，用新鲜的500μlhbss缓冲液重新悬浮，通过bdfacscalibur流式细胞仪的fl1通道检测cm-h2dcfda荧光信号，至少收集10000个细胞数用以分析计算，流式数据采用flowjo_v10软件处理。每个试验进行三次独立操作。结果如图3所示。

实施例3：细胞线粒体活性氧ros测定。

细胞内存在着各种各样的ros，能够被特异的试剂染色，其中线粒体ros能够被mitosoxred染色。

1)试验前一天，将生长融合至80％～90％的人成纤维肉瘤癌ht1080细胞，消化离心后，以每孔2×10⁵个细胞数，接种至6孔细胞培养板，细胞生长24小时；

2)用含dmso、10μmfe-8hq、10μmfe-8hq+10μm二氢杨梅素、10μm二氢杨梅素处理细胞4小时；

3)处理时间到后，弃去六孔板中培养液，用pbs轻轻洗涤两次，每孔加入600μlaccutase细胞消化液消化细胞，之后加入培养基终止消化，轻微吹打并收集细胞，在2500rpm转速下离心5分钟；

4)弃去上清后加入含有5μmmitosoxred的hbss缓冲液500μl重新悬浮避光染色10分钟，染色在37℃细胞培养箱中进行；

5)染色时间到后，在2500rpm转速下离心5分钟后弃去上清，用新鲜的500μlhbss缓冲液重新悬浮，通过bdfacscalibur流式细胞仪的fl2通道检测mitosoxred荧光信号，至少收集10000个细胞数用以分析计算，流式数据采用flowjo_v10软件处理。每个试验进行三次独立操作。结果如图4所示。

实施例4：westernblot方法分析蛋白表达量

1)试验前一天，将生长融合至80％～90％的细胞，消化离心后，接种至60mm细胞培养皿，细胞生长24小时；

2)细胞处理，dmso、10μmfe-8hq、10μmfe-8hq+10μm二氢杨梅素、10μm二氢杨梅素处理aml12细胞2小时；

3)处理时间到后，小心倾倒贴壁细胞的培养液，采用弗德生物技术有限公司的哺乳动物细胞蛋白提取试剂盒提取，裂解液中按1:99比例加入蛋白酶抑制剂，每个培养皿中加入500μl上述裂解液，在冰上用枪头吹打贴壁细胞，将裂解液转移至离心管中，冰上孵育20分钟，让细胞充分裂解；

4)14000g离心10分钟，转移上清液至新管中即为蛋白提取物；

5)bca法测定蛋白样品浓度，并根据测定蛋白浓度，使用裂解缓冲液调整蛋白至合适浓度，加入5×loadingbuffer并煮沸5分钟；

6)配制浓缩胶和分离胶后进行sds-page电泳，80v运行30min，转换为120v运行，当染料到达胶的底部，停止电泳，立即进行下一步的转膜；

7)利用湿氏转膜系统，将蛋白转至0.45μm孔径的nc膜，转膜条件为200ma，4℃，72分钟(β-actin)，40分钟(fth、ftl)；

8)取出nc膜，放入3％脱脂奶粉溶液(tbst配置)中室温封闭1小时；

9)一抗孵育，加入fth抗体(1：1000稀释)或ftl(1：1000稀释)或者β-actin抗体(1：7000稀释)，4℃孵育过夜，tbst洗脱4次，每次5分钟；

10)二抗孵育，加入与一抗对应的二抗常温孵育l小时，tbst洗脱5次，每次5分钟；

11)ecl显色，曝光拍照。

实验结果如图5所示。

实施例5：细胞内铁水平测定

1)试验前一天，将生长融合至80％～90％的人成纤维肉瘤ht-1080细胞，消化离心后，以每孔2×10⁵个细胞数，接种至6孔细胞培养板，细胞生长24小时；

2)用含dmso、10μmfe-8hq、10μmfe-8hq+10μm二氢杨梅素、10μm二氢杨梅素培养基处理60分钟；

3)处理时间到后，弃去六孔板中培养液，用pbs轻轻洗涤两次，加入含有100nmcalcein-am的1mlpbs，在细胞培养箱中染色15分钟；

4)染色时间到后，每孔加入600μlaccutase细胞消化液消化细胞，加入2mlpbs收集细胞至离心管中，在2500rpm转速下离心5分钟，弃去上清后加入500μlpbs重新悬浮；

5)通过bdfacscalibur流式细胞仪的fl1通道检测细胞荧光信号，至少收集10000个细胞数用以分析计算，流式数据采用flowjo_v10软件处理。其他细胞内铁水平测定，除处理试剂浓度和处理时间不同外，均按照上述操作进行。每个试验进行三次独立操作。

实验如图6所示。

结果分析

实施例1表明，二氢杨梅素能有效地保护fe-8hq诱导的aml12和ht-1080细胞死亡(如图1和图2)，接下来对二氢杨梅素产生效果的原因进行验证。实验结果表明二氢杨梅素能有效地抑制fe-8hq诱导的细胞质活性氧的生成(图3)。同样，它们也可以有效的清除线粒体中的活性氧的生成(图4)。除了ros清除功能外，二氢杨梅素能够螯合自由铁，维持细胞内ferritin-h和ferritin-l蛋白的水平(图5)，限制了一部分自由铁的释放，进而抑制了fe-8hq细胞内铁水平的升高(图6)。因此，二氢杨梅素是在制备铁过载疾病治疗药物中具有较大应用前景。

以上所述的实施例只是本发明的一种举例方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。