曲美他嗪作为Nox-2/TRPC3通路抑制剂的应用的制作方法

本发明属于化学药物技术领域，尤其涉及曲美他嗪作为nox-2/trpc3通路抑制剂的应用。

背景技术：

曲美他嗪是一种已上市的药物，多数研究证实，曲美他嗪是一种部分脂肪酸氧化抑制剂，已成为一种有前途的治疗选择，已在80多个国家得到应用。曲美他嗪具有经过验证的药代动力学和安全性，毒副作用小，已被用于治疗心肌梗塞(mi)和心力衰竭(hf)的临床患者，并在实验动物中获得大量研究。将上市药物进行再次开发，能够显著提高药物开发的成功率，曲美他嗪作为上市药物，其应用还需要进行拓展。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了曲美他嗪作为nox-2/trpc3通路抑制剂的应用，用于拓展曲美他嗪的应用。

本发明的具体技术方案如下：

曲美他嗪作为nox-2/trpc3通路抑制剂的应用。

本发明还提供了曲美他嗪在制备用于抑制nox-2/trpc3通路的药物中的应用。

nox-2为烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(nadph)氧化酶，在氧化应激过程中起到重要作用，直接促进活性氧自由基(ros)的生成。trpc3是一种经典瞬时电位通道，可协助nox-2促进氧化应激水平。实验结果表明，曲美他嗪能够作为nox-2/trpc3通路抑制剂，抑制nox-2和trpc3的表达。

优选的，所述药物用于预防和/或治疗心肌病。

优选的，所述心肌病选自糖尿病性心肌病、缺血性心肌病、细胞肥大引起的心肌病或扩张型心肌病。需要说明的是，心肌病还包括其他代谢异常引起心肌病。

曲美他嗪能够缓解心肌病带来的心肌肥大和心力衰竭，缓解心肌病症状，包括但不限于心脏舒张和收缩功能失常、心肌重构与心肌肥大、心肌组织氧化压力增强、炎症反应加剧、纤维化显著升高和心肌发生重构等。

优选的，所述心肌病为糖尿病性心肌病。

心血管疾病发生率的增加是糖尿病人高死亡率的重要原因，虽然如冠心病、动脉粥样硬化和高血压等血管疾病在糖尿病引起的心脏功能紊乱中起到重要作用，但是糖尿病可以直接促使心脏组织的结构和功能发生改变，这种由糖尿病直接引起的心脏病一般称为糖尿病性心肌病，排除了酒精滥用、高血压、冠心病和其它结构性心脏病所致的心力衰竭，仅仅由糖尿病引发心功能紊乱、结构异常和心衰的糖尿病人。大量的临床观察和展望研究数据均证实了糖尿病与心肌病变、心肌肥大及心衰的因果关系，并且这一关联性独立于其他疾病，从而为糖尿病性心肌病作为一个独立的临床指征提供了强有力的证据。

糖尿病性心肌病的病变展现为两个阶段：第一阶段是短期的，是对代谢变化的生理学适应阶段；而第二阶段则是退行性的改变，此时心肌组织修复能力受损，导致心脏功能进一步恶化直至心衰。因此，一旦糖尿病发展到引起心肌病变阶段，病人预后情况将会很差，疾病的治疗和护理也受到极大挑战。因此，及早介入治疗，根据糖尿病心肌病变病理学的复杂性，开发更有针对性的抗糖尿病性心肌病的药物，有效延缓甚至阻断糖尿病对心脏的损伤，将是未来医药生物学发展的新趋势。

在糖尿病的高血糖和/或高血脂条件下，心肌细胞受到持续的损伤，心脏功能无法保持原有状态，依次出现舒张功能异常和收缩功能紊乱，更容易进入失代偿和心衰阶段。其中，高血糖是心脏代谢、功能和结构改变的核心驱动力。无论是临床研究还是大量的动物实验数据，均表明糖尿病性心肌病的早期以心脏舒张功能异常为主，包括(等容)舒张期延长、舒张晚期二尖瓣血流速率增加、减速时间延长、左心室舒张末期压力升高等。舒张功能异常阶段，主要的细胞分子生物学机制是氧化应激水平增强引起心肌细胞凋亡和炎症反应，进而刺激心肌肥大，同时并发间质纤维化。当心脏进入收缩功能受损时，心肌细胞凋亡增多，纤维化胶原沉积剧烈，心脏可塑性下降，僵硬度增加，左心室射血分数(lvef)显著降低，收缩压、平均纤维周径缩短速度(vcf)和缩短分数(fs)均下降，收缩末期直径和容积增加。

糖尿病心肌病变的病理学过程是多种因素相互作用的复杂过程，包括自主功能紊乱、代谢失调、钙稳态异常、结构蛋白改变、氧化压力增加、炎症反应增强和间质纤维化等多种机制假说并存，实际上这正好说明了糖尿病性心肌病病理学机制的复杂性。糖尿病引起的高血糖和/或高血脂和高胰岛素血症，使心脏代谢环境发生极大变化，这些异常改变进而引起心脏在细胞、结构和功能方面发生剧烈变化，导致心衰的发生。

由于高血糖是引起各种代谢底物供应和利用异常、钙离子稳态失衡、脂质代谢紊乱等各种损害的主要因素，因此控制血糖一度被认为是治疗糖尿病性心肌病的合理而有效的策略。的确，许多动物实验和临床研究均证实严格控制血糖可以有效提高心脏功能，流行病学研究也表明降低血糖可以减少心血管疾病发生率。然而，降血糖治疗无法从根本上治疗心肌病变，而且也有临床研究证实血糖控制对心血管原因导致的死亡没有显著效果。

作为一种复杂的代谢疾病，糖尿病的特征是高血糖，许多相互作用的因素导致广泛的并发症，与炎症和氧化应激密切相关。通常认为ros形成将导致炎症反应。因此，抑制ros产生可能是治疗糖尿病性心肌病的有效方法。大量研究表明，高血糖刺激nox2高表达，从而增加线粒体外ros生成，而trpc3作为一种离子通道，通过促进钙离子内容，与nox-2相互结合并增加nox-2活性，大大促进ros的产生，从而引发心脏结构和功能异常。这些疾病通常会在受影响的患者中最终导致心力衰竭甚至死亡。目前，没有专门针对糖尿病性心肌病定制的治疗剂，并且开发用于治疗该病症的药理学剂非常重要。

目前，研究中常用于治疗糖尿病引起的心肌病变的药物主要有：磺脲类、二甲双胍、噻唑烷二酮类、glp-1类似物、胰岛素、dpp-4抑制剂、raas抑制剂、arb和β-阻断剂。虽然这些药物对糖尿病性心肌病具有一定的疗效，但也存在明显的不足之处。例如，口服降糖药噻唑烷二酮类药物会促进肾收集管细胞重吸收钠引起水钠潴留，增加心衰的风险，还促进体重增加，导致外周水肿。又如，β-阻断剂用于非糖尿病人会会增加糖尿病风险；对于血管紧张素-转化酶(ace)抑制剂，有部分糖尿病人(约20％)不能忍受这类药物，而且这类药物无法完全逆转左心室重构和功能紊乱。此外，抗氧化剂理论上是一种理想的对抗糖尿病性心肌病的治疗调节剂，大量实验研究证实各种抗氧化剂对治疗糖尿病心肌病变都有不同程度的疗效，但是随机临床研究结果未证明抗氧化剂对心血管高风险病人具有有益效果，这可能与疾病状态、抗氧化剂的具体作用机制、氧化应激控制水平等多种因素有关。因此需要更有针对性的药物用于糖尿病引起的心肌病变。

无论是一型糖尿病的胰岛素缺乏，还是二型糖尿病的胰岛素抵抗，都会引起机体内血糖升高，长期的高血糖会直接促使心脏发生病变，包括结构和功能的改变，这种糖尿病并发症即为糖尿病性心肌病。糖尿病人发生糖尿病性心肌病的几率非常高，而且该并发症是糖尿病人死亡的主要原因。由于发病因素多样，致病机制复杂，给药物开发带来难度，因此目前临床上尚无特异性治疗糖尿病性心肌病的药物，一般通过降血糖或抗心脏病药物如血管紧张素转化酶抑制剂或β-阻断剂等来治疗糖尿病性心肌病，但治疗效果不够理想，因而临床亟需开发能够特异性针对糖尿病性心肌病各种主要发病因素、治疗效果显著的药物。尽管控制血糖对糖尿病引起的心脏病有一定的疗效，但有大量的糖尿病人无法有效控制血糖，这类病人的治疗难度更大。

糖尿病性心肌病是一种多因素诱发的复杂疾病，其中，增强的氧化应激起着至关重要的作用。除了线粒体促进活性氧自由基(ros)生成之外，nadph氧化酶-2(nox-2)也显著促进糖尿病心脏的氧化应激并进一步引起纤维化。同时，瞬时受体电位通道3(trpc3)一定程度上促进钙离子内流，与nox2共同作用，在心脏重塑过程中发挥关键作用。长期以来，糖尿病性心肌病是糖尿病患者死亡的重要因素，发生心肌病的风险比非糖尿病患者高2-5倍。因此，迫切需要开发用于该疾病的临床治疗方法和药物。

糖尿病性心肌病的心脏功能严重受损，无法为维持机体正常功能提供充足的养分和氧气，主要表现为高血糖引起心脏舒张和收缩功能失常，包括但不限于左心室舒张末压力(lvedp)升高，左心室压力下降的最大速率(dp/dtmin)下降，左心室收缩末压力(lvesp)降低，左心室压力上升的最大速率(dp/dtmax)下降，平均动脉压(map)降低，心输出量(co)下降。

本发明结果表明曲美他嗪可以显著降低左心室舒张末压力，升高左心室压力下降的最大速率、左心室收缩末压力、左心室压力上升的最大速率和平均动脉压，从而使糖尿病引起的心功能异常恢复到正常或接近正常的水平，提高心脏输出量，从而维持心脏良好收缩能力，保证循环系统正常。

糖尿病状态下，高血糖会刺激氧化应激状态大大增强，nox-2和trpc3蛋白水平升高，此时ros水平高居不下。而且，氧化应激会导致心肌细胞凋亡，引起成纤维细胞增殖，诱导炎症反应。这些因素进一步引起心脏结构异常，包括但不限于心肌细胞肥大、心脏质量明显增加、心肌组织纤维化增强、胶原蛋白沉积增多以及整个心脏宏观的组织结构发生显著的改变，从而导致心脏无法行使正常的功能。

本发明曲美他嗪减低心肌组织内nox-2和trpc3蛋白的水平，从而显著抑制高血糖引起的心肌组织氧化压力升高，组织内ros水平下降。曲美他嗪能够抑制氧化应激而进一步抑制心肌组织内炎症信号通路，与氧化应激和炎症反应有关的基因表达大大下降，这些基因包括但不限于nox-2、nadph氧化酶亚单位p22phox和p47phox、超氧化物歧化酶sod-2、白介素1β(il-1)、单核细胞趋化蛋白1(mcp-1)、血管内皮细胞黏附分子1(vcam-1)和细胞间粘附分子1(icam-1)等。

更进一步的，本发明曲美他嗪可以显著抑制糖尿病引起的心肌细胞肥大，降低高血糖引起的心脏质量(心脏/胫骨长度比)增加，抑制纤维化和胶原蛋白的沉积。更进一步的，本发明曲美他嗪可以抑制纤维化相关基因的表达，包括但不限于转化生长因子β1(tgf-β1)、信号通路转导蛋白smad-3、一型胶原蛋白(collageni)和三型胶原蛋白(collageniii)的表达。

本发明应用曲美他嗪，能够通过抑制氧化应激反应降低糖尿病引起的心功能下降及结构异常，可用于治疗主要由氧化应激水平升高促进的糖尿病性等多种心肌病。

本发明中，曲美他嗪有效抑制心脏组织内nox-2和trpc3的蛋白水平，从而阻断活性氧自由基(ros)的产生，缓解氧化应激反应，减轻糖尿病性心肌病的症状，可显著抑制糖尿病引起的心肌细胞肥大和心脏质量增加，可显著阻断包括但不限于糖尿病引起的心肌组织内一型胶原蛋白和三型胶原蛋白的表达升高。

本发明将曲美他嗪作为氧化应激反应的抑制剂对抗氧化应激引起的糖尿病性心肌病，通过抑制nox-2和trpc3两种关键促氧化因子的表达，阻断心肌细胞内ros的生成，提高组织抗氧化能力。抑制氧化应激将进一步减轻心肌组织内炎症反应，从而缓解高血糖引起的心肌肥大和纤维化。曲美他嗪通过减轻糖尿病引起的心脏结构的改变，也缓解了心脏舒张和收缩功能的下降，从而可以有效对抗糖尿病性心肌病。

本发明中，曲美他嗪通过抑制nox-2和trpc3两种促氧化关键蛋白的表达，减少ros生成，降低机体组织内氧化应激水平，从而抑制有氧化应激升高引起的心肌病，如糖尿病性心肌病。同时，曲美他嗪可以显著抑制糖尿病高血糖诱发的心脏结构和功能的异常，包括舒张和收缩功能紊乱，心肌细胞肥大和心脏质量增加，以及心肌纤维化和胶原沉积等。

本发明还提供了一种用于抑制nox-2/trpc3信号通路活性的药物组合物，所述药物组合物包括曲美他嗪。

本发明还提供了一种用于治疗糖尿病性心肌病的药物组合物，包括曲美他嗪。

优选的，还包括β-阻断剂、血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素ⅱ受体拮抗剂。

本发明药物组合物中，曲美他嗪与β-阻断剂、血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素ⅱ受体拮抗剂的作用机制不同，曲美他嗪可协同β-阻断剂、血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素ⅱ受体拮抗剂，针对糖尿病的多种病症或继发性病症进行治疗，以达到协同增效的治疗效果。

本发明所述的曲美他嗪，可逆转糖尿病引起的心脏nox-2、p22phox和p47phox的mrna含量明显增加，并一定程度提高超氧化物歧化酶——sod-2的表达水平。此外，nox-2以及trpc3(细胞内ros形成的另一个关键因子)在糖尿病大鼠中显着增加，而曲美他嗪可以显著抑制nox-2和trpc3的表达。基于nox-2及trpc3、以及上述各种nadph氧化酶亚单位在糖尿病性心肌病升高的氧化应激水平中的重要作用，曲美他嗪抑制这些基因的表达，进而抑制ros生成，从而逆转糖尿病引起的心功能障碍。

许多研究报道了各种啮齿动物糖尿病模型中炎症细胞因子的组织和/或血液浓度增加，表明炎症对糖尿病性心肌病的发展有重要贡献。与此相符，本发明中，糖尿病大鼠循环系统和心脏组织内出现显著的炎症反应，表现为促炎症细胞因子tnf-α和il-6水平显著升高，以及心脏组织中的巨噬细胞浸润增强。上述结果与临床试验一致，表明糖尿病患者的促炎因子水平较高。本发明中，采用曲美他嗪处理后，糖尿病性心肌病大鼠心肌和血浆中的tnf-α、il-6水平显着下降，同时巨噬细胞浸润及il-1β、mcp-1、icam-1和vcam-1的表达水平显著下降。

本发明中，曲美他嗪通过抑制氧化应激和炎症反应，显着减轻糖尿病性心肌病的各项症状。链脲佐菌素(stz)注射12周后，左心室收缩功能障碍在糖尿病组中显着增加。在用曲美他嗪治疗的大鼠中，这些功能异常被逆转或显著减轻，表明曲美他嗪在舒张和收缩中均发挥有利效果。糖尿病性心肌病大鼠左心室肥大基因标志基因(anp和bnp)表达增加，伴随着糖尿病12周后心肌细胞大小(横截面积)增加。同时，观察到糖尿病诱导的左心室胶原蛋白含量和tgf-β1表达的增加。实验结果表明，糖尿病性心肌病大鼠心肌组织纤维化增加，胶原沉积和促纤维化基因表达明显升高。曲美他嗪处理可以降低间质胶原含量和部分相关基因的表达，具有显著的抑制糖尿病引起的心肌纤维化的效果。

综上所述，本发明提供了曲美他嗪作为nox-2/trpc3通路抑制剂的应用。本发明中，曲美他嗪通过抑制nox-2和trpc3的表达，阻断细胞质内ros的生成，大大降低细胞内氧化应激水平，能够实现对糖尿病性心肌病的治疗，曲美他嗪具有显著的缓解糖尿病性心肌病相关症状的效果，可以强力抑制糖尿病高血糖引起的心脏氧化压力升高，减少活性氧自由基(ros)水平，降低心肌组织内的炎症反应水平，阻断由于心肌细胞凋亡、心脏成纤维细胞增殖导致的纤维化重构。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1中糖尿病模型建立后各项指标图，包括体重(图1a)、空腹血糖(图1b)、晚期糖基化终末产物(图1c)和血浆胰岛素(图1d)；

图2为本发明实施例2进行中心功能检测的各项指标图，包括左心室舒张末期压力(图2a)、压力下降最大速率(图2b)、平均动脉压(图2c)、左心室收缩末期压力(图2d)、压力上升最大速率(图2e)和心输出量(图2f)；

图3为本发明实施例3进行氧化压力和活性氧自由基分析的各项指标图，包括trpc3/nox-2蛋白电泳图(图3a)、trpc3/nox-2蛋白表达分析图(图3b)、8-ohdg免疫染色图(图3c)、8-ohdg染色分析图(图3d)、nox-2的mrna含量(图3e)、p22phox的mrna含量(图3f)、p47phox的mrna含量(图3g)和sod-2的mrna含量(图3h)；

图4为本发明实施例4进行心肌组织炎症反应检测的各项指标图，包括tnf-α和il-6的血浆浓度(图4a)、tnf-α和il-6的组织浓度(图4b)、cd68免疫染色图(图4c)、cd68染色分析图(图4d)、il-1β的mrna含量(图4e)、mcp-1的mrna含量(图4f)、vcam-1的mrna含量(图4g)和icam-1的mrna含量(图4h)；

图5为本发明实施例5进行心肌肥大及相关检测的各项指标图，包括心肌细胞h&e染色图(图5a)、心肌细胞横截面积(图5b)、心脏/胫骨长度(图5c)、anp的mrna含量(图5d)、bnp的mrna含量(图5e)；

图6为本发明实施例6进行心肌组织纤维化及相关检测的各项指标图，包括天狼星红染色图(图6a)、纤维化强度(图6b)、tgf-β的mrna含量(图6c)、smad-3的mrna含量(图6d)、一型胶原蛋白的mrna含量(图6e)；

其中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

具体实施方式

本发明提供了曲美他嗪作为nox-2/trpc3通路抑制剂的应用，用于拓展曲美他嗪的应用。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例进行糖尿病模型的建立。

对于糖尿病及其并发症的研究，由于难以获得临床上糖尿病患者的心肌组织，因此动物模型常用于糖尿病性心肌病的细胞和分子机制的研究。其中糖尿病模型中常被用到的是链脲佐菌素(streptozocin，stz)诱导。stz是一种亚硝基脲衍生物，其来源于链霉素单胞菌的提取物，它同时也是一种广谱抗生素并具有抗肿瘤的活性。stz是一种强烷化剂，它能够干扰葡萄糖转运、葡萄糖激酶的功能并且导致dna双链解聚，对生成胰岛素相关的胰岛中的β细胞具有特异的毒性。一型糖尿病患者的最主要特征是免疫损伤介导的胰岛β细胞的大量死亡，从而导致胰岛素分泌极度不足。stz由葡萄糖转运体-2(glut-2)转运进入细胞，而胰岛β细胞glut-2表达水平高，因此胰岛β细胞内就会有大量的stz蓄积，从而导致该类细胞大量死亡，进而诱发了一型糖尿病的发生。

糖尿病大鼠建模数周后，分离出来的心肌其收缩力和柔顺顺应性指标都降低，同时也有明显的心肌肥厚及纤维胶原沉积症状。stz诱导的糖尿病模型已被证明对糖尿病的研究及其并发症的发病机理的研究，以及探讨相应的治疗方法都是极具价值的。但是，通过小剂量多次腹腔内注射stz形成的糖尿病模型，与单次大剂量注射者比较能够造成t、b细胞功能的部分缺失。因此，本发明实施例考虑到实验贴近现实并为保证模型稳定，选用腹腔内较大剂量单次注射stz造模的方法进行大鼠糖尿病及并发症(包括心肌病变)的造模。通过对大鼠腹腔内单次大剂量注射stz(55mg/kg)，形成比较稳定的一型糖尿病模型。本发明曲美他嗪在stz注射后一周开始给药，即持续给药11周。请参阅图1，为本发明实施例1中糖尿病模型建立后各项指标图，包括体重(图1a)、空腹血糖(图1b)、晚期糖基化终末产物(图1c)和血浆胰岛素(图1d)。图1中，注射链脲佐菌素后12周，与正常对照组相比，糖尿病组大鼠体重下降(*p<0.05)，空腹血糖和晚期糖基化终末产物浓度升高(*p<0.05)，血浆胰岛素水平降低(***p<0.001)。

实施例2

本实施例进行心功能检测方法的建立并对心功能进行检测。

糖尿病性心肌病是糖尿病的合并症之一，这是一种以心肌肥大、心肌纤维化、心肌间质纤维化、细胞水平钙转运缺陷、心脏自主神经病变和脂肪酸代谢异常等为特征的独特的心肌病变。糖尿病性心肌病缺少特异性，必须综合多方面资料进行诊断，其中心功能改变是糖尿病性心肌病重要特征之一。评价心功能的方法比较多，包含有创的心导管法检查和无创性的超声检查，其中无创的心功能测定的方法有磁共振成像、超声波心动扫描记术、微型流体测压器和多普勒测量法等，但这些技术受到心脏负荷干扰较大，都不能直接地检测到心脏活动情况和心功能的指标。

采用压力-容积导管检测是近年来发展起来的能够同时检测心室内的瞬时压力和相应的容积信号的方法，能够通过这些信号确立心室的压力-容积关系，并且可同时检测到非负荷依赖性和负荷依赖性的心功能指标，从而判断心功能的变化。目前，左心室压力-容积分析已经被认为是基础研究领域公认的评价动物心功能的“金标准”，广泛用于各种动物生理、病理情况下的心功能评价，同时也开始应用于人体临床研究。

本实施例采用压力-容积导管检测，请参阅图2，为本发明实施例2进行中心功能检测的各项指标图，包括左心室舒张末期压力(图2a)、压力下降最大速率(图2b)、平均动脉压(图2c)、左心室收缩末期压力(图2d)、压力上升最大速率(图2e)和心输出量(图2f)。stz注射12周后，糖尿病大鼠心脏功能下降，表现为左心室舒张末期压力(lvedp)升高，左心室的压力下降最大速率(dp/dtmin绝对值)下降，表明舒张功能下降；同时，左心室收缩末期压力(lvesp)和左心室的压力上升最大速率(dp/dtmax)均显著下降，表明收缩功能受损。此外，平均动脉压(map)和心输出量(co)均明显降低。

结果表明，曲美他嗪能够减轻糖尿病引起的心功能异常，曲美他嗪可显著降低糖尿病引起的lvedp的升高，大大提高糖尿病导致的dp/dtmin绝对值的下降。同时，糖尿病导致lvesp和dp/dtmax下降，曲美他嗪可以提高这两个收缩指标。此外，曲美他嗪还可提高map和co。因此，本发明曲美他嗪可以大大缓解糖尿病引起的心功能失常，维持心脏正常的舒张和收缩功能，维持合理的心输出量，确保机体能够及时获得必须的氧气和养分。

实施例3

本实施例确定分析氧化压力和活性氧自由基的方法并进行分析。

慢性高血糖可以通过电子链使活性氧(ros)产生增多，心肌组织内氧化压力升高，进一步损伤心肌细胞。糖尿病心肌病变发生后，心肌组织抗氧化能力大大降低，包括napdh氧化酶的表达增强和活性升高、超氧化物歧化酶(sod)表达和活性降低，从而大大加速了心脏结构和功能失常的进程。

本实施例将心肌组织裂解得到蛋白，采用bca法(piercebca试剂盒)测定浓度后，采用蛋白电泳与特异型杂交(sds-page/westernblotting)方法测定蛋白表达水平。配制8％～12％的聚丙烯酰胺凝胶，电泳分离不同处理的心肌组织蛋白后转移到pvdf膜上，采用5％的脱脂奶粉封闭45min～60min后，一抗孵育过夜，然后经hrp标记的二抗孵育45min～60min，经ecl化学发光显色，采用bio-rad公司的chemidoc化学发光成像系统获取图像后进行数据分析。图3为本发明实施例3进行氧化压力和活性氧自由基分析的各项指标图。请参阅图3a和图3b，分别为trpc3/nox-2蛋白电泳图和trpc3/nox-2蛋白表达分析图。结果表明，本发明曲美他嗪可以显著抑制糖尿病引起的心脏nox-2和trpc3的表达。

本实施例在动物实验结束后分离心脏，经多聚甲醛固定后，分别进行脱水、石蜡包埋、切片等，随后经脱蜡和水化处理。再采用3％的h2o2室温孵育5min～10min，确保内源性过氧化物酶活性被充分消除。蒸馏水冲洗切片，接着用电炉或者水浴锅加热10mm枸橼酸钠缓冲溶液(ph＝6.0)至95℃左右，放入组织切片加热10min～15min，进行煮沸热修复。pbs冲洗后采用5％～10％正常山羊血清(pbs稀释)封闭，室温孵育20min，甩去多余的血清，不用冲洗，滴加充足比例稀释的一抗工作液(8-ohdg，sc-393871，1:100)，置于切片盒内，4℃孵育过夜，此期间避免切片上液体风干。按照说明书用pbs稀释生物素标记的二抗(1％bsa-pbs溶液稀释)，再次用pbs冲洗切片后，滴加二抗覆盖整个样本切面，37℃孵育10min～30min。pbs冲洗后，滴加适当比例稀释的辣根酶标记的链霉亲和素，37℃孵育10min～30min。pbs冲洗，dab显色试剂盒显色后，蒸馏水冲洗。接着用苏木素复染2min，盐酸酒精分化，随后进行脱水、透明、封片、镜检等操作。请参阅图3c和他3d，分别为8-ohdg免疫染色图和8-ohdg染色分析图，糖尿病发生12周后，心肌组织内氧化水平大大增强，本发明曲美他嗪可以很好地抑制组织内的氧化应激水平的升高。

本实施例还采用捷瑞生物科技有限公司的离心柱型总rna提取试剂盒进行rna的提取，根据说明书操作提取总rna，采用nanodropnd-2000测定浓度，根据说明书(revertaidfirststrandcdnasynthesiskit，thermofisher)进行逆转录操作。实时荧光定量pcr方法(genviewsybrgreenpcr2×premixhstaq)检测验证基因表达情况。即采用10μl或20μl反应体系，以10μl体系为例，加入2×premix5μl、上下游引物各0.5μl、cdna(稀释5-10倍)0.2-0.5μl，补充双蒸水到10μl。混匀后，在实施荧光定量pcr以上进行扩增反应：95℃预变性5分钟，40个循环的94℃15秒、60℃30秒，接着通过95℃15秒、60℃15秒、95℃15秒流程测定溶解曲线。以β-actin基因作为内参，通过2-△△ct的方法比较各组之间基因表达的差异。请参阅图3e至图3h，分别表征nox-2、p22phox、p47phox和sod-2的mrna，结果表明，本发明曲美他嗪可以显著抑制促氧化相关基因nox-2、p22phox和p47phox的表达，增强抗氧化基因sod-2的表达。

实施例4

本实施例进行心肌组织炎症反应的检测。

糖尿病中，系统性炎症也是促进疾病进程的重要原因。糖尿病的心肌组织的免疫状况也会发生改变，促炎症细胞因子和趋化因子上调，各种淋巴细胞被激活，表明促炎症信号通路对糖尿病心肌病变的病理学发生发展过程中起到关键作用。图4为本发明实施例4进行心肌组织炎症反应检测的各项指标图，包括tnf-α和il-6的血浆浓度(图4a)、tnf-α和il-6的组织浓度(图4b)、cd68免疫染色图(图4c)、cd68染色分析图(图4d)、il-1β的mrna含量(图4e)、mcp-1的mrna含量(图4f)、vcam-1的mrna含量(图4g)和icam-1的mrna含量(图4h)。在链脲佐菌素(stz)诱导的一型糖尿病中，酶联免疫吸附试验(elisa)检测表明血浆和心脏组织内tnf-α和il-6显著升高(图4a-图4b)，免疫组化分析(cd68，sc-20060，1:100)表明心肌组织巨噬细胞浸润明显增强(图4c-图4d)；实时荧光定量pcr分析表明心肌il-1β、mcp-1、vcam-1和icam-1等炎症因子的表达显著上调(图4e-图4h)。这些炎症反应会引起心肌细胞损伤，进一步导致心脏舒张/收缩功能紊乱和心肌纤维化。

请参阅图4，本发明曲美他嗪具有良好的抑制炎症的效果，能够降低tnf-α和il-6的水平，抑制巨噬细胞浸润，能够显著抑制il-1β、mcp-1、vcam-1和icam-1等炎症因子的表达，大大降低心肌组织内炎症信号通路的活性，从而改善心脏结构和功能异常。

实施例5

本实施例进行心肌肥大及相关的检测。

请参阅图5，为本发明实施例5进行心肌肥大及相关检测的各项指标图，包括心肌细胞h&e染色图(图5a)、心肌细胞横截面积(图5b)、心脏/胫骨长度(图5c)、anp的mrna含量(图5d)、bnp的mrna含量(图5e)。心脏经多聚甲醛固定后，分别进行脱水、石蜡包埋、切片等，随后经脱蜡和水化处理，进一步采用苏木素&伊红(h&e)染色，结果表明，心肌细胞横截面积变大(图5a-图5b)。糖尿病性心肌病引起心脏质量增加，心脏/胫骨长度(hw/tl)升高(图5c)。心肌组织内肥大相关的生物标志物——心房利钠肽(anp)和脑钠肽(bnp)表达增加(图5d-图5e)，表明胚胎型心脏代谢程序被激活，从而引起心脏结构发生异常。

而本发明曲美他嗪可以显著降低糖尿病引起的心脏质量增加，使心脏/胫骨长度(hw/tl)显著下降，降低心肌细胞横截面积。同时，曲美他嗪还可以抑制肥大标志物基因的表达，降低anp和bnp的信使核糖核苷酸(mrna)的丰度。通过阻止心肌肥大和心肌结构异常，曲美他嗪可以维持心脏正常的结构，从而对抗糖尿病引起的心肌结构和功能的改变。

实施例6

本实施例进行心肌组织纤维化及相关的检测。

慢性高血糖通过各种因素诱导心肌细胞凋亡，成纤维细胞代偿性增加，与纤维化有关的信号通路被激活，心肌组织纤维化导致心肌重构。tgf-β1是诸多因素致心肌纤维化的共同中介物之一。正常心脏中，tgf-β1、胶原含量都很低，糖尿病患者在高血糖、局部肾素-血管紧张素-醛固酮系统(raas)、氧化应激和炎症等众多因素的刺激下，体内tgf-β1表达上调，诱导心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，刺激胶原、纤维连接蛋白、蛋白多糖等的合成。心肌纤维化的过程伴随着tgf-β1及其下游smad2和smad3基因表达的上调。请参阅图6，为本发明实施例6进行心肌组织纤维化及相关检测的各项指标图，包括天狼星红染色图(图6a)、纤维化强度(图6b)、tgf-β的mrna含量(图6c)、smad-3的mrna含量(图6d)、一型胶原蛋白的mrna含量(图6e)。天狼星红染色表明，糖尿病心脏内胶原沉积显著增多(图6a-图6b)，tgf-β1、smad-3和三型胶原的表达升高(图6c-图6e)。而本发明曲美他嗪，具有显著抑制糖尿病引起的心肌纤维化的效果，降低细胞外基质的沉积，抑制tgf-β1及下游信号分子smad-3的表达，阻断一型胶原的表达，从而大大降低心肌纤维化引起的心肌重构。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。