海参磷脂在制备神经元细胞保护药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及海参磷脂在制备神经元细胞保护药物中的应用。

背景技术：

神经元细胞由细胞体和细胞突起构成，细胞体位于脑、脊髓和神经节中，细胞突起可延伸至全身各器官和组织中，是构成人体神经系统结构和功能的基本单元。神经元细胞损伤与多种疾病的发生有关，尤其是随着年龄的增长所发生的神经退行性疾病，如阿尔茨海默病(ad)和帕金森病(pd)等，已经成为影响老年人健康和寿命的主要因素，且鲜有效果很理想的药物，且副作用大。例如安坦是用于逆转帕金森的，但也会导致患者出现记忆障碍、精神错乱、幻觉、口干、视力模糊、便秘的症状。这成为目前不可忽视亟待解决的问题。

因此寻找安全、高效的能够对神经元细胞损伤起到预防和保护作用的药物，对于阿尔茨海默病、帕金森病或血管性痴呆等神经退行性疾病的防治具有重要的价值和意义。目前还没有人发现海参磷脂在制备神经元细胞保护药物中的应用。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供海参磷脂在制备神经元细胞保护药物中的应用，从而可应用于开发阿尔茨海默病、帕金森病或血管性痴呆等神经退行性疾病的防治药物。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明通过实验发现，海参磷脂(乙醇溶解相和乙醇不溶相)能够缓解神经毒素β淀粉样蛋白(aβ)、1-甲基-4-苯基吡啶离子(mpp⁺)对sh-sy5y细胞的损害，有效地降低细胞的死亡率，达到显著的预防和逆转效果，提示海参磷脂在制备神经元细胞保护药物方面具有极高的市场价值。

可选地，所述神经元细胞保护药物包括预防神经元细胞损伤的药物。

可选地，所述神经元细胞保护药物包括修复损伤的神经元细胞的药物。

可选地，所述神经元细胞的损伤是指神经毒素引起的损伤。

可选地，所述神经毒素包括β淀粉样蛋白(aβ)、1-甲基-4-苯基吡啶离子(mpp⁺)等可诱发神经细胞损伤或死亡的物质。

本发明还提供海参磷脂在制备促进神经元细胞生长的药物中的应用。

本发明还提供海参磷脂在制备预防和/或治疗由神经元细胞损伤引起的相关疾病中的应用。比如由神经元细胞损伤引起的神经退行性疾病。所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、血管性痴呆等由于神经细胞损伤或死亡诱发的疾病。

本发明实施例中的数据证明，海参磷脂对aβ和mpp⁺诱导的神经细胞损伤均有显著的防护作用。而研究显示，阿尔茨海默病(ad)有两个典型病理特征，即β淀粉样蛋白(aβ蛋白)沉积形成的神经炎性斑块和tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结(nfis)，最终表现为皮质的持续皱缩以及海马等脑区神经元的大量丢失。研究发现β淀粉样蛋白(aβ)是导致ad的主要病因，但是有关aβ神经毒性的发病机制我们尚未完全掌握。研究发现aβ诱导的神经损伤是引发ad等多种病症的的共同途径，所以aβ诱导的神经细胞损伤常被用作研究ad的体外模型。另外帕金森病(pd)的主要病理特点为脑中黑质多巴胺能使神经元严重缺失和纹状体多巴胺神经递质减少，目前，关于逆转pd主要是通过解决多巴胺能神经元丢失引起的多巴胺减少及其功能丧失，认为细胞凋亡是导致多巴胺能神经元缺失的主要途径。研究已发现1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(mptp)对人类、猴和小鼠等动物模型中的多巴胺能神经元毒性作用，继续损耗多巴胺并在纹状体产生其代谢产物。mptp是一种可以透过血脑屏障的脂溶性原毒素，进入人体大脑在黑质细胞内脱氢转化为mpp⁺，通过在大脑内大量积蓄，进而引起细胞中毒，从而导致多巴胺能神经元的丢失，进而引发一系列的临床反应，成为目前公认研究pd的体外模型。因此，本发明的结果显然可以应用于ad和pd等相关疾病的防治。

本发明具有以下有益效果：

本发明发现，海参磷脂对aβ、mpp⁺诱导的体外细胞损伤模型均有保护作用，显著降低神经毒素对于神经元的损伤，提示海参磷脂在制备神经元保护药物方面具有极高的市场价值。

附图说明

图1显示为本发明实施例中sh-sy5y细胞经维甲酸(ra)诱导第二天的状态图。

图2显示为本发明实施例中sh-sy5y细胞经佛波酯(tpa)诱导第一天的状态图。

图3显示为本发明实施例中不同浓度aβ对sh-sy5y细胞存活率的影响图，**p<0.01表示对照组vs模型aβ组。

图4显示为本发明实施例中不同浓度mpp⁺对sh-sy5y细胞存活率的影响图，*p<0.05、**p<0.01表示对照组vs模型mpp⁺组。

图5显示为本发明实施例中海参磷脂提取物乙醇溶解相(sce)对sh-sy5y细胞存活率的影响图，#p<0.05表示对照组vs实验组。

图6显示为本发明实施例中海参磷脂提取物乙醇不溶相(scw)对sh-sy5y细胞存活率的影响图，#p<0.05表示对照组vs实验组。

图7显示为本发明实施例中不同浓度sce对aβ(20μm)诱导的sh-sy5y细胞损伤的影响图，**p＜0.01表示对照组vs模型组；#p＜0.05，表示模型组vs实验组(1μg/ml、10μg/ml海参磷脂提取物乙醇溶解相+aβ)。

图8显示为本发明实施例中不同浓度sce对mpp+(200μm)诱导的sh-sy5y细胞损伤的影响图，**p＜0.01表示对照组vs模型组；#p＜0.05，##p<0.01表示模型组vs实验组(1μg/ml、10μg/mlsce+mpp⁺)。

图9显示为本发明实施例中不同浓度scw对aβ(20μm)诱导的sh-sy5y细胞损伤的影响图，**p＜0.01表示对照组vs模型组；#p＜0.05，##p<0.01表示模型组vs实验组(1μg/ml、10μg/mlscw+mpp⁺)。

图10显示为本发明实施例中不同浓度scw对mpp⁺(200μm)诱导的sh-sy5y细胞损伤的影响图，**p＜0.01表示对照组vs模型组；#p＜0.05，表示模型组vs实验组(1μg/ml、10μg/mlscw+mpp⁺)。

图11显示为本发明实施例中不同浓度sce对aβ(20μm)诱导的sh-sy5y细胞损伤的影响图，**p＜0.01表示对照组vs模型组；#p＜0.05，##p<0.01表示模型组vs实验组(1μg/ml、10μg/mlsce+aβ)。

图12显示为本发明实施例中不同浓度sce对mpp+(200μm)诱导的sh-sy5y细胞损伤的影响图，**p＜0.01表示对照组vs模型组；#p＜0.05，表示模型组vs实验组(1μg/ml、10μg/ml浓度sce+mpp⁺)。

图13显示为本发明实施例中不同浓度scw对aβ(20μm)诱导的sh-sy5y细胞损伤的影响图，**p＜0.01表示对照组vs模型组；#p＜0.05，表示模型组vs实验组(1μg/ml、10μg/mlscw+aβ)。

图14显示为本发明实施例中不同浓度scw对mpp+(200μm)诱导的sh-sy5y细胞损伤的影响图，**p＜0.01表示对照组vs模型组；#p＜0.05，表示模型组vs实验组(1μg/ml、10μg/mlscw+mpp⁺)。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

天然药物对疾病的干预具有多靶点、低毒性和整体调整的作用优势。

海参是传统药膳海洋食物，含有多种生物活性物质，具有抗凝血、降血脂、抗肿瘤、免疫调节、抗菌、抗病毒、促生长、抗衰老等多种药理作用，但海参提取物在神经调节、保护等方面的作用目前并不明确。本发明以sh-sy5y细胞研究对象，用ra、tpa先后对sh-sy5y细胞进行诱导分化成正常的神经元样细胞，然后分别利用神经毒素aβ诱导损伤已分化成神经元的sh-sy5y细胞建立ad体外模型和神经毒素mpp+诱导损伤已分化成神经元sh-sy5y细胞建立pd体外模型；对不同浓度的海参磷脂提取物(乙醇溶解相sce和乙醇不溶相scw)的神经细胞毒性进行了筛选，采用mtt法检测海参磷脂提取物对神经细胞的影响。最后通过预防实验和逆转实验确定海参磷脂提取物(sce和scw)对aβ和mpp+诱导神经损伤前、后干预能力，并且得出海参磷脂提取物(sce和scw)在该实验中针对逆转和预防ad和pd最佳浓度。本发明的实验结果发现，海参磷脂提取物(sce和scw)在神经保护活性药物研究和产品开发方面具有极高的应用价值，提示海参磷脂提取物在制备神经元细胞保护药物方面具有较高的市场价值。

实施例1

1、实验材料与试剂

1.1实验材料

(1)sh-sy5y细胞：来源自中国科学院上海生科院资源中心。

(2)海参磷脂提取物：乙醇溶解相与乙醇不溶相。

1.2仪器

酶标板振荡器(msk)购自艾本森科学仪器有限公司

倒置显微镜(ckx41)购自olympus公司

countstar自动细胞计数仪(ic1000)购自上海睿钰生物科技有限公司

5％co2，37℃恒温培养箱cib-191c购自crystal公司

超净工作台sw-cj-zfd购自博迅实业有限公司医疗设备厂

酶标仪bio-tekelx800购自济南乐瑞医疗器械有限公司

2、实验步骤

2.1实验复苏和培养传代

2.1.1细胞复苏

(1)先将实验试剂从冰箱中取出来解冻，然后开紫外灯对超净台进行灭菌30min以上，最后关掉紫外灯，点燃酒精灯，并用工业酒精擦拭台面，以确保实验过程均在无菌环境中操作。

(2)戴上手套，从液氮容器中取出标有sh-sy5y细胞记号的冻存管，快速转移并浸入事先准备好的37℃温水中，迅速在温水中摇晃使其尽可能在最短时间内融化。

(3)待完全融化后立即从37℃水浴中取出冻存管，用纸巾擦干并喷一下酒精，于超净工作台酒精灯旁打开盖子，用移液枪吸出sh-sy5y细胞悬液于已备好的3ml完全培养液10ml的塑料离心管中，于离心机中离心，设置1000rpm离心5min。

(3)倒掉上层清液，向离心管中加入2ml基础培养基，用移液枪吹打混匀，取500μl-1ml细胞液转入培养瓶中加至6ml完全培养基，置于5％co2，37℃恒温培养箱静置培养。

培养sh-sy5y细胞用到的完全培养基为84％mem/f12培养基+15％fbs+1％双抗(100x)。

2.1.2细胞培养传代

每天观察sh-sy5y细胞的生长状态，根据细胞的生长状态及时给细胞换液(一般隔2天换一次)，待细胞密度达到85％～90％使则需要对细胞进行传代，传代时需将细胞尽量吹散成单个细胞(因为此细胞相对其他细胞容易聚团)。sh-sy5y细胞传代种板时要先用0.25％胰酶进行消化，主要是让细胞从壁上脱落下来。加入1ml胰酶，在灯管下肉眼观察培养瓶壁上细胞的脱落情况，约半分钟左右，将其吸出，加入1ml胎牛血清即可停止消化，加入3ml完全培养基，吹散后即可传代，若时间把握不好则立即向培养瓶中加入2-3ml完全培养基阻止消化，将壁上的细胞完全吹打下来，再将细胞液置于离心机1000rpm离心5min，离心结束后，倒掉上清液，加入2ml的完全培养基，吹打细胞悬液，使细胞均匀分布。传代比例可为1：3或1：4，写上标签，置于培养箱中培养。

2.2细胞接种

2.2.1种板

取20μl的细胞液于细胞计数仪下检测该细胞的密度，并做好相关记录。根据每个96孔板中sh-sy5y细胞以5×10⁴/ml为细胞数量接种进行计算，得出所需的细胞液，再加入相对量的完全培养基，用1ml移液枪吹散均匀，然后每孔加入100μl(约5000个细胞)细胞悬液，并在板上写好标签，置于5％co2，37℃培养箱中培养24小时。

2.2.2加ra诱导

维甲酸(ra)是一种强诱导细胞分化剂，能够控制细胞的分化方向和调控细胞的增值能力，ra可以诱导sh-sy5y细胞分化成胆碱能神经元样细胞，这种作用的原因是ra可以改变细胞的基因表达，使得sh-sy5y细胞定向分化。能够诱导sh-sy5y细胞转化为胆碱能神经元型。

种板24h后，在显微镜下观察细胞的形态后，于超净台中加10μmra，先将ra用完全培养基稀释10倍，再向每孔中加入1μlra，做好标记，于台面上摇匀，置于5％co2，37℃培养箱中诱导72h。图1显示为sh-sy5y细胞经ra诱导第二天的状态图。

2.2.3加tpa诱导

tpa能够促进经ra诱导分化过的sh-sy5y细胞进一步分化，形成成熟而有稳定的神经元样细胞。

加ra培养72h后，在显微镜下观察细胞的形态后于超净台中加入终浓度80nmtpa，做好标记，于台面上摇匀，置于5％co2，37℃培养箱中诱导72小时。图2显示为sh-sy5y细胞经tpa诱导第一天的状态图。

2.3mtt检测法

2.3.1实验原理

mtt法是一种检测活细胞数目的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，而死细胞因为其细胞内的琥珀酸脱氢酶被分解消失，因此不能将mtt还原，再利用二甲基亚砜能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm、570nm波长处测定其od值，以od值的大小判断反映活细胞数量。

2.3.2建立ad模型和pd模型

(1)ad模型

种板ra、tpa诱导分化完成后，用移液枪将孔中液体全部吸掉，选取不同浓度的aβ(分别为5μm、10μm、15μm、20μm)加到96孔板中，每孔加入100μl，每个浓度设5个复孔，置于5％co2，37℃的培养箱中培养24小时。第二天将96孔板从培养箱中取出，于倒置显微镜下观察细胞的生长情况，然后于超净台中并在酒精灯下向96孔板中每孔加入10μlmtt溶液(5mg/ml)，避光条件下进行，并在台面上摇匀后放进培养箱中反应4h后取出，放到离心机里，设置1000rpm离心5min，接着将96孔板取出，用移液枪将孔内上清液沿壁吸出，然后用排枪向每孔中加入150μldmso，置于酶标板震荡器上摇晃10min左右，待结晶紫全部溶解后，于酶联免疫检测仪测定其吸光值，波长设置在490nm、570nm。

(2)pd模型

种板诱导分化结束后，将孔中的液体用移液枪吸走，配置不同浓度的mpp+(分别为50μm、100μm、200μm、400μm)，用移液枪将不同浓度的mpp+分别加到96孔板中，每孔加入100μl，置于5％co2，37℃的培养箱中培养24小时后观察细胞的生长状态。同上检测。

2.3.3海参磷脂提取物对sh-sy5y细胞存活率的影响

(1)不同浓度海参磷脂提取物(乙醇溶解相和乙醇不溶相)对sh-sy5y细胞活力的影响

经ra、tpa诱导分化结束后，将96孔板置于倒置显微镜下观察其细胞形态，用移液枪将孔中的液体全部吸掉，选取不同浓度的海参磷脂提取物(1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml)加到96孔板中，每孔加入100μl，置于5％co2，37℃的培养箱中孵育24小时后观察细胞的生长情况，同上检测。

海参磷脂提取物(乙醇溶解相sce和乙醇不溶相scw)的制备方法参见中国专利申请“海参磷脂在制备抑制神经炎症药物中的应用”(申请号：2019107756578)。

(2)aβ、mpp⁺模型下不同浓度海参磷脂提取物对sh-sy5y细胞活力的影响

①预防实验

种板诱导完成后，吸走孔中的液体，向孔中加入最佳浓度的海参磷脂提取物100μl，于5％co2，37℃的培养箱中孵育24小时(观察细胞的生长情况)后将孔中的液体吸走，在向孔中加入100μl20μmaβ(200μmmpp⁺)，于培养箱中培养24小时后观察细胞的生长状态，同时做对照组和模型组，同上检测。

②逆转实验

种板诱导完成后吸走孔中的液体，在向孔中加入100μl20μmaβ(200μmmpp⁺)于5％co2，37℃的培养箱中孵育24小时(观察细胞的生长情况)后将孔中的液体吸走，向孔中加入最佳浓度的海参磷脂提取物100μl，于培养箱中培养24小时后观察细胞的生长状态，同时做对照组和模型组，同上检测。

2.4注意事项

(1)进入实验室之前要先在缓冲间换好实验服和鞋子(实验服和拖鞋切记不能传出实验室外)，进入实验室后要带上口罩和手套，并在用75％的酒精进行消毒。

(2)实验室中的所有用具要求处于无菌状态。

(3)在进行实验前须先把本次实验用到的试剂放到实验室升温至室温方可实验，防止细胞因为温度过低造成死亡。

(4)对96孔板进行换液时，移液枪需贴壁将培养液吸出，不要触碰到孔底，避免使细胞损伤或将细胞吸走，往孔中加入液体时需沿壁加入，避免因为冲力使细胞从壁上脱落。

(5)加完液之后需轻敲板的四周或将板在超净台面缓慢的摇几下使其充分混匀。

(6)在加ra、mpp+、mtt时应注意要避光处理，防止试剂的性质发生改变。

(7)吸走mtt时要防止将紫色晶体吸走，将96孔板倾斜30°，用移液枪吸，保证实验的准确性。

(8)每次做完实验要整理台面的实验工具，并用酒精擦拭台面，使用的枪要将调至最大的刻度，并整齐放置，将废液等倒进装有消毒液桶中消毒，防止污染，垃圾及时清理。

(9)实验前后都需仔细检查实验用具是否齐全，防止实验中途暂停，及时对枪头和试管进行灭菌。

(10)本实验采用t检验也叫显著性检验，以p<0.05表示有显著性差异，p<0.01表示有极显著性差异。

3实验结果

3.1建立ad模型和pd体外模型

3.1.1ad模型

经不同浓度(5μm、10μm、15μm、20μm)aβ处理24h后sh-sy5y神经母瘤细胞存活率明显下降，说明不同浓度的aβ对sh-sy5y细胞在不同程度上均会造成损伤。根据t检验判断在每个浓度下相对与对照组的显著性，从而确定造模剂浓度以建立最佳ad模型。且aβ浓度为15-20μm处理后细胞存活率显著低于对照组的细胞存活率(均为p<0.01，图3)；当aβ浓度在20μm时的细胞存活率明显更低，能够使细胞损失到80％，更能模拟体内神经损伤的程度。因此选择20μm为造模剂浓度。

3.1.2pd模型

sh-sy5y细胞经不同浓度(50μm、100μm、200μm、400μm)mpp⁺处理24h后，sh-sy5y神经母瘤细胞的存活率均有所下降，说明不同浓度梯度的mpp+对sh-sy5y细胞均造成损伤，根据其显著性判断出在最佳的造模浓度，从而建立pd模型。mpp⁺浓度为100-400μm处理后细胞存活率显著低于对照组的细胞存活率(为p<0.05或p<0.01，图4)；mpp⁺浓度为100μm的细胞存活率明显比浓度200μm、400μm的低，而浓度200μm、400μm时细胞存活率基本一致，但由于200μm的误差更小，因此选择200μm为造模剂浓度。

3.2不同浓度海参磷脂提取物(乙醇溶解相和乙醇不溶相)对sh-sy5y细胞活力的影响

3.2.1海参磷脂提取物乙醇溶解相对sh-sy5y细胞存活率的影响

图5是经ra、tpa诱导分化sh-sy5y细胞在不同浓度海参磷脂提取物乙醇溶解相处理24h后的细胞存活率，与空白组相比，加入的海参磷脂提取物乙醇溶解相的浓度分别为1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml后的细胞活性均有所升高，且当海参磷脂提取物乙醇溶解相浓度为1μg/ml、10μg/ml时，细胞存活率显著高于对照组(p＜0.05)，说明海参磷脂提取物乙醇溶解相在一定浓度下可促进sh-sy5y细胞的生长。然而当海参磷脂提取物乙醇溶解相的浓度为100μg/ml时细胞的细胞存活率无明显变化。

3.2.2海参磷脂提取物乙醇不溶相对sh-sy5y细胞存活率的影响

图6是经ra、tpa诱导分化sh-sy5y细胞在不同浓度海参磷脂提取物乙醇不溶相处理24h后的细胞存活率统计图，与对照组相比，加入的海参磷脂提取物乙醇不溶相的浓度为1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml后的细胞活性均有所升高，且当海参磷脂提取物乙醇不溶相浓度为1μg/ml、10μg/ml时细胞存活率显著高于对照组(p＜0.05)，但当海参磷脂提取物乙醇不溶相的浓度为100μg/ml时该细胞的活性是明显降低的，说明海参磷脂提取物乙醇不溶相在一定浓度下可促进sh-sy5y细胞的生长，但超过一定浓度范围会对sh-sy5y细胞会造成很大的损伤。

3.3不同浓度海参磷脂提取物对aβ、mpp+诱导的细胞损伤模型下sh-sy5y细胞存活率的影响

3.3.1预防实验

3.3.1.1海参磷脂提取物乙醇溶解相对aβ诱导的sh-sy5y细胞损伤的影响

根据图5选取有显著性差异的海参磷脂提取物乙醇溶解相浓度(即1μg/ml、10μg/ml)24h后，将孔中的液体用移液枪吸走，再用移液枪向每孔加入100μlaβ(20μm)孵育24h(除对照组外)。由图7可以看出，模型组sh-sy5y细胞活力相对于对照组明显受到了抑制，细胞存活率显著下降(p<0.01)；而海参磷脂提取物乙醇溶解相处理的实验组细胞存活率与模型组相比均有提高(均为p<0.05)。提示海参磷脂提取物乙醇溶解相实验剂量条件下可以降低aβ对sh-sy5y细胞的损伤从而起到一定的保护作用，以减少细胞凋亡达到保护神经元的目的。见图7。

3.3.1.2海参磷脂提取物乙醇溶解相对mpp+诱导的sh-sy5y细胞损伤的影响

根据图5选取差异显著的海参磷脂提取物乙醇溶解相浓度(即1μg/ml、10μg/ml)24h后，再加入mpp+(200μm)孵育24h。由图8可以得出，模型组sh-sy5y细胞存活率与对照组相比受到了明显的抑制，细胞存活率显著下降(p<0.01)；与模型组相比，实验组细胞存活率均有提高(p<0.01，p<0.05)，可以明显看出当海参磷脂提取物乙醇溶解相的浓度为1μg/ml时，sh-sy5y细胞活力最佳(p<0.01)。提示海参磷脂提取物乙醇溶解相可以提高sh-sy5y细胞的活力，从而有效缓解mpp+对sh-sy5y细胞的损伤，在一定范围内能降低mpp+对sh-sy5y细胞的损伤，起到保护神经元的作用。见图8。

3.3.1.3海参磷脂提取物乙醇不溶相对aβ诱导的sh-sy5y细胞损伤的影响

根据图6选取细胞存活率有显著性差异的海参磷脂提取物乙醇不溶相浓度(即1μg/ml、10μg/ml)培养24h后，再加入100μlaβ(20μm)诱导24h。由图9可以发现，与对照组相比，模型组sh-sy5y细胞活力明显降低，细胞存活率显著下降(p<0.01)；而实验组细胞活力均有提高与模型组相比(p<0.05，p<0.01)。因此，可知海参磷脂提取物乙醇不溶能够相应地提高sh-sy5y细胞的存活率以降低aβ给细胞造成的损伤。海参磷脂提取物乙醇不溶的浓度为10μg/ml时，sh-sy5y细胞活力最佳(p<0.01)。见图9。

3.3.1.4海参磷脂提取物乙醇不溶相对mpp+诱导的sh-sy5y细胞损伤的影响

根据图6选取细胞存活率的差异较显著的海参磷脂提取物乙醇不溶浓度(即1μg/ml、10μg/ml)培养24h后，再加入mpp+(200μm)诱导24h，由od值可以看出，模型组sh-sy5y细胞活力与对照组相比明显受到抑制，细胞活力显著下降(p<0.01)；与模型组相比，实验组细胞活力均有提高(p<0.05，p<0.05)。因此可得出海参磷脂提取物乙醇不溶提高sh-sy5y细胞活力以降低对mpp+诱导造成的损伤，在一定范围内能降低mpp+对sh-sy5y细胞的损伤，从而预防细胞凋亡达到保护神经元的目的。见图10。

3.3.2逆转实验

3.3.2.1海参磷脂提取物乙醇溶解相对aβ诱导的sh-sy5y细胞损伤的影响

图11先加入aβ(20μm)对sh-sy5y诱导24h后，然后根据图5最佳的海参磷脂提取物乙醇溶解相相应的浓度(即1μg/ml、10μg/ml)培养24h。由图11可以看出，与对照组相比，模型组sh，-sy5y细胞存活率明显下降(p<0.01)；与模型组相比，实验组细胞活力均有提高(p<0.01，p<0.05)。提示海参磷脂提取物乙醇溶解相可以降低aβ对细胞的损伤程度，从而达到一定逆转的效果。

3.3.2.2海参磷脂提取物乙醇溶解相对mpp+诱导的sh-sy5y细胞损伤的影响

图12先加入mpp+(200μm)对sh-sy5y诱导24h后，然后根据图5细胞存活率最佳的相对应的海参磷脂提取物乙醇溶相应的浓度(即1μg/ml、10μg/ml)加入培养24h。结果显示，与对照组相比，模型组sh-sy5y细胞存活率明显下降(p<0.01)；实验组细胞存活率与模型组相比均有提高(均为p<0.05)。说明海参磷脂提取物乙醇溶在一定范围内能降低mpp+对sh-sy5y细胞的损伤，起到一定的逆转效果。

3.3.2.3海参磷脂提取物乙醇不溶相对aβ诱导的sh-sy5y细胞损伤的影响

图13是先加入aβ(20μm)对sh-sy5y诱导24h后，然后根据图6选取最优海参磷脂提取物乙醇不溶相相应的浓度(即1μg/ml、10μg/ml)加入培养24h，得到的sh-sy5y细胞细胞存活率统计图。由sh-sy5y细胞细胞存活率图得出，模型组sh-sy5y细胞存活率明显下降(p<0.01)；与模型组相比，实验组细胞存活率均有提高(p<0.05)。海参磷脂提取物乙醇不溶相对aβ诱导的细胞神经元损伤模型在一定程度上有修复作用，在一定范围内能降低aβ对sh-sy5y细胞的损伤，以减少细胞的凋亡从而达到一定的逆转作用。

3.3.2.4海参磷脂提取物乙醇不溶相对mpp+诱导的sh-sy5y细胞损伤的影响

图14是先加入mpp+(200μm)对sh-sy5y诱导24h后，然后根据图6选取最佳的海参磷脂提取物乙醇不溶相相应的浓度(即1μg/ml、10μg/ml)加入培养24h。由sh-sy5y细胞细胞存活率的相对大小可以得出，与对照组相比，模型组sh-sy5y细胞存活率明显下降(p<0.01)；与模型组相比，实验组细胞活力均有提高(均为p<0.05)。提示海参磷脂提取物乙醇不溶相对mpp+诱导的细胞神经元损伤在一定程度上有修复作用，从而达到一定的逆转目的。

5总结

sh-sy5y细胞是人神经母细胞瘤细胞，它具有神经突样的细胞质突起，是一种较好的神经元模型。且sh-sy5y细胞经ra与tpa处理能够使细胞定向分化，细胞形态发生明显的变化，分化成神经元表型，主要表现出由细胞体延伸出多个突起的多边形的细胞，能够形成分化完全而稳定的神经元样细胞，有利于形成体外研究的神经模型。

本发明分别以神经毒素aβ和mpp+诱导sh-sy5y细胞损伤构建痴呆和帕金森体外细胞模型为研究对象，从实验结果中可以得出一定浓度范围内的海参磷脂提取物(乙醇溶解相和乙醇不溶相)能够缓解神经毒素aβ、mpp+对sh-sy5y细胞的损害程度模型，有效地降低细胞的死亡率，以达到一定的预防和逆转效果。

通过aβ诱导损伤sh-sy5y细胞建立的ad模型。观察不同浓度海参磷脂提取物(乙醇溶解相和乙醇不溶相)对经诱导损伤的细胞存活率的影响。实验证明：

①与模型组相比，经不同浓度磷脂提取物处理过实验组细胞细胞存活率均有所增加。

②在预防实验中，海参磷脂提取物乙醇溶解相浓度为1μg/ml、10μg/ml时细胞活力表现相近(p＜0.05、p＜0.05)；海参磷脂提取物乙醇不溶相浓度为10μg/ml时细胞活力表现最佳(p＜0.01)。

③在逆转实验中，海参磷脂提取物乙醇溶解相浓度为1μg/ml时细胞活力表现最佳(p＜0.01)；海参磷脂提取物乙醇不溶相浓度为1μg/ml、10μg/ml时细胞活力表现相近(p＜0.05、p＜0.05)。即海参磷脂提取物乙醇溶解相和乙醇不溶相对预防sh-sy5y细胞的损伤或修复损伤的sh-sy5y细胞起到一定的保护作用。

因此，可以推测，高剂量的海参磷脂提取物对经过神经毒素诱导损伤的神经细胞并没有保护作用的原因，可能是高剂量的海参磷脂提取物并不能降低神经细胞内lhd的释放或不能有效地阻止活性氧形成从而来抑制神经细胞的凋亡。

其次是利用mpp+诱导sh-sy5y细胞损伤构建pd体外细胞模型。研究不同浓度梯度海参磷脂提取物(乙醇溶解相和乙醇不溶相)对经诱导损伤的sh-sy5y细胞的保护作用。通过结果分析得出：

①与模型组相比，实验组均表现了对细胞的保护作用，且在预防实验中，当海参磷脂提取物乙醇溶为1μg/ml细胞活力表现为最佳(p＜0.01)；海参磷脂提取物乙醇不溶浓度为1μg/ml、10μg/ml时细胞活力表现相近(p＜0.05、p＜0.05)。

②在逆转实验中，海参磷脂提取物乙醇溶解相和乙醇不溶相浓度均为1μg/ml、10μg/ml时细胞活力表现相近(p＜0.05、p＜0.05)。说明海参磷脂提取物对由mpp+诱导的sh-sy5y细胞具有保护作用。

综上，海参磷脂提取物(包括乙醇溶解相和乙醇不溶相)对神经元细胞无论是预防还是逆转中均表现出了良好的保护作用，且逆转效果与预防效果相近。本发明可为海参磷脂在以神经元损伤为共同主要病因的ad和pd等神经退行性疾病的防治上提供新的方向。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。