冬凌草活性成分组合物的制备及应用的制作方法

本发明涉及一种冬凌草活性成分组合物的制备及应用，尤其涉及冬凌草活性成分组合物的制备及其治疗非酒精性脂肪性肝病的应用。

背景技术：

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease，nafld)是遗传-环境-代谢应激相关因素所致的以肝细胞脂肪变性为主，但无过量饮酒史的临床病理综合征。调查显示，在欧美发达国家成人的nafld的发病率高达23％。虽然无确切的统计数据，但是多数资料显示在我国，nafld的发病率近年来也有明显的升高，且发病人群日趋低龄化。因此，nafld也日渐成为我国普遍关注的公共健康问题。

在nafld中，非酒精性脂肪性肝炎(nash，non-alcoholicsteatohepatitis)是非常关键的环节，目前已明确nash为慢性侵占性疾病，25％的患者可因此发展为肝纤维化病人，约有1.5～8.0％的患者进展为肝硬化，被认为是隐原性肝硬化的主要原因之一，nafld与肝细胞癌的发生密切相关。遗憾的是，迄今为止尚未有治疗nafld的良好治疗方法。浙江作为我国东南沿海发达省份之一，由于优质的生活条件，浙江存在着大量的肥胖和脂肪肝人群，是影响我省社会经济发展的潜在危险因素之一。因此，深入对nafld的发病和发展机理的研究，找出安全、合理、有效的阻断治疗方法，已经是我省医药卫生事业发展中需须迫切解决的问题。

nafld是代谢综合征的重要部组分，胰岛素抵抗(ir)、甘油三酯(tg)和总胆固醇(tc)转运障碍、氧应激和脂质过氧化损伤可能是其发病的原发性因素。而肝内脂肪堆积又可诱发和加重ir，从而形成ir/葡萄糖毒性、脂肪肝/脂质毒性及脂肪肝/ir之间的恶性循环，因此对于nafld的治疗效果，需对所使用的治疗药物在ir、甘油三酯(tg)和总胆固醇(tc)转运障碍、氧应激和脂质过氧化损伤等方面的作用机理进行深入研究。

冬凌草，别名为冰凌花，为唇形科植物碎米桠rabdosiarubescens(hemsl.)hara(plectranthusrubesenshemsl.)的干燥地上部分—唇形科labiatae小灌木，高30-100厘米，常生长在海拔100-1000米的山坡、谷地、灌丛、林地等处，主产于河南，以及黄河流域以南广大地区。根据相关研究，冬凌草中含有各种萜类化合物，其中二萜类化合物结构最为多样化，除此之外还有挥发油、生物碱、氨基酸、黄酮、有机酸酯以及一些小分子类化合物。目前冬凌草的主要药理作用是抗肿瘤，目前以冬凌草甲素为代表的二萜类抗肿瘤药物已广泛地运用到各种肿瘤细胞机制研究当中。除此之外，还有部分动物水平的药理活性研究。包括抗炎作用、保护肝脏的作用。具体的，有研究表明100％乙醇的冬凌草提取物为冬凌草的抗炎有效部位；冬凌草甲素具有治疗因棕榈酸诱导的raw264.7细胞炎症的作用。冬凌草甲素粉雾剂具有治疗急性肺损伤的前景；冬凌草具有治疗肝损伤作用。

冬凌草醇提取物和冬凌草甲素既有降血脂作用，又可降低肝损保护肝功能，而非酒精性脂肪肝发病机制主要是长期的高脂血症引起的肝脏脂肪积聚造成的，由此，我们做了大胆推测冬凌草提取物和冬凌草甲素对nafld具有治疗作用。

另一方面，根据前期的研究，我们发现，在相同的实验条件下，冬凌草提取物的活性要优于冬凌草甲素。这意味着冬凌草提取物中的活性成分起到了协同作用。为明确活性成分，提高治疗效果，我们对冬凌草中的活性成分中能够协同治疗nafld的成分进行了深入研究。

因此，本研究可较为全面和深入的研究冬凌草对于nafld的治疗机理，证明其在nafld治疗中的有效性，并对冬凌草提取物中治疗nafld有效的活性成分进行了探究。

技术实现要素：

本发明提供以下内容：

一种治疗nafld的冬凌草活性成分组合物，其特征在于，由冬凌草甲素、冬凌草乙素、迷迭香酸、阿魏酸和槲皮素组成。

所述治疗nafld的冬凌草活性成分组合物，其特征在于，冬凌草甲素、冬凌草乙素、迷迭香酸、阿魏酸和槲皮素的重量比为(3-10):(1-3):(1-4):(1-4):(2-6)。

所述治疗nafld的冬凌草活性成分组合物，其特征在于，冬凌草甲素、冬凌草乙素、迷迭香酸、阿魏酸和槲皮素的重量比为(4-8):(1-2):(2-3):(2-3):(3-4)。

所述治疗nafld的冬凌草活性成分组合物，其特征在于，冬凌草甲素、冬凌草乙素、迷迭香酸、阿魏酸和槲皮素的重量比为6:1:3:3:4。

一种治疗nafld的冬凌草活性成分的药物，它包括活性成分和辅料，所述的活性成分为冬凌草甲素、冬凌草乙素、迷迭香酸、阿魏酸和槲皮素；所述的辅料为药学上可接受的辅料。

所述治疗nafld的冬凌草活性成分的药物，其中冬凌草甲素、冬凌草乙素、迷迭香酸、阿魏酸和槲皮素的重量比为(3-10):(1-3):(1-4):(1-4):(2-6)。

所述治疗nafld的冬凌草活性成分的药物，药学上可接受的辅料包括一种或多种固体或液体辅料。

所述治疗nafld的冬凌草活性成分的药物，其剂型为片剂、分散片、胶囊剂、软胶囊剂、粉针剂、丸剂或滴丸剂。

本发明进一步提供上述组合物在制备治疗nafld药物中的用途。

本发明进一步提供上述组合物在制备对nafld具有辅助保护作用的药物或保健品中的用途。

本发明进一步提供上述药物在制备治疗nafld药物中的用途。

本发明的有益效果在于：

1、首次提出冬凌草提取物对nafld具有治疗作用。

2、发现冬凌草提取物对nafld的活性要优于冬凌草甲素，并通过实验筛选获得了冬凌草提取物中对nafld产生协同治疗作用的活性成分，并根据实际提取物中的比例，通过实验结果进行调整，确定了其重量配比(该特定配比的活性成分组成的组合物，以下简称为冬凌草组合物)。

3、通过冬凌草组合物和冬凌草甲素治疗nafld，探讨其在肝细胞脂肪变、炎症、细胞坏死等组织学变化及其胰岛素敏感性、细胞因子水平、脂质过氧化物、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)和ir/炎症的相关性，阐明冬凌草甲素治疗nafld的可能机理。

附图说明

图1正常组大鼠肝组织he染色结果(×400)

图2模型组大鼠肝组织he染色结果(×400)

图3冬凌草甲素组大鼠肝组织he染色结果(×400)

图4低剂量组大鼠肝组织he染色结果(×400)

图5高剂量组大鼠肝组织he染色结果(×400)

图6乙酰半胱氨酸组大鼠肝组织he染色结果(×400)

图7牛磺酸组大鼠肝组织he染色结果(×400)

图8易善复组大鼠肝组织he染色结果(×400)

图9正常组大鼠肝组织pparα蛋白表达(×400)

图10模型组大鼠肝组织pparα蛋白表达(×400)

图11冬凌草甲素组大鼠肝组织pparα蛋白表达(×400)

图12低剂量组大鼠肝组织pparα蛋白表达(×400)

图13高剂量组大鼠肝组织pparα蛋白表达(×400)

图14乙酰半胱氨酸组大鼠肝组织pparα蛋白表达(×400)

图15牛磺酸组大鼠肝组织pparα蛋白表达(×400)

图16易善复组大鼠肝组织pparα蛋白表达(×400)

图17正常组大鼠肝组织pparγ蛋白表达(×400)

图18模型组大鼠肝组织pparγ蛋白表达(×400)

图19冬凌草甲素组大鼠肝组织pparγ蛋白表达(×400)

图20低剂量组大鼠肝组织pparγ蛋白表达(×400)

图21高剂量组大鼠肝组织pparγ蛋白表达(×400)

图22乙酰半胱氨酸组大鼠肝组织pparγ蛋白表达(×400)

图23牛磺酸组大鼠肝组织pparγ蛋白表达(×400)

图24易善复组大鼠肝组织pparγ蛋白表达(×400)

图25肝组织pparαmrna的表达

图26肝组织pparγmrna的表达

图27肝组织srebp-1cmrna的表达

注：图25-27中m代表marker，a-正常组，b-模型组，c-乙酰半胱氨酸组，d-牛磺酸组，e-易善复组，f-冬凌草甲素组，g-低剂量组，h-高剂量组

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本发明做进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1片剂

冬凌草甲素6mg、冬凌草乙素1mg、迷迭香酸3mg、阿魏酸3mg和槲皮素4mg、淀粉80g、硬脂酸镁5g。

制备工艺：取冬凌草甲素6mg、冬凌草乙素1mg、迷迭香酸3mg、阿魏酸3mg和槲皮素4mg，加适量淀粉、硬脂酸镁混合均匀，制成颗粒，干燥，压片，即得。

实施例2胶囊

冬凌草甲素6mg、冬凌草乙素1mg、迷迭香酸3mg、阿魏酸3mg和槲皮素4mg、淀粉80g、硬脂酸镁5g。

制备工艺：取冬凌草甲素6mg、冬凌草乙素1mg、迷迭香酸3mg、阿魏酸3mg和槲皮素4mg，加适量淀粉、硬脂酸镁混合均匀，制成颗粒，干燥，装胶囊，即得。

实施例3动物实验

1、研究目的

随着人民生活水平提高，非酒精性脂肪性肝病发病率日益增加，深入研究对nafld的发病、发展机理的研究，找出安全、合理、有效的阻断治疗方法，已经是肝病领域中需须迫切解决的问题。本研究通过冬凌草组合物和冬凌草甲素治疗nafld，探讨其在肝细胞脂肪变、炎症、细胞坏死等组织学变化及其胰岛素敏感性、细胞因子水平、脂质过氧化物、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)和ir/炎症的相关性，并阐明冬凌草组合物和冬凌草甲素治疗nafld的可能机理。

2、研究内容

2.1采用持续单纯高脂饮食建立单纯脂肪性肝炎的大鼠模型；

2.2从蛋白水平，观察nafld肝组织中pparα和pparγ蛋白的表达水平；

2.3观察冬凌草组合物和冬凌草甲素治疗大鼠nafld后，对上述指标、病理、血液生化、蛋白和细胞因子转录表达水平等指标的影响。

3、研究方法

3.1大鼠非酒精性脂肪性肝炎模型的建立：sd大鼠以高脂饲料(在85％标准饲料的基础上加9％猪油、3％胆固醇、1％胆盐、2％蛋黄粉)连续喂养20周。

3.2药物的制备

(1)冬凌草甲素：根据大鼠体表面积法折算用量，临用配制供试药物；

(2)冬凌草组合物：与上述配制方法相同，供试药物为重量比为6:1:3:3:4的冬凌草甲素、冬凌草乙素、迷迭香酸、阿魏酸和槲皮素组合物。

(3)易善复混悬液：用蒸馏水配制成6.92mg/ml的混悬液；

3.3实验动物分组及给药：80只sd大鼠经适应性饲养1周后，随机分为正常组，造模组，冬凌草甲素组、冬凌草组合物高剂量组(简称高剂量组)、冬凌草组合物低剂量组(简称低剂量组)、乙酰半胱氨酸组、牛磺酸组和易善复组，每组10只。正常组每天予以标准饲料喂养，其他组每天均予以高脂饲料喂养，正常组、模型组每天灌服等容量的生理盐水；易善复组每天灌服易善复混悬液100mg·kg^-1·d^-1，低剂量组、高剂量组和冬凌草甲素组每天分别灌服剂量为50、150、150mg·kg^-1·d^-16:1:3:3:4的冬凌草甲素、冬凌草乙素、迷迭香酸、阿魏酸和槲皮素组合物(低剂量组、高剂量组)和冬凌草甲素(冬凌草甲素组)；乙酰半胱氨酸组150mg·kg^-1·d^-1；牛磺酸组150mg·kg^-1·d^-1，连续20周；第20周末大鼠禁食不禁水16小时，次日晨空腹用3％戊巴比妥钠(0.15ml/100g)腹腔注射麻醉，腹腔静脉采血，分离血清，-20℃保存，用于测定血液生物化学指标和细胞因子；迅速分离整个肝脏称重。然后在肝右叶中部切取数块肝组织，立即投入液氮中冻存，3h后移入速-80℃冰箱中保存，用于提取总rna，以检测肝细胞中srebp-1c、pparα和pparγmrna的表达；另取右叶肝组织3×3×6mm，用10％甲醛(以ph7.4的pbs配制)固定，逐级酒精脱水，常规石蜡包埋，用于病理检查和免疫组化染色。

3.4观测指标和方法

(1)血清学指标检测方法：血清alt、ast、fbg、cho、tg、hdl和ldl-c用日立7020全自动生化仪测定。tnf-α、ins和leptin采用放免法；ffa采用酮试剂比色法。

(2)肝组织匀浆脂质和蛋白含量测定：取300mg肝组织，剪碎，加入冰生理盐水，用均质机磨成10％肝组织匀浆后，4000r/min离心10分钟，提取上清液。肝组织匀浆胆固醇测定采用异丙醇抽提、氧化铝吸附高铁-醋酸-硫酸显色法；甘油三酯测定采用异丙醇抽取、氧化铝吸附磷脂、乙酰丙酮显色法。肝组织匀浆蛋白含量测定采用考马氏亮兰法测定；肝组织mda含量采用tba法测定；肝组织sod活力采用黄嘌呤氧化酶法测定；肝组织gsh-px活力采用分光光度法测定。

(3)肝组织病理学检查：病理诊断常规he染色，计算脂肪变程度。

(4)免疫组织化学：采用sp法，检测肝组织中pparα、pparγ蛋白表达水平。

(5)rt-pcr：genbank检索大鼠srebp-1c、pparα和pparγ引物序列，委托上海鼎安生物科技有限公司合成。用rt-pcr法测定大鼠肝组织中srebp-1c、pparα和pparγmrna的表达水平。

4、研究结果

通过冬凌草抗非酒精性脂肪性肝炎的机理研究，冬凌草组合物和冬凌草甲素治疗nafld均具有显著疗效，明显优于nac、牛磺酸和易善复。冬凌草组合物和冬凌草甲素均能明显减轻脂肪肝大鼠的肝脏指数，降低血清alt和ast，对血清和肝脏的脂肪指标具有明显的改善作用，病理学检测显示，与模型组相比，冬凌草组合物和冬凌草甲素能明显减轻脂肪肝大鼠脂肪变和炎症坏死程度，具体结果如下：

4.1大鼠一般情况：整个实验过程各组大鼠均无伤亡情况发生，正常对照组大鼠毛色白、比较光泽、活动敏捷、食量较多，大便呈颗粒状。模型组皮毛显油腻、粗糙且行动较迟缓，呈明显腹型肥胖状态、食量偏少。各药物干预组大鼠食量及大便性状等一般情况较模型对照组有不同程度改善。从表1可见，各组大鼠初始体重没有显著性差异(p>0.05)，实验结束时模型组大鼠的体重和肝指数较正常组明显增加(p<0.05)，高剂量组、低剂量组、牛磺酸组、乙酰半胱氨酸组和易善复组大鼠体重和肝指数较模型组降低(p<0.05)，而冬凌草甲素组体重下降则不明显(p>0.05)，但肝脏指数较模型组明显下降，各组大鼠体重变化见表1。

4.2对非酒精性脂肪肝大鼠肝重量及肝脏指数的影响

肝脏指数以肝脏湿重/大鼠体重×100来计算，它可以反映肝脏受损伤的程度。模型组大鼠肝脏指数为6.83，高于正常4.23，有显著性差异，药物组能显著降低脂肪肝大鼠肝脏指数，随着治疗药物剂量增加而肝指数呈下降趋势，结果见表1。

表1各组大鼠肝重量及肝脏指数的影响

注：与正常组比较：^ap<0.05；与模型组比较：^bp<0.05。

4.3对各组大鼠血清alt、ast的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠血清alt、ast活性明显升高，差异具有统计学意义(p<0.05)；各治疗药物均能显著降低nafld大鼠血清学指标，差异具有统计学意义(p<0.05)；冬凌草治疗干预后，大鼠血清alt、ast较模型组均明显下降，治疗效果呈剂量依赖性；与等剂量冬凌草甲素、nac组和牛磺酸组比较，冬凌草组合物具有更好的治疗效果，结果见表2。

表2对大鼠血清学指标的影响

注：与正常组比较：^ap<0.05；与模型组比较：^bp<0.05；与nac组比较：^cp<0.05；与牛磺酸组比较：^dp<0.05。

4.4对各组大鼠血脂的比较

大鼠高脂饲料喂养后，模型组大鼠血清cho、tg和ldl-c均较正常对照组显著升高，而hdl含量明显降低，差异具有统计学意义(p<0.05)；高、低剂量组、冬凌草甲素组、易善复和牛磺酸对nafld大鼠具有治疗作用，大鼠血脂各指标均有一定程度的改善，差异具有统计学意义(p<0.05)；乙酰半胱氨酸对nafld大鼠血清脂质改善较差，结果无显著性差异结果(p>0.05)；与等剂量冬凌草甲素、nac、牛磺酸比较，冬凌草组合物对血清cho、tg具有较好的治疗效果，差异具有统计学意义(p<0.05)，hdl-c治疗药物与对照组无显著性差异，结果见表3。

表3对大鼠血清血脂的影响

注：单位为mmol/l，与正常组比较：^ap<0.05；与模型组比较：^bp<0.05；与nac组比较：^cp<0.05；与牛磺酸组比较：^dp<0.05。

4.5对各组大鼠ffa、fbg指标的比较

模型组大鼠血清ffa、fbg均较正常对照组显著升高(p<0.05)，冬凌草组合物高、低剂量组大鼠血清ffa、fbg指标有一定程度的改善，差异具有统计学意义(p<0.05)，乙酰半胱氨酸对血清ffa改善较为明显，牛磺酸能显著降低血清fbg，等剂量冬凌草组合物治疗效果明显优于对照药物，结果见表4。

4.6对各组大鼠tnf-α、ins、leptin指标的影响

模型组大鼠血清tnf-α、ins、leptin均较正常组显著升高(p<0.05)；与模型组比较，冬凌草高、低剂量组、冬凌草甲素组tnf-α、ins、leptin有明显的降低(p<0.05)；nac对tnf-α改善较为明显，而牛磺酸能明显降低nafld大鼠血清ins，结果见表5。

表4对大鼠血清ffa、fbg的影响

注：与正常组比较：^ap<0.05；与模型组比较：^bp<0.05；与nac组比较：^cp<0.05；与牛磺酸组比较：^dp<0.05。

表5对大鼠血清tnf-α、ins、leptin的影响

注：与正常组比较：^ap<0.05；与模型组比较：^bp<0.05；与nac组比较：^cp<0.05；与牛磺酸组比较：^dp<0.05。

4.7对各组大鼠肝组织gsh-px、sod和mda指标的影响

模型组大鼠肝组织中sod、gsh-px活力显著降低，mda含量显著升高，与正常组比较具有统计学意义(p<0.05)；冬凌草甲素、冬凌草组合物不同剂量均能显著改善nafld大鼠肝组织sod、gsh-px、mda；与模型组比较，牛磺酸不能改善nafld大鼠肝组织氧化指标，nac具有较好治疗作用，结果见表6。

表6对大鼠肝组织氧化指标的影响

注：与正常组比较：^ap<0.05；与模型组比较：^bp<0.05；与nac组比较：^cp<0.05；与牛磺酸组比较：^dp<0.05。

4.8对各组大鼠肝组织tg、tc指标的影响

大鼠高脂饲料喂养模型组大鼠肝组织tc、tg含量较正常组均明显升高，差异具有显著性(p<0.05)；经冬凌草治疗后，tc、tg含量较模型组明显降低(p<0.05)；nac不能降低nafld大鼠肝组织tc、tg含量，牛磺酸和易善复具有较好治疗作用；与等剂量nac比较，冬凌草组合物组具有较好治疗效果，结果见表7。

表7对肝组织tg、tc的影响

注：与正常组比较：^ap<0.05；与模型组比较：^bp<0.05；与nac组比较：^cp<0.05；与牛磺酸组比较：^dp<0.05。

4.9肝组织病理学结果

正常组大鼠肝组织光镜下结构完整、清晰，肝小叶结构正常，肝细胞索排列整齐；模型组大鼠肝细胞损伤严重，可见弥漫性肝细胞脂肪变，并有肝细胞气球样变，汇管区伴有炎症细胞浸润，部分点状肝细胞坏死并有碎屑样坏死，伴有少量纤维沉积；高剂量组大鼠肝脏的损伤程度比模型组明显减轻，肝细胞脂肪变性显著减少，仅少许出现点状坏死，少量脂肪滴空泡，汇管区无明显炎细胞浸润；低剂量组、冬凌草甲素组大鼠肝组织也见弥漫性肝细胞脂肪变，程度较模型组轻，炎症出现明显改善；易善复组肝小叶较清晰，未见明显的变性和脂肪变性，偶可见小泡性脂肪滴空泡，与模型组相比，明显减轻，脂肪变和炎症坏死程度均有显著改善，病理结果见图1-8。

4.10各组大鼠肝脏组织免疫组化结果

正常组pparα阳性表达见棕黄色颗粒主要分布在汇管区周围肝细胞胞核内胞浆偶可见，中央静脉周围肝细胞阳性表达少，枯否氏细胞、内皮细胞及其他细胞未见阳性表达；与正常组相比，模型组pparα细胞核阳性表达明显减少(p<0.05)；低、高剂量组与模型组相比，pparα细胞核阳性表达增多，并且成剂量依赖性增加；高剂量组和模型组相比pparα细胞阳性表达具有显著性增加(p<0.05)；

同样，pparγ阳性表达主要定位于肝细胞核内，呈棕黄色颗粒主要分布在汇管区周围肝细胞胞核内；与正常组相比，模型组pparγ细胞阳性表达明显降低(p<0.05)；低、高剂量组与模型组相比，pparγ细胞阳性表达增加，并且成剂量依赖性，高剂量组和模型组相比pparγ细胞的阳性表达具有显著性增加(p<0.05)。如表8，图7-24所示。

表8对大鼠肝组织pparα和pparγ蛋白表达的影响

注：与正常组比较：^ap<0.05；与模型组比较：^bp<0.05；

4.11对大鼠肝组织pparα、pparγ和srebp-1cmrna表达水平影响

与正常组相比，模型组大鼠肝组织pparαmrna表达明显降低，差异具有统计学意义(p<0.05)，与模型组相比，低剂量组、高剂量组有明显上升，并且呈剂量依赖性(p<0.05)；模型组大鼠肝组织pparγmrna表达与正常组比较有明显降低，两组间差异显著(p<0.05)，经过低剂量组、高剂量组治疗后，大鼠肝组织pparγmrna表达明显上升，且呈剂量依赖性(p<0.05)。正常组大鼠肝组织srebp-1cmrna表达量较少，随脂肪肝程度逐渐增加，srebp-1cmrna转录也逐渐增多，与正常组相比，模型组srebp-1cmrna表达较为明显，两者具有显著性差异(p<0.05)。与模型组相比，冬凌草组合物组srebp-1cmrna表达明显减少(p<0.05)，结果见图25-27和表9所示。

表9对nafld大鼠肝组织pparα、pparγ和srebp-1cmrna表达的影响

注：与正常组比较：^ap<0.05；与模型组比较：^bp<0.05；与nac组比较：^cp<0.05；与牛磺酸组比较：^dp<0.05。

5、总结

随着人们生活方式及饮食习惯的改变，nafld的发病率正在逐年升高，在世界范围内成为慢性肝病的最常见病因之一。美国将近1/3成年人患有nafld，肥胖症、2型糖尿病、高甘油三酯血症，体重增长过快，体重急剧下降(特别是原先肥胖者)，与胰岛素抵抗有关的特殊综合征(如脂质萎缩性糖尿病、mauriac综合征)均为nafld的高危人群。

nafld的发生发展涉及脂质代谢异常、ros生成增多、肝脂质过氧化、肝星状细胞活化及细胞因子产生异常等环节。另外研究发现，脂肪肝患者甘油三酯及胆固醇明显升高，且以甘油三酯增高为主要特征，随着高脂血症发病率的上升，高脂血症所致脂肪肝的比例也越来越大。

本实验采用高脂饲料建立nafld动物模型，也是目前采用较多并且比较理想的造模方法；我们用冬凌草组合物和冬凌草甲素进行防治nafld研究发现，它能显著改善nafld大鼠血清alt、ast、tc、tg、ldl-c和hdl-c水平，尤其以冬凌草组合物高剂量组最为明显，这一结果也体现出了本发明中提供的重量比为6:1:3:3:4的冬凌草甲素、冬凌草乙素、迷迭香酸、阿魏酸和槲皮素组成的组合物具有协同治疗nafld的作用。本研究结果初步证实：nafld模型组pparαmrna、pparα蛋白水平表达明显降低，提示pparα表达减少参与nafld发病的分子基础，pparα主要表达在汇管区周围肝细胞胞核内，表明正常时pparα表现出活化形式以适应肝脏内门静脉高营养灌注状态。pparγ蛋白水平表达在nafld大鼠中明显增加，基因敲除pparγ导致小鼠脂肪细胞减少和肥大、血ffa和tg升高、肝脏ir和脂肪肝的发生增加。研究结果显示，冬凌草组合物能显著提高nafld大鼠肝组织pparγ的表达，其可能通过激活pparγ基因改善脂肪组织ir，可见冬凌草组合物具有防止脂质过氧化。冬凌草组合物通过增强pparα和pparγ的表达、改善胰岛素抵抗和脂代谢紊乱，为临床治疗nafld开辟新途径。srebps是一类膜连接蛋白，其位于内质网上。srebp-1也是一种核转录因子，srebp-1c是其中一个亚型，它主要参与糖代谢和脂肪酸的代谢，是脂肪合成基因转录的主要调节因子，与脂肪变性有密切联系。本项目从mrna水平结果显示：srebp-1c、pparγ与肝细胞病变程度有很好的一致性关系，它们可能协同参与nafld的发生、发展。进一步证实了冬凌草组合物通过调节pparγ和srebp-1c的表达从而达到预防和治疗nafld的目的。

另外，研究中我们还发现给予冬凌草组合物干预治疗10周后，冬凌草组合物高剂量组肝组织pparγmrna表达与模型组相比有增高趋势，但幅度没有免疫组织化学染色结果大，两者变化不一致，出现上述表现的原因我们推测一方面可能是由于给予冬凌草组合物干预治疗后pparγ结合活性增强，反馈抑制部分代偿性的pparγmrna表达增强；另一方面，这也可能是外源性配体竞争性抑制内源性配体使pparγ的结构功能发生改变，导致检测到的pparγmrna水平下降。但其具体原因尚有待于进一步的研究。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。