本发明属于生物检测技术领域，涉及一种肿瘤细胞检测探针及其制备方法和应用。
背景技术：
目前，世界范围内，肿瘤的治疗手段主要有虎穴治疗、放射治疗、手术治疗等，手术治疗是肿瘤治疗的首选治疗方法，其优势为可快速显著降低肿瘤体积，延长患者生存期，无耐药性问题。但是手术是否能够及时以及精准的进行，取决于能否对肿瘤细胞进行清晰准确的检测，以精准的指导手术的进行。
基于该需求，一些肿瘤成像技术得到发展，而且靶向性的肿瘤探针得到广泛的关注，因为其可以很好地专一性靶向于肿瘤，对于快速定位肿瘤以及精确的检测提供了帮助。
cn105694851a公开了一种肿瘤靶向诊疗荧光探针，所述探针以肿瘤靶向多肽和凋亡酶特异性识别多肽序列为骨架，荧光猝灭分子荧光对和光动力治疗光敏剂组成，可以实现对肿瘤的靶向治疗，并且降低光动力学治疗光敏剂的毒副作用，在实现对肿瘤进行光动力学治疗的同时，对治疗效果进行原位、精确和实时的评估，然而该探针的设计较为复杂，成本高。
因此，在本领域中，期望能够开发一种低成本、操作简单的肿瘤细胞检测探针。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种肿瘤细胞检测探针及其制备方法和应用。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种肿瘤细胞检测探针，所述肿瘤细胞检测探针包括载体以及负载于载体上的低分子量肝素修饰的碲化镉量子点以及肿瘤靶向配体；所述载体为peg-pla嵌段聚合物。
在本发明中所述肿瘤细胞检测探针中载体选择peg-pla嵌段聚合物能够进行自组装使得肿瘤细胞检测探针形成纳米结构，使得能够在体液环境中稳定存在，并且基于肿瘤靶向配体的靶向作用，能够靶向于肿瘤，实现在肿瘤部位通过量子点成像进行肿瘤的检测和诊断。
优选地，所述peg-pla嵌段聚合物的数均分子量为2000-10000，例如2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000或10000，选择这样的分子量是因为可以使得所述肿瘤细胞检测探针形成稳定的纳米粒子，不至于沉淀析出。
优选地，所述低分子量肝素修饰的碲化镉量子点通过羧基-羟基交联负载在载体上；
优选地，所述肿瘤靶向配体通过氨基-羧基交联负载在载体上。
优选地，所述低分子量肝素的分子量为3500-5500，例如3500、3800、4000、4200、4500、4800、5000、5200或5500。
优选地，所述肿瘤靶向配体为多肽、抗体或者核酸适配体，优选地，所述肿瘤靶向配体为rgd肽。
优选地，所述载体、低分子量肝素修饰的碲化镉量子点和肿瘤靶向配体的摩尔比为(10-100):(5-40):1，例如10:5:1、10:6:1、13:8:1、15:10:1、18:12:1、20:14:1、25:16:1、30:18:1、35:20:1、38:22:1、42:25:1、50:28:1、55:30:1、60:33:1、70:35:1、74:38:1、78:15:1、80:20:1、80:301、85:25:1、87:35:1、90:32:1、95:17:1、97:30:1、100:15:1或100:40:1等。
虽然理论上只要存在相互交联在一起的载体、低分子量肝素修饰的碲化镉量子点和肿瘤靶向配体，就能够各自发挥其作用而起到靶向以及荧光检测的目的，但是在本发明中，发现如果这三个构成单元之间比例的失衡会对于荧光效果以及靶向效果产生影响，如果载体含量过于大，则在自组装过程中形成的纳米体系过于致密，使得纳米体系中靶向部分和荧光功能部分包埋比较严重，因此可能影响到荧光效果和靶向效果的表现，降低检测的灵敏度。而如果载体占比过小的话，则会使得形成的纳米体系不够稳定，也会影响到最终效果的发挥。
另一方面，本发明提供如上所述的肿瘤细胞检测探针的制备方法，所述制备方法为：将低分子量肝素修饰的碲化镉量子点以及肿瘤靶向配体通过化学交联反应连接在载体peg-pla嵌段聚合物上，得到所述肿瘤细胞检测探针。
优选地，通过使得低分子量肝素修饰的碲化镉量子点与peg-pla嵌段聚合物之间发生羟基和羧基的缩合反应形成酯键而将低分子量肝素修饰的碲化镉量子点负载在载体上。
优选地，通过使肿瘤靶向配体与载体之间发生氨基和羧基之间的缩合而将肿瘤靶向配体连接在载体上。
另一方面，本发明提供一种肿瘤细胞检测探针自组装纳米体系，所述肿瘤细胞检测探针自组装纳米体系由如上所述的肿瘤细胞检测探针经过自组装形成。
由本发明所述的肿瘤细胞检测探针经过自组装可以形成稳定的纳米体系，其水合粒径在30-300nm范围内，具有良好的靶向性和荧光成像性。
另一方面，本发明提供了如上所述的肿瘤细胞检测探针或肿瘤细胞检测探针自组装纳米体系在肿瘤细胞标记中的应用。
另一方面，本发明提供了如上所述的肿瘤细胞检测探针或肿瘤细胞检测探针自组装纳米体系在制备肿瘤细胞检测材料中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
在本发明中所述肿瘤细胞检测探针中载体选择peg-pla嵌段聚合物能够进行自组装使得肿瘤细胞检测探针形成纳米结构，使得能够在体液环境中稳定存在，并且基于肿瘤靶向配体的靶向作用，能够靶向于肿瘤，实现在肿瘤部位通过量子点成像进行肿瘤的检测和诊断，并且检测灵敏度高，检测准确高效。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
在本实施例中，提供一种肿瘤细胞检测探针，所述肿瘤细胞检测探针包括载体以及负载于载体上的低分子量肝素修饰的碲化镉量子点以及肿瘤靶向配体；所述载体为peg-pla嵌段聚合物，其中peg-pla嵌段聚合物的数均分子量为5000，所述低分子量肝素修饰的碲化镉量子点通过羧基-羟基交联负载在载体上，所述肿瘤靶向配体通过氨基-羧基交联负载在载体上；所述低分子量肝素的分子量为3500，所述肿瘤靶向配体为rgd肽，所述载体、低分子量肝素修饰的碲化镉量子点和肿瘤靶向配体的摩尔比为20:8:1。
将该肿瘤细胞检测探针经过自组装形成自组装纳米体系。
实施例2
在本实施例中，提供一种肿瘤细胞检测探针，所述肿瘤细胞检测探针包括载体以及负载于载体上的低分子量肝素修饰的碲化镉量子点以及肿瘤靶向配体；所述载体为peg-pla嵌段聚合物，其中peg-pla嵌段聚合物的数均分子量为2000，所述低分子量肝素修饰的碲化镉量子点通过羧基-羟基交联负载在载体上，所述肿瘤靶向配体通过氨基-羧基交联负载在载体上；所述低分子量肝素的分子量为5500，所述肿瘤靶向配体为rgd肽，所述载体、低分子量肝素修饰的碲化镉量子点和肿瘤靶向配体的摩尔比为42:25:1。
将该肿瘤细胞检测探针经过自组装形成自组装纳米体系。
实施例3
在本实施例中，提供一种肿瘤细胞检测探针，所述肿瘤细胞检测探针包括载体以及负载于载体上的低分子量肝素修饰的碲化镉量子点以及肿瘤靶向配体；所述载体为peg-pla嵌段聚合物，其中peg-pla嵌段聚合物的数均分子量为8000，所述低分子量肝素修饰的碲化镉量子点通过羧基-羟基交联负载在载体上，所述肿瘤靶向配体通过氨基-羧基交联负载在载体上；所述低分子量肝素的分子量为4000，所述肿瘤靶向配体为rgd肽，所述载体、低分子量肝素修饰的碲化镉量子点和肿瘤靶向配体的摩尔比为80:35:1。
将该肿瘤细胞检测探针经过自组装形成自组装纳米体系。
实施例4
在本实施例中，提供一种肿瘤细胞检测探针，所述肿瘤细胞检测探针包括载体以及负载于载体上的低分子量肝素修饰的碲化镉量子点以及肿瘤靶向配体；所述载体为peg-pla嵌段聚合物，其中peg-pla嵌段聚合物的数均分子量为10000，所述低分子量肝素修饰的碲化镉量子点通过羧基-羟基交联负载在载体上，所述肿瘤靶向配体通过氨基-羧基交联负载在载体上；所述低分子量肝素的分子量为5500，所述肿瘤靶向配体为rgd肽，所述载体、低分子量肝素修饰的碲化镉量子点和肿瘤靶向配体的摩尔比为10:5:1。
将该肿瘤细胞检测探针经过自组装形成自组装纳米体系。
实施例5
在本实施例中，提供一种肿瘤细胞检测探针，所述肿瘤细胞检测探针包括载体以及负载于载体上的低分子量肝素修饰的碲化镉量子点以及肿瘤靶向配体；所述载体为peg-pla嵌段聚合物，其中peg-pla嵌段聚合物的数均分子量为5000，所述低分子量肝素修饰的碲化镉量子点通过羧基-羟基交联负载在载体上，所述肿瘤靶向配体通过氨基-羧基交联负载在载体上；所述低分子量肝素的分子量为5500，所述肿瘤靶向配体为rgd肽，所述载体、低分子量肝素修饰的碲化镉量子点和肿瘤靶向配体的摩尔比为100:40:1。
将该肿瘤细胞检测探针经过自组装形成自组装纳米体系。
实施例6
在本实施例中，对于实施例1的肿瘤细胞检测探针进行体外细胞标记靶向性检测。
u87-mg细胞和mcf-10a细胞进行消化处理，计数接种至三组共聚焦皿中(浓度为105个/皿)。培养箱中孵育过夜。过夜贴壁后，pbs润洗细胞后，加入100μl用新鲜无血清的dmem低糖培养基为溶剂配制含有肿瘤细胞检测探针的培养液(其中碲化镉量子点终浓度为80μg/ml)。于37℃培养箱中孵育3h。将培养液弃去，加入pbs溶液清洗细胞，重复3次。加入100μlhoechst染色液(按hoechst试剂盒说明书进行配制)，避光染色5min后，用pbs溶液清洗三次。用倒置荧光显微镜观察hoechst染色情况以定位细胞核，荧光显微成像系统观察细胞量子点的荧光标记效果。根据荧光标记结果可以得出所述肿瘤细胞检测探针能够靶向于u87-mg细胞的细胞核，具有很好的靶向作用，但是不能定位于mcf-10a正常细胞的细胞核，也就是说证明本发明所述的肿瘤细胞检测探针具有特异性靶向于肿瘤细胞的作用。
实施例7
在本实施例中，对于实施例1的肿瘤细胞检测探针的肿瘤靶向以及荧光成像情况进行考察。
荷瘤小鼠无菌腹腔注射水合氯醛溶液。待小鼠麻醉后，通过腹腔注射2mg荧光素酶底物d-luciferin，采集荷瘤小鼠的生物发光信号。腹腔注射200μl以pbs溶液配制的含有实施例1所述肿瘤细胞检测探针的溶液(即腹腔给荷瘤小鼠的碲化镉量子点的含量为50μg/只)。使用荧光活体成像系统采集不同时间点小鼠腹腔荧光信号。发现所述荧光信号与生物发光信号位置吻合，证明本发明所述的肿瘤细胞检测探针具有良好的肿瘤靶向性。
此外，本发明利用实施例2-5的肿瘤细胞检测探针同样进行了实施例6和7的检测，同样无论在体外的细胞实验还是在体内实验中均验证了肿瘤细胞检测探针具有肿瘤定位和靶向的作用，可以在肿瘤部位通过荧光检测到荧光信号。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的肿瘤细胞检测探针及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。