一种基于酶降解增强光热清除细菌生物膜的纳米复合材料及其制备方法与应用与流程

本发明属于纳米抗生物膜技术领域，特别涉及一种基于酶降解增强光热清除细菌生物膜的纳米复合材料及其制备方法与应用。

背景技术：

细菌感染对人类健康构成严重威胁，每年在美国造成200多万例疾病和超过23,000例死亡。其中，约80％的人类细菌感染病与活体组织上形成的生物膜有关。在生物膜中，细菌通过自我合成的eps结合在一起，eps通常由多糖、蛋白质和胞外dna（edna）组成。在这种粘性和牢固框架的保护下，生物膜内的细菌对抗生素、宿主免疫防御和环境压力的抗性明显比游离细菌更强。细菌生物膜如果无法完全被根除，往往会导致持续感染，甚至死亡。因此，如何有效清除细菌生物膜是医疗界亟待解决的难题。

另外，近年来抗生素的滥用导致细菌产生耐药性，从而使抗生素疗效大大降低。因此，效果优异的新型抗菌剂越来越受到人们的关注。随着纳米生物医学的不断发展，细菌感染疾病的新疗法应运而生：将生物方法与纳米技术相结合，设计新型纳米抗菌材料，更好的治疗细菌生物膜感染病。当前纳米材料用于治疗细菌生物膜的主要策略包括（ieeetrans.nanobiosci.,2016,15,294.）：（1）纳米材料作为载体，将药物递送到生物膜内部；（2）纳米材料自身作为抗菌剂，通过释放金属离子来破坏细菌的蛋白质或dna；（3）通过基于纳米材料磁热或光热性质的热疗来杀死生物膜内的细菌；（4）在纳米材料表面修饰带负电的分子增强其对生物膜的渗透能力等。但是，目前的纳米技术中存在以下几个问题：缺乏对生物膜靶向能力、副作用较大、eps的阻碍导致疗效较差。

技术实现要素：

为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种基于酶降解增强光热清除细菌生物膜的纳米复合材料及其制备方法与应用，该方法选取具有在低ph条件下降解性能的mno2纳米片作为载体，负载具有降解eps功能的amylase、提高材料生物相容性的peg及具有优异光热性能的icg，制备mapi纳米片。mapi纳米片中的mno2在生物膜的酸性环境下降解，释放amylase和icg，降解eps中的多糖以破坏细菌生物膜eps中的多糖结构，同时增强近红外光热杀菌效果，从而实现细菌生物膜的有效清除。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种基于酶降解增强光热清除细菌生物膜的纳米复合材料，纳米复合材料为淀粉酶amylase、聚乙二醇peg、吲哚菁绿icg修饰的mno2纳米片mapi。

一种基于酶降解增强光热清除细菌生物膜的纳米复合材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：制备mno2纳米材料的水溶液；

步骤2：将mno2纳米材料的水溶液加入淀粉酶amylase的水溶液，并搅拌，将得到的溶液离心，将离心得到的沉淀分散在水中，继续离心纯化，得到mno2-amylase纳米片；

步骤3：将mno2-amylase纳米片的水溶液加入聚乙二醇peg水溶液，并搅拌，将得到的溶液离心，将离心得到的沉淀分散在水中，继续离心纯化，得到mno2-amylase-peg纳米片；

步骤4：将mno2-amylase-peg纳米片的水溶液加入吲哚菁绿icg水溶液，并搅拌，将得到的溶液离心，将离心得到的沉淀分散在水中，继续离心纯化，得到mno2-amylase-peg-icg纳米片。

优选地，所述步骤1中，mno2纳米材料为mno2纳米片，mno2纳米片的粒径为20~200nm。

优选地，所述淀粉酶amylase为α-淀粉酶、β-淀粉酶、γ-淀粉酶、异淀粉酶的一种或多种；所述聚乙二醇peg为mpeg-sh、mpeg-cooh、mpeg-nh2hcl、mpeg-oh的一种或多种。

优选地，所述步骤2中，mno2纳米材料的水溶液的浓度为1~100μg/ml，所述淀粉酶amylase的水溶液的浓度为10~1000μg/ml；所述mno2纳米材料的水溶液和amylase的水溶液的体积比为1：0.5~5。

优选地，所述步骤3中，mno2-amylase纳米片的水溶液的浓度为1~100μg/ml，所述聚乙二醇peg的水溶液的浓度为10~1000μg/ml，mno2-amylase纳米片的水溶液和聚乙二醇peg的水溶液的体积比为1：0.5~5。

优选地，所述步骤4中，mno2-amylase-peg纳米片的水溶液的浓度为1~100μg/ml，所述吲哚菁绿icg的水溶液的浓度为2~200μg/ml，mno2-amylase-peg纳米片的水溶液和吲哚菁绿icg的水溶液的体积比为1：0.5~5。

优选地，所述步骤2-4中，搅拌均在室温下采用磁力搅拌器进行，搅拌时间为0.5-12h；离心的条件为6000~18000rpm，离心的时间为45min；离心纯化的条件为6000~18000rpm，离心纯化的时间为45min，离心纯化的次数为3次。

一种基于酶降解增强光热清除细菌生物膜的纳米复合材料的应用，所述纳米复合材料的抗菌表现为杀死生物膜内细菌，并清除细菌生物膜。

进一步的，当细菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mrsa时，mno2-amylase-peg-icg纳米片的作用浓度为5~100μg/ml。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）、本发明不含抗生素，通过icg的光热效果清除细菌，不易产生细菌耐药问题。

（2）、细菌生物膜微环境响应性能。mno2纳米片可在细菌生物膜弱酸性条件下降解，实现amylase和icg的可控释放，对于细菌生物膜具有特异性识别能力，有助于减小细菌清除过程中对正常细胞的毒副作用。

（3）、细菌生物膜eps降解性能。amylase可以降解eps中的多糖组分，能够破坏生物膜的整体结构，减少其对光热治疗试剂的阻碍作用，有利于将细菌暴露在周围环境中，从而增强icg的光热杀菌效果。

（4）、低的毒副作用。本发明采用mno2纳米片作为载体，降解后的mn离子容易从身体排除，而天然的amylase也可以被人体降解，icg是获得美国食品药品监督管理局（fda）批准的试剂，潜在毒性较小。

附图说明

图1是本发明实施例1验证mapi纳米片的生物相容性的结果示意图；

图2是本发明实施例2验证mapi纳米片的抗生物膜性能的结果示意图，其中：（a）和（c）分别是实施例2验证mapi纳米片的抗生物膜性能的结晶紫染色照片及对应的生物膜生物量，（b）和（d）分别是实施例2验证mapi纳米片的抗生物膜性能的涂板照片及涂板数据统计；

图3是本发明实施例3验证mapi纳米片的抗生物膜性能的扫描电子显微镜（sem）图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。

实施例1

mno2-amylase-peg-icg（mapi）纳米片的制备

1.mno2纳米片的制备

取0.6gmncl2·4h2o（3mm）晶体于50ml反应瓶中，加入10mlh2o。取12mltma·oh（四甲基氢氧化铵，12mm）溶液，加入2mlh2o2（30%wt），并加水稀释至20ml。将以上两溶液混合，溶液由无色透明变棕色，在磁力搅拌器上搅拌反应12h。反应结束后，将溶液取出，在3000rpm下离心10min，取下层沉淀。并用乙醇和水在上述离心条件下各清洗三次，最后加入水溶液定容至30ml。取10ml清洗好的mno2，加入20mlh2o，利用探头超声仪超声10h（功率：40%，时间间隔：5s），将得到的溶液用在12000rpm下离心45min，弃去下层沉淀，将上清液在18000rpm下离心1.5h取下层沉淀，重复离心三次，最终得到mno2纳米片。

2.mno2-amylase（ma）纳米片的制备

将5mlmno2纳米片水溶液（100μg/ml）加入5mlamylase水溶液（1mg/ml），在室温条件下置于磁力搅拌器上搅拌12h。将得到的溶液在18000rpm条件下离心45min，纯化3次得到ma纳米片。

3.mno2-amylase-peg（map）纳米片的制备

将5mlma纳米片水溶液（100μg/ml）加入5mlpeg水溶液（1mg/ml），在室温条件下置于磁力搅拌器上搅拌12h。将得到的溶液在18000rpm条件下离心45min，纯化3次得到map纳米片。

4.mno2-amylase-peg-icg（mapi）纳米片的制备

将5mlmap纳米片水溶液（100μg/ml）加入5mlicg水溶液（200μg/ml），在室温条件下置于磁力搅拌器上搅拌4h。将得到的溶液在18000rpm条件下离心45min，纯化3次得到mapi纳米片。

实施例中，所述amylase选择为α-amylase，所述peg选择mpeg-nh2hcl。

实施例2

mapi纳米片的生物相容性

将hela细胞在含有fbs（10％）、青霉素（80u/ml）和链霉素（0.08mg/ml）的dmem培养基中培养。将收集的对数期细胞加入96孔板（每孔100μl，细胞密度调整至10³-10⁴/孔），置于充有5%co2的37℃恒温箱中孵育。待细胞贴壁后，去除培养液，每孔分别加入100μl含有不同浓度的map(mno2:0,5,10,20,40,80,160μg/ml;amylase:0,18,36,72,144,288,576μg/ml)与mapi（mno2:0,5,10,20,40,80,160μg/ml;amylase:0,18,36,72,144,288,576μg/ml;icg:0,1.6,3.2,6.4,12.8,25.6,51.2μg/ml）的dmem培养基（每个浓度设5个复孔），然后置于充有5%co2的37℃恒温箱中避光孵育24h。之后，每孔加入20μlmtt溶液（5mg/ml，即0.5%mtt），继续在恒温箱中避光孵育4h。终止孵育，吸去上清液，每孔加入150μl二甲基亚砜，使结晶物完全溶解，用酶标仪测定每孔在490nm处的吸光值。此方法的hela细胞活力计算公式：s=c/c0×100%，其中c表示测试样品的od490，c0表示空白对照的od490。

从图1中显示的结果可以看出，通过mtt测定hela细胞与map、mapi孵育24小时后细胞的相对细胞活力，可发现细胞活性均保持在88%以上。该实验结果表明mapnss、mapinss具有优良的生物相容性。

实施例3

mapi纳米片清除细菌生物膜的效果

划取单菌落耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（mrsa，atcc43300）于5ml液体lb培养基中，在恒温摇床下孵育生长10-12h（转速：220rpm，温度：37℃），得到对数生长期的mrsa悬液。将菌液用生理盐水在下清洗三遍（离心条件：10000rpm，3min），利用酶标仪定量后（od600=0.1时，菌液浓度为1×10⁷cfu/ml）。将洗过的菌液用含1%葡萄糖的lb培养基稀释至1×10⁸cfu/ml，分别加入96孔板（每孔200μl）、含有硅片的6孔板（每孔3ml），置于37℃恒温箱中孵育2d，得到mrsa生物膜。

（a）结晶紫染色法

参照图2a和2c，将在96孔板中长好的生物膜去除上清液，每孔分别加入100μl生理盐水、mno2、amylase、icg、map、mapi、mbp、mbpi，置于37℃恒温箱孵育3h。对于光照组，使用785nm激光器在0.8w/cm²下光照10min。去除上清液，每孔加入100μl福尔马林。固定10min后，去除上清液，每孔加入100μl0.2%结晶紫染液。染色30min后，每孔用生理盐水洗涤三次，然后在倒置显微镜下进行成像，成像结果如图2a所示。之后，每孔加入200μl乙醇以溶解结晶紫，3h后通过酶标仪测每孔在590nm处的吸光度，细菌生物量如图2c所示。

从图2a和2c显示的结果可以看出，可以观察到mno2、amylase、icg、map、mapi、mbp（mno2-bsa-peg，bsa对生物膜无降解作用）、mbpi（mno2-bsa-peg-icg）在未光照或光照条件（785nm激光器，0.8w/cm²，光照10min）降解mrsa生物膜的效果（生物膜可被结晶紫染成紫色，而被降解的生物膜被染成无色）。其中，在未光照条件下，amylase、map、mapi均可对生物膜造成一定的降解作用，说明amylase在修饰到mno2纳米材料上后未对其酶活性造成损害。同时，可以观察到mapi经过光照处理后相比未经过光照处理对mrsa生物膜的降解作用更加明显，说明mapi的光热作用可以增强其对生物膜的降解作用。而对于光热效果相同的mapi、mbpi来说，经过光照处理后，前者对生物膜的降解作用明显更好，说明amylase可以增强光热对生物膜的降解作用。

（b）稀释平板法

参照图2b和2d，将在96孔板中长好的生物膜去除上清液，每孔分别加入100μl生理盐水、mno2、amylase、icg、map、mapi、mbp（mno2-bsa-icg）、mbpi（mno2-bsa-icg-icg）（材料均悬浮于生理盐水中），置于37℃恒温箱孵育3h。对于光照组，使用785nm激光器在0.8w/cm²下光照10min。去除上清液，每孔加200μl生理盐水，混匀后加到1.5ml离心管中，分别进行梯度稀释10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶倍，然后将100μl原液及稀释10⁴、10⁵、10⁶倍的菌液加到含有固体lb培养基的玻璃培养皿上进行涂板定量。

从图2d显示的结果可以看出，在未光照条件下，mno2、amylase、icg、map、mapi、mbp、mbpi对mrsa生物膜几乎无杀菌作用；而在光照条件下，mapi对mrsa生物膜的杀菌效果可达到接近2个数量级，mbpi对mrsa生物膜的杀菌效果可达到1个数量级左右，可以看出光热效果相同的mapi比mbpi的杀菌效果高一个数量及左右，说明amylase降解生物膜可以增强mapi的光热杀菌效果。

（c）扫描电子显微镜（sem）观察法

参照图3，将长好的生物膜去除上清液，每孔分别加入1ml生理盐水、mno2、map、mapi、mbp、mbpi（材料均悬浮于生理盐水中，mno2:78μg/ml;amylase:280μg/ml;icg:25μg/ml），并使用785nm激光器在0.8w/cm²下光照10min，置于37℃恒温箱孵育3h。去除上清液，每孔加入1ml福尔马林固定10min，再用不同浓度（30%，50%，70%，80%，90%，95%）乙醇对样品进行梯度脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理两次，每次20min。将处理好的样品通过sem成像。

从图3显示的结果可以看出，在光照条件下，mapi、mbpi对mrsa的细胞结构造成了明显的损伤，同时可以看出光热效果相同的mapi比mbpi的杀菌效果更好，说明amylase降解生物膜可以增强mapi的光热杀菌效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。