一种治疗宫颈癌的药物及其制备的制作方法

本发明涉及一种治疗宫颈癌的潜在药物，尤其涉及一种高硒含量的多糖硒苷-ⅲ。

技术背景

宫颈癌是一种上皮性恶性肿瘤，已成为女性恶性肿瘤中发病率第二高的恶性肿瘤。我国单是2015年一年间，新发现宫颈癌病人便将近十万人，超过三万人死于宫颈癌，且发病率呈上升趋势，严重危害着女性的健康和影响着女性的生活质量。

目前宫颈癌的主要治疗手段是手术、化疗和放疗。化疗作为相对保守的治疗手段，是手术治疗、放疗后的协同治疗手段，且对中晚期常是基本治疗手段。如顺铂、紫杉醇等化疗药物表现出强大的癌细胞抑制作用，但同时对正常组织细胞也有不容忽视的杀伤作用，寻求副作用更低的治疗药物或是辅助治疗物质有着明显市场和社会意义。

技术实现要素：

为实现治疗或辅助治疗宫颈癌，本发明的第一目的在于提供一种能高灵敏性抑制宫颈癌细胞生长、对正常细胞无损伤作用的治疗宫颈癌的药物。

本发明第二目的在于，提供了一种菇多糖硒苷-ⅲ在制备治疗宫颈癌的药物中的应用。

现有技术披露了一些平菇多糖硒苷的提取方式以及在抗氧化方面的作用，但现有技术中很少涉及平菇多糖硒苷在抗肿瘤方面的作用。事实上，本发明研究发现，从平菇中提取的平菇粗多糖(多种活性成分的混合物)基本不具备抗癌活性。然而，在获知平菇粗多糖不具备抗癌活性的研究背景下，行业内没有动机从其中筛查出抗癌成分，然而，本发明人仍通过深入研究，意外地发现，从所述的平菇粗多糖分离得到的平菇多糖硒苷-ⅲ出人意料地具有良好的抗癌活性，甚至还对正常细胞具有良好的促代谢，促修复增殖功效，故提供以下技术方案：

一种治疗宫颈癌的药物，其包含平菇多糖硒苷-ⅲ；所述的平菇多糖硒苷-ⅲ为修饰有有机硒的杂多糖化合物(多糖化合物)；该杂多糖化合物为包含葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、木糖、氨基葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、核糖和鼠李糖中的糖单元(单糖)通过糖苷键连接得到；

水解后的杂多糖化合物中，葡萄糖含量超过80％，半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸含量为超过1％；半乳糖醛酸、木糖、氨基葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、核糖和鼠李糖各自含量不高于1％；优选地，水解后的杂多糖化合物中，葡萄糖含量为82～84％，半乳糖含量为3～5％、甘露糖含量为2.5～3.5％、葡萄糖醛酸含量为1～2％；半乳糖醛酸、木糖、氨基葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、核糖和鼠李糖各自含量低于1％。

本发明所述的抗宫颈癌细胞活性物质是从平菇粗多糖(各成分的混合物)中分离得到的成分，其水解后的单糖包含葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、木糖、氨基葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、核糖和鼠李糖。本发明研究发现，所述的平菇多糖硒苷-ⅲ具有优异的抗癌活性，不仅如此，不但不会损伤正常细胞，还能够促进正常细胞的新陈代谢，改善正常细胞的修复和增殖。

对于大部分已上市的抗癌药物而言，在治疗的过程中其在抑杀癌细胞的同时，对正常细胞也会造成一定的伤害。然而，本发明人通过对平菇多糖硒苷-ⅲ的深入研究，发现平菇多糖硒苷-ⅲ对卵巢癌细胞具有较强的抑杀效果，对正常细胞却没有明显损伤，反而促进正常细胞的新陈代谢，有利于正常细胞的修复和增殖生长，避免在治疗过程中带来的毒副作用。

经过单糖组分分析显示，所述的平菇多糖硒苷-ⅲ水解后的葡萄糖含量超过80％，半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸含量超过1％，而该单糖组成与现有的平菇来源的多糖或多糖衍生物均有明显差别，表明所述的平菇多糖硒苷-ⅲ是新获取的物质。

作为优选，所述的平菇多糖硒苷-ⅲ抗癌活性成分，分子量为13000～18000。本发明所述的平菇多糖硒苷-ⅲ分子量经过gpc测量，其具有较窄的分布宽度，表明提取的平菇多糖硒苷纯度高、质量均一可控(如图2所示)，这为平菇多糖硒苷-ⅲ在宫颈癌治疗或辅助治疗的临床前研究及临床应用提供更为有利的条件。

优选地，所述的有机硒通过se＝o和se-c-o修饰在所述的多糖化合物中。

优选地，所述的平菇多糖硒苷-ⅲ硒含量大于25μg/g(每克平菇多糖硒苷-ⅲ的硒含量大于25μg)；所述的硒以se＝o和se-c-o的形式与多糖结合。所述的平菇多糖硒苷-ⅲ有很高的硒含量，经测定达到25μg/g以上(通过荧光光度计测定，如图5所示)，有助于改善宫颈癌的治疗或辅助效果。

本发明还提供了所述的平菇多糖硒苷-ⅲ获得步骤，为将粗多糖经纤维素交换柱进行分离处理，分离过程包括依次进行的蒸馏水洗脱、0.05～0.15mol/l的氯化钠溶液洗脱、0.25～0.35mol/l的氯化钠溶液洗脱和0.45～0.55mol/l的氯化钠溶液洗脱过程；

收集0.25～0.35mol/l的氯化钠溶液的洗脱液为目标洗脱液，并进行脱盐、浓缩处理，葡聚糖凝胶色谱柱纯化，即得。

本发明所述的制备方法，通过所述的特殊的洗脱机制，可以出人意料地获得纯的平菇多糖硒苷-ⅲ。进一步实验证明，平菇多糖硒苷-ⅲ是一种具有优异抗癌活性，且利于正常细胞新陈代谢增殖的抗癌活性成分。

作为优选，所述的粗多糖由富硒平菇粉经醇水溶液脱脂、水提、醇沉、脱蛋白得到。

作为优选，富硒平菇粉为在包含亚硒酸钠基料中种植得到的平菇的干燥粉料。其可采用现有方法获得，例如，采用在现有平菇粉培育的基质中添加亚硒酸钠基料，从而获得富硒平菇。

所述的醇水溶液脱脂过程的条件为：醇-水溶液为乙醇水溶液，且乙醇的体积含量为75～85％；回流脱脂；

醇水溶液脱脂后进行固液分离，将沉淀在水中分散提取；所述的水提的温度为80～90℃；

水提获得提取液，经浓缩后再加入乙醇中，进行醇沉，固液分离得到醇沉物；

将醇沉物进行脱蛋白处理，即得粗多糖。

所述的纤维素交换柱为deae-52纤维素离子交换柱。

优选地，采用透析手段对目标洗脱液进行脱盐处理。

作为优选，目标洗脱液脱盐后，再选用g-100葡聚糖柱进一步纯化。

本发明所述的治疗宫颈癌的药物，为能特异性使宫颈癌hela细胞凋亡的药物。

所述的对宫颈癌细胞有明显抑制作用是以宫颈癌hela细胞株为研究细胞，以cck-8法测试得对宫颈癌hela细胞株有超过40％的抑制效果；

本发明所用的是典型宫颈癌细胞hela细胞系作为模型研究，对hela细胞超过40％的抑制作用且对正常细胞无抑制作用，这强烈表明了平菇多糖硒苷-ⅲ具有应用于宫颈癌治疗或辅助治疗的潜能。cck-8法由于测试时间更短、不需应用dmso溶出等原因，其测试结果较mtt等其他方法有更强的可靠性。

所述的治疗宫颈癌的药物，为能特异性使宫颈癌hela细胞凋亡，且不影响甚至利于正常宫颈细胞增殖的治疗宫颈癌的药物。本发明还研究了该药物对正常细胞的作用，结果发现，其并不会促使正常细胞凋亡，甚至还有助于促进正常细胞代谢增殖。

本发明所述的治疗宫颈癌的药物，还包含药学上可接受的辅料。

进一步优选，所述的治疗宫颈癌的药物，可以为药学上可接受的任意治疗宫颈癌的药物剂型；例如口服制剂或注射制剂。

口服制剂或外用制剂常用的赋形剂或辅料包括但不仅限于填充剂、稀释剂、润滑剂、分散剂、湿润剂、粘合剂、调节剂、增溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、崩解剂等，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、乳糖、糖粉、糊精、微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉、氢氧化铝、淀粉及其衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、十二烷基硫酸钠、水或醇等。注射制剂常用的赋形剂或辅料包括但不仅限于：抗氧剂、抑菌剂、调节剂、乳化剂、增溶剂等，例如亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、苯酚、甲酚、盐酸、枸橼酸、聚山梨酯-80、卵磷酯、豆磷脂、吐温-80、胆汁、甘油等。所述的治疗宫颈癌的药物对宫颈癌细胞的生长表现出高效的抑制作用，且对正常细胞无明显抑制作用，表明其对肿瘤有特异性的、高效率的抑制作用，能用于制成各种制剂以预防或治疗宫颈癌的药物或辅助药物。

本发明还提供了一种所述的平菇多糖硒苷-ⅲ的应用，将其用于制备治疗宫颈癌的药物。

有益效果

1、本发明意外地发现，平菇多糖硒苷-ⅲ不仅具有良好的抗癌活性，还能够解决现有抗癌活性成分或多或少的对正常细胞的伤害现象，不仅不会对正常细胞带来伤害，相反，还能够出人意料地有助于促进正常细胞的新陈代谢，有助于促进正常细胞的修复和增殖。

2、本发明通过所述的制备方法，可以获得具有良好抗癌活性，且能够出人意料地有助于促进正常细胞的新陈代谢，有助于促进正常细胞的修复和增殖生长的平菇多糖硒苷-ⅲ。

附图说明

图1为平菇多糖硒苷-ⅲ红外光谱图(758cm^-1处的峰为se＝o特征峰,660cm^-1的峰为se-c-o键)

图2为平菇多糖硒苷-ⅲ凝胶渗透色谱(gpc)图

图3为平菇粗硒多糖的纤维柱洗脱曲线(三个组分分别由浓度为0，0.1，0.3mol/l的氯化钠水溶液洗脱下来，分别命名为糖硒苷ⅰ，组分ⅱ，组分ⅲ)

图4为平菇多糖硒苷-ⅲ的水解物及参照单糖的洗脱曲线(hplc)

图5为平菇多糖硒苷-ⅲ的硒含量测定工作曲线

图6多糖硒苷-ⅲ的透射电镜图(tem)

图7为平菇多糖硒苷-ⅲ对hela细胞的抑制效果图

图8为平菇多糖硒苷-ⅲ对hela细胞的ao/eb共染色图像

图9为多糖硒苷-ⅲ孵育后，hela细胞的划痕实验

图10为平菇粗多糖孵育后hela细胞的抑制效果图

图11为平菇多糖硒苷-ⅲ对iose细胞的抑制效果图

图12为平菇多糖硒苷-ⅲ对iose细胞的ao/eb共染色图像

图13为平菇粗多糖孵育后iose细胞的抑制效果图

具体实施方式

下面对本发明通过优选的具体实施方例进行详细说明。

含硒平菇粉为筛选得的平菇品种经含亚硒酸钠基料培育、采集、干燥、粉碎得到。

deae纤维素固定相经传统的常规碱酸预处理，并装在色谱柱内，避免气泡。

g系列葡聚糖按传统的常规方法室温溶胀，并装在色谱柱内，避免气泡。

通过硫酸-苯酚法(依照ny/t1676-2008)监测柱色谱过程中是否有平菇多糖衍生物洗出。

含硒量测试：依照gb5009.93-2017方法制作硒工作曲线，后测试样品中的硒含量。

实施例1

(一)粗硒多糖的制备

取富硒平菇粉(湖南万臻生物科技有限公司提供)15g于圆底烧瓶中，加入80％的乙醇-水溶液120ml，65℃下搅拌回流3h，抽滤，得滤饼，干燥。

水提：取滤饼10g于烧瓶中，添加300ml超纯水，85℃下搅拌3h，离心，取上清液浓缩，得到粘稠液体。

醇沉：将粘稠液体中滴入4倍量无水乙醇，置于4℃下24h，离心，得沉淀物。

脱蛋白：将沉淀物溶于100ml的水中，加入四分之一体积的sevage试剂，离心取上清液，重复6次后用透析袋透析，冻干得到粗多糖。

(二)精制硒多糖

(2.1)离子交换柱纯化过程：选用deae-52纤维素离子交换柱纯化多糖，将300mg的样品溶于10ml水中，湿法上样。之后依次用蒸馏水、0.1、0.3、0.5mol/l的氯化钠溶液梯度洗脱。用苯酚-硫酸法，在490nm下隔管检测多糖含量，绘制洗脱曲线图，收集主要组分。共分离出三个组分，本发明取自0.3mol/l的氯化钠水溶液洗脱下来的组分，即组分3。

(2.2)透析：将样品-水溶液用旋转蒸发仪浓缩至10-15ml，之后用盐酸溶液调节ph至7，用去离子水透析36h，之后浓缩至5ml。

(2.3)葡聚糖柱纯化过程：选用g-100葡聚糖纯化组分3(2.2成分)，将5ml的样品湿法上样，之后用去离子水洗脱，用苯酚-硫酸法隔管检测，浓缩，冻干，得到精制平菇多糖硒苷-ⅲ。

平菇多糖硒苷的水解及单糖组分分析：精密称取样品至5ml安培瓶中，加入2ml(2.0mol/l)三氟乙酸于5ml安瓿中，封管，110℃酸解8h。取出挥干三氟乙酸，加2ml水复溶，完成水解。后精确吸取250μl水解后溶液到5mlep管中，加入250μl(0.6mol/l)氢氧化钠，500μl(0.4mol/l)1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液，70℃反应1h。冷水中冷却10min；加入500μl0.3mol/l盐酸中和，再加入1ml氯仿漩涡1min，3000r/min离心10min，小心取上清，萃取3次。取上清液，完成衍生化。参照试样为含50μg/m各对比糖的糖混合溶液，以同样条件进行衍生化。最后样品和参照品经过xtimatec18高效液相设备在洗脱，记录洗脱曲线，通过样品与参照品的峰面积比即可计算得单糖组分(洗脱液为：0.05mol/lph＝6.7磷酸二氢钾溶液-乙腈＝83-17)。其单糖组分分析结果见表1和图4。

表1平菇多糖硒苷-ⅲ组成单糖含量

采用实施例1获得的平菇多糖硒苷-ⅲ进行以下抗癌和正常细胞毒性的研究，具体为：

实施例2

多糖硒苷-ⅲ(实施例1获得)对hela细胞的药效实验

以8000细胞/孔细胞密度将hela细胞种在96孔细胞培养板上，待贴壁后，依次加入不同浓度的平菇多糖硒苷-ⅲ(设置终浓度0、50、100、200、400和600μg/ml六组)，继续孵育24h后以传统的常规cck-8法测试细胞活力。

以每孔5000个细胞的密度种板，贴壁24h之后，以不同浓度的多糖硒苷-ⅲ药物的细胞培养液(0μg/ml，300μg/ml，600μg/ml)替换旧的培养液，培养24h。ao/eb染色观察。

划痕实验用来验证药物对细胞迁移能力的影响，以每孔1x10⁶的细胞密度接种细胞，培育24h以贴壁，之后用200μl的枪头划痕，之后以含药物的无血清培养基培养0，12h，24h，48h后，在荧光倒置显微镜下观察。

得到的平菇多糖硒苷-ⅲ呈白色絮状固体，略偏淡黄色。重均分子量为15306(见图2)，含硒量为28.38μg/g。其对hela细胞抑制效果如图7所示，在加入600μg/g平菇多糖硒苷-ⅲ与hela细胞共孵育24h之后，细胞抑制率超过40％。如图8所示，随着加入的平菇多糖硒苷-ⅲ浓度增大，eb通道信号加强，细胞凋亡情况增加。也直观地证明了平菇多糖硒苷-ⅲ对hela细胞有较好的抑制作用。如图10所示，在添加了药物之后，对比空白组，癌细胞的迁移能力明显减弱，直观地证明了平菇多糖硒苷-ⅲ对hela细胞的迁移能力有较大的抑制能力。

对比例1

平菇粗多糖(未进行过柱纯化，实施例1步骤(一)产物)对hela的药效实验

以8000细胞/孔细胞密度将hela细胞种在96孔细胞培养板上，待贴壁后，依次加入不同浓度的平菇粗多糖(实施例1获得，设置终浓度0、50、100、200、400和600μg/ml六组)，继续孵育24h后以传统的常规cck-8法测试细胞活力。

如图10所示，在用平菇粗多糖孵育hela细胞24h后，随着给药浓度的增大，细胞存活率仅仅有少许降低，在给药浓度为600μg/ml时，细胞存活率还可以达到83％。这也说明该平菇粗多糖对hela细胞无明显的抑制作用。

实施例3

采用实施例1获得的平菇多糖硒苷-ⅲ进行iose细胞抑制实验。

以8000细胞/孔细胞密度将iose细胞种在96孔细胞培养板上，待贴壁后，依次加入不同浓度的平菇多糖硒苷-ⅲ(设置终浓度0、50、100、200、400和600μg/ml六组)，继续孵育24h后以传统的常规cck-8法测试细胞活力。

以每孔5000个细胞的密度种板，贴壁24h之后，以不同浓度的多糖硒苷-ⅲ药物的细胞培养液(0μg/ml，300μg/ml，600μg/ml)替换旧的培养液，培养24h。ao/eb染色观察。

其对iose细胞抑制效果如图11所示，明显看出，所制备的平菇多糖硒苷-ⅲ对宫颈癌hela细胞有显著抑制作用，对iose正常细胞无抑制作用，表明平菇多糖硒苷-ⅲ具有优异的抗宫颈癌潜能。此外ao/eb共染色结果如图12所示，表明即便加入高浓度的平菇多糖硒苷，eb通道信号仍变化不大，再次印证了平菇多糖硒苷的安全性。

对比例2

平菇粗多糖(未进行过柱纯化，实施例1步骤(一)产物)对iose细胞的药效实验

以8000细胞/孔细胞密度将iose细胞种在96孔细胞培养板上，待贴壁后，依次加入不同浓度的平菇粗多糖(设置终浓度0、50、100、200、400和600μg/ml六组)，继续孵育24h后以传统的常规cck-8法测试细胞活力；

如图13所示，在用平菇粗多糖孵育iose细胞24h后，随着给药浓度的增大，细胞存活率增大，这在一定程度上证明该平菇粗多糖对正常细胞无明显抑制作用。