维康醇在制备治疗宫颈癌药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明研究维康醇对HeLa细胞增殖及细胞周期调控的影响，经过不同浓度维康醇处理24小时的HeLa细胞，细胞周期分析结果显示G1期细胞含量明显高于对照组(P＜0.01)；Western?blot结果显示维康醇能够降低HeLa细胞周期蛋白cyclinD1的表达；同时ELISA结果也表明维康醇能下调CDK4的表达，并增强CDK抑制剂P21的表达；RT-PCR实验结果也揭示了，经维康醇能降低HeLa细胞中cyclinD1，CDK2，CDK4的mRNA水平，上调P21在mRNA水平上的表达。说明维康醇将HeLa细胞阻滞在G1期，从而使细胞的增殖受到抑制。
【专利说明】维康醇在制备治疗宫颈癌药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种云南紫杉树皮中提取的影响肿瘤细胞增殖及周期调控的化合物，属于肿瘤局部介入治疗药物开发领域的维康醇在制备治疗宫颈癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002]肿瘤是指人体器官组织的细胞，在外来和内在有害因素的长期作用下所产生的一种以细胞过度增殖为主要特点的新生组织。这种新生组织与受累器官的生理需要无关，不按正常器官的规律生长，破坏了原来器官结构，丧失正常细胞的功能，从而使细胞呈现异常的形态，细胞的功能和代谢发生紊乱。另外，肿瘤细胞还能向周围浸润蔓延，甚至扩散转移到其他器官组织，危及生命。
[0003]目前，恶性肿瘤已成为危害人类健康最严重的疾病之一，仅次于心脑血管疾病，位列致死病因的第二位.世界卫生组织预测，到2020年，将有2000万新发癌症病例，其中死亡人数达1200万，且绝大部分将发生在发展中国家。临床常用治疗肿瘤的方法有外科手术、化学疗法、放射疗法，但这些方法通常具有严重的副作用，患者常因免疫功能受创，出现远处播散、肿瘤转移，使得生活质量下降、生存期缩短。因而近年来从天然药物中寻找高效低毒的抗肿瘤药物成为研究热点，迄今已成功开发出紫杉醇、长春新碱、足叶乙甙等一大批植物中获取的化学成分并已成功应用到恶性肿瘤的一线临床治疗中。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于维康醇对HeLa肿瘤细胞增殖及对此细胞周期调控的影响进行研究，寻找其作用靶点，为维康醇将来的研究和开发提供理论依据的维康醇在制备治疗宫颈癌药物中的应用。
[0005]本发明的目的是通过下述方案实现的
[0006]其实验方法:
[0007](1)主要试剂的配制，其中包括DMEM培养基配制、维康醇的配制、胰酶的配制、PI染色液的配制
[0008](2)细胞培养
[0009](3) Hechs染色观察细胞形态
[0010](4)细胞周期测定
[0011](5)Western Blotting实验,其中包括主要试剂配制、样品制备、蛋白含量测定、样品进行SDS.PAGE电泳、转膜
[0012](6)Cyclin Dl，Cdk4，P2I 含量的测定
[0013](7)半定量RT-PCR，其中包括细胞总RNA的提取、cDNA第一条链合成、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳
[0014]⑶数据处理
[0015](9)实验结果，其中包括Hoechst33258染色观察细胞形态、维康醇对HeLa细胞周期调控的影响、维康醇抑制细胞周期蛋白(cyclin Dl)的表达、维康醇对HeLa细胞中Cyclin D1，⑶K4，P21表达的影响、半定量RT-PCR检测细胞周期相关蛋白mRNA水平的表达
[0016]维康醇是一种分子量为352，结构式见图一，它是从云南紫杉树皮中获取一种微生物菌诱变株，经过发酵、纯化等工艺从该菌的菌丝体及培养基中分离出一种新型单体化合物。到目前为止，维康醇的抗肿瘤作用未见研究。因此，本研究的目的就是对维康醇抑制肿瘤细胞增殖的机理进行初步研究，寻找其作用靶点，为维康醇将来的研究和开发提供理论依据。
[0017]本实验拟采用SRB法，检测不同浓度维康醇对人宫颈癌HeLa细胞株的增殖抑制作用来研究维康醇的抗肿瘤机制。
【专利附图】
【附图说明】:
[0018]图1为配制lmg/ml的BSA(牛血清白蛋白)，0.15Μ NaCl，在取样管中加入试剂的量
[0019]图2为cDNA合成体系
[0020]图3为扩增体系
[0021]图4为扩增引物及退火温度
[0022]图5为Hoechst33258染色观察细胞形态
[0023]图6为流式细胞仪测定细胞周期
[0024]图7为维康醇抑制细胞周期蛋白(cyclin Dl)的表达
[0025]图8为维康醇对HeLa细胞中细胞周期相关蛋白的表达量的影响
[0026]图9为半定量RT-PCR检测细胞周期相关蛋白的表达
【具体实施方式】
[0027]下面结合附图对本发明进行详细说明:
[0028]具体方案:
[0029]步骤1:主要试剂的配制:(I)DMEM培养基的配制:将DMEM细胞培养基10.3g，NaHC033.7g，加1000ml超纯水搅拌溶解，调整PH = 7.2-7.4，加入青霉素和链霉素，其终浓度都是100U/ml，贮存于4°C备用，0.22 μ m滤膜过滤除菌分装，4°C冰箱保存备用。使用前加入10%胎牛血清，即为完全培养基。(2)维康醇的配制:称取维康醇Img放入0.5mL离心管中，加入DMSO 4μ I将其溶解，即为50mg/ml维康醇母液。临用前无血清DMEM培养基或完全培养基稀释到所需浓度。(3)胰酶的配制:配制浓度为0.25%胰蛋白酶。称取胰蛋白酶
0.25g，溶于100ml PBS中，加NaHC03调pH7.2，充分溶解后，过滤除菌，IOml小瓶分装后保存于-20°C，用前融化。(4)PI染液的配制:称取PI 5mg、RNase 5mg、枸橼酸纳100mg、然后量取 1.0% Triton X-100 0.25ml、生理盐水 65ml，加蒸馏水至 100ml，调 pH 值 7.2-7.6，用棕色瓶子分装，4 °C避光保存。
[0030]步骤2:细胞培养于含10%小牛血清的完全培养基中，置于37°C，5% C02，95%空气和100%饱和湿度条件下培养，细胞每两天传代换液一次。
[0031]步骤3 =Hechs染色观察细胞形态，取处于指数生长期的HeLa细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成悬液，用血球细胞板计数，配成2 X 105/ml，取放有盖玻片的6孔细胞培养板，每孔加细胞悬液3ml，将每组药液分别加入各孔中。将细胞板放在37°C，于5%CO2的培养箱中分别孵育24h后取出。取出载玻片，加I滴混合Hoechst荧光染色液:压上爬满细胞的盖玻片，荧光显微镜下观察凋亡细胞形态。
[0032]步骤4:细胞周期测定，细胞经过维康醇处理24h后，收集细胞于离心管中，离心去除上清,加预冷的体积分数为70%的乙醇3ml边加边震荡，使细胞完全分散，后置4°C冰箱过夜，然后离心弃去乙醇，加PBS洗2遍,最后加配好的PI染液(0.05mg/ml), RNaseA(0.5mg/ml)避光染色30min。用流式细胞仪检测各细胞周期所占的比例。激发波长Ex =488nm ;发射波长 Em = 650nm。
[0033]步骤5:ffestern Blotting
[0034](I)主要试剂:10X转移缓冲液、TBS缓冲液、TBST缓冲液、转移平衡液、封闭液、考马斯亮蓝G-250、SDS聚丙烯酰胺凝 胶
[0035](2)样品制备:将细胞培养至80-90%融合时，胰酶消化，调整细胞浓度至2X105个/ml，加入细胞瓶中培养24h后，加入含不同浓度的维康醇培养基继续培养24h。弃掉上清，用PBS清洗细胞2次，用胰酶消化，将细胞转移到1.5ml EP管中，加入100 y L含PMSF的裂解液，置冰上裂解30min，不时轻弹管壁以便裂解均匀。然后用液氮反复冻融三次，于
4。。，12，000 Xg离心15min。将上清分装，_70°C保存。
[0036](3)蛋白含量测定
[0037]制作标准曲线:配制lmg/ml的BSA(牛血清白蛋白)，()? 15M NaCl，按下表在取样管中加入试剂。(见附图1)混匀后，加96孔板每孔150iU，室温放置2min，酶标仪595nm处测定吸光度，绘制标准曲线。
[0038]检测样品蛋白含量:取样品4iU，0.15MNaCl 16 yl，考马斯亮蓝G-250溶液1ml，混匀。于595nm处测定吸光度，从蛋白标准曲线上计算相对应的蛋白含量，将样品用电泳缓冲液调成等蛋白含量，加入1/4体积的5XSDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴5min后，-70°C保存。
[0039](4)样品进行SDS.PAGE电泳:将上述样品(约为20 yl)上样，电泳(10 %SDS-PAGE胶)，40V 30min, 60V 3h后，终止电泳，进行转膜。
[0040](5)转膜:剪切与凝胶尺寸一致的2张滤纸和I张硝酸纤维素膜，一般下滤纸>膜>胶>上滤纸，将凝胶及硝酸纤维素膜浸泡于转移缓冲液中30分钟，并用转移缓冲液将滤纸浸湿。在阳极(石墨板)一侧依次放上I张滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶及I张滤纸(用玻璃移液管排除所有的气泡)，与阴极一侧连接后，接通电源，在23V条件下转移40min。用含5%脱脂奶粉的封闭缓冲液封闭硝酸纤维素膜2h，用TBST缓冲液洗膜5次，5min/次，4°C下用一抗孵育过夜(兔抗人Cyclin Dl抗体，I: 200)。再用0.1 % TBST洗膜5次，5min/次，室温下用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗孵育2h(抗兔，I: 1000) ；0.1% TBST洗膜3次，IOmin/次。SantaCruz敏感曝光试剂盒曝光底片显影,并用Gel-PRO Analyzer软件分析结果。
[0041]步骤6 =Cyclin Dl, Cdk4，P21 含量的测定
[0042]本实验采用的是生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定样品中人周期素依赖性激酶4(CDK4)、细胞周期素Dl以及P21的水平。向预先包被了人周期素依赖性激酶4(⑶K4)单克隆抗体的酶标孔中加入周期素依赖性激酶4 (⑶K4)，温育；温育后，加入生物素标记的抗⑶K4抗体，再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中人周期素依赖性激酶4(CDK4)的浓度呈正相关
[0043]具体步骤如下:
[0044](I)试验前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温(20_25°C )。
[0045](2)取出所需数量的板条，其余密封放回4°C。
[0046](3)建立标准曲线:设定5个浓度，每个浓度两个复孔，每孔中各加入标准品稀释液100uL。首先在小试管中加入120 μ I的原倍标准品，再加入120 μ I的标准品稀释液，即浓度为12ng/ml ;再取120 μ I前次标准品稀释液，然后加入120 μ I的标准品稀释液，此时浓度为6ng/ml ;依次类推，得到3，1.5,0.75ng/ml的稀释液。
[0047](4)加样:待测样品孔:加入样本40 μ I，然后各加入抗-CCNDl抗体10 μ 1、链酶亲和素-HRP50y 1，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，即2: 3稀释。
[0048](5)将反应板置37°C，60分钟。
[0049](6)洗板:小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
[0050](7)显色:每孔先加入显色剂Α50μ I,再加入显色剂Β50μ I,轻轻震荡混匀。
[0051](8)37°C避光显色10分钟。
[0052](9)每孔加终止液50 μ I，终止反应(此时蓝色立转黄色)
[0053](10)测定:在450nm波长依序测量各孔的吸光度(0D值)。测定应在加终止液后10分钟以内进行。
[0054]所有OD值都应减除空白值后再行计算。以标准品12、6、3、1.5,0.750ng/ml之OD值在半对数纸上作图，画出标准曲线。将浓度作为X轴(对数轴)，OD值作为Y轴(线性轴)。曲线应为一光滑曲线。根据样品OD值在该曲线图上查出相应Cyclin Dl，Cdk4，P21含量。(此时所查出的目的蛋白的量为稀释I倍后的浓度值，因此还须再乘以稀释倍数)
[0055]步骤7:半定量RT-PCR
[0056](I)细胞总RNA的提取:用Trizol试剂按说明提取细胞总RNA，药物处理后的HeLa细胞，用胰酶消化，并收集与1.5ml的EP管，加入0.5ml Trizol试剂，混匀后室温下放置5min，使核蛋白和核酸完全分离；加入0.1ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s后室温放置3min ；4°C, 12000rpm离心IOmin,此时样品分三层,上两层为水相,最底下一层为有机相，RNA主要在最上面一层的水相中，把水相转移的新的EP管中(大约250 μ I)，进行下一步操作(注:不要吸任何中间层物质，否则会出现染色体DNA污染)；然后缓慢加入等体积异丙醇，在-20°C放置lh，然后4°C，12000rpm离心lOmin，此时可见微量沉淀，去除上清液；再加入75%乙醇Iml震荡，于4°C,7500rpm离心5min,弃掉上清；按照上述步骤再清洗两次,弃掉上清。将EP管置于超静工作台通风lOmin，以充分晾干，如有漂洗残留物，可能会影响实验后续的操作。最后，在新的EP管中，加入30 μ I RNase_freeddH20,室温放置2min,室温，12000rpm 离心 2min，得到 RNA，RNA 在 _70°C储存。
[0057](2) cDNA第一条链合成
[0058]cDNA合成体系见附图2
[0059](3) PCR 扩增[0060]扩增体系见附图3
[0061]扩增的反应条件:94°C预变性5min,94°C变性30s,不同引物选择不同温度退火45s，72°C延伸45s，循环35次或者30次后于72°C延伸lOmin，得PCR产物，产物短期储存在_20°C，长期储存在_70°C，(注:尽量避免反复冻融)。
[0062]扩增引物及退火温度见附图4
[0063](4)琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖凝胶的配置:1.6g琼脂糖溶于80ml PH为8的TBE溶液，于微波炉煮沸3次，置于室温，待温度下降只50-60°C之间，加入8 u I Golden View,摇匀，注意不要摇出气泡，混匀后倒入插有梳子的制胶板待其凝固，制成2.0%的琼脂糖凝胶。将PCR产物上样，100V35min跑胶，终止电泳并在紫外线下成像、拍照。
[0064]步骤8:数据处理，所有实验设3个平行组或重复3次，结果以[± S表示，以t检验进行组间统计学差异比较，以P < 0.05为差异具有统计学意义，P < 0.01为差异具有极显著统计学意义。
[0065]步骤9:实验结果
[0066](l)Hoechst33258染色观察细胞形态
[0067]Hoechst33258与活细胞中DNA聚AT序列富集区域的小沟处与DNA结合，从而使细胞核着色。故又把此类染料称为DNA探针。当受到在荧光显微镜紫外光激发时，Hoechst-DNA发出亮蓝色荧光。活细胞核呈弥散均匀荧光，出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。由附图5可见，维康醇处理HeLa细胞24h后，与空白组(control)相比，荧光亮度一致，细胞形态也未发生改变，没有出现明显的凋亡形态。因此，维康醇并不是通过诱导HeLa凋亡而抑制细胞增殖。
[0068](2)维康醇对HeLa细胞周期调控的影响
[0069]PI染色流式细胞术细胞周期分析的结果显示，维康醇对HeLa细胞周期的分布有影响。4.g/ml维康醇孵育24小时后，HeLa细胞的Gl期比例由45.9%上升到73.1% ;S期比例则由39.2%下降到7.1%；G2期比例变化不大。这些数据显示维康醇将HeLa细胞周期阻滞在Gl期。见附图6
[0070](3)维康醇抑制细胞周期蛋白(cyclin Dl)的表达
[0071]cyclin Dl是细胞周期调控中cyclin蛋白家族的最重要的成员。当cyclinDl基因变异时，cyclinDl会出现过度表达，使细胞过度增生，产生肿瘤。在Gl期早期，D型周期蛋白开始表达，并与⑶K4或⑶K6等多种激酶结合，使pRb磷酸化，释放E2f，因此促进细胞周期的进行。我们首先用western blot检测cyclin Dl的表达水平。如附图7所示,给与维康醇处理的各组随着药物浓度增大，cyclin Dl条带逐渐变细，亮度变暗。经图象软件分析统计后，对照(control)组的相对密度值为1.09，1.5,3.0,4.5 u g/ml各组比值分别降低至1.01,0.83,0.64 (P < 0.01)。数据表明，维康醇能够有效抑制cyclin Dl蛋白的表达，并具有明显浓度依赖性。
[0072](4)维康醇对HeLa细胞中Cyclin Dl, Q)K4, P21表达的影响
[0073]利用ELISA试剂盒对HeLa细胞内的细胞周期相关蛋白(CyclinDl，CDK4，P21)的表达水平进行定量检测。见附图8
[0074](5)半定量RT-PCR检测细胞周期相关蛋白mRNA水平的表达
[0075]cyclinD, E是Gl期细胞周期蛋白，并在Gl期和G1/S交界处发挥作用、启动细胞周期并能促进DNA合成的细胞周期蛋白。在Gl期，⑶K2，⑶K4或⑶K6分别与cyclin E，D形成复合物，使PRb磷酸化，诱导转录因子(E2f)的表达。P21是Cyclin-⑶K复合物的负性调节因子，并通过抑制Rb表达而阻止细胞周期进行。从附图9可以看出，给与维康醇处理的各组随着药物浓度增大，cyclin Dl, cyclinD2以及⑶K2的mRNA的表达逐渐减低，相反的，P21的表达量则随着浓度加大而逐渐增多。数据表明，维康醇能够有效抑制cyclin Dl,D2的表达，增强P21的表达，并具有明显浓度依赖性。
[0076]讨论:细胞周期是一个复杂有序并受严格调控的过程，它分为Gl期、S期、G2期和M期4个时期。细胞周期调控是在G期、S期和G2/M期3个控制点的控制下，通过各种调控因子的激活和失活，使细胞依次启动和完成细胞分裂的过程。细胞周期中各种调节因子组成复杂的网络系统，该系统包括细胞周期素(cyclins)、细胞周期蛋白依赖性激(CDKs)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKIs)，其核心为⑶Ks的活性表达与调控，cyclins起着正调控作用，而CKIs为负调控因子。
[0077]细胞周期调控机制的紊乱，特别是G1/S期检测点和G2/M期检测点的改变，在细胞癌变过程中发挥着至关重要的作用。
[0078]cyclin D1、CDK4是G1/S期关键的正性调节因子，两者形成cyclin D1/CDK4复合物，激活抑癌基因pRb，pRb磷酸化后，释放转录因子E2F，从而促进细胞增殖。
[0079]Cyclin E/⑶K2复合物是细胞周期中Gl期向S期转换过程中重要的活性物质，Cyclin-E的过度表达能促进 Gl-S的转换。同时，Cyclin A是调节细胞周期S期和G2/M期的重要蛋白之一 [84-87]，Cyclin A在S期与依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶2 (⑶K2)结合参与调控DNA复制，与CDKl结合参与G2/M过渡。
[0080]本研究通过Western blot, ELISA和RT-PCR分析显不，维康醇能够下调cyclinDl和⑶K4蛋白的表达，并且能够降低⑶K2，cyclin D2以及cyclin E2mRNA的表达。
[0081]p21认作为是细胞周期内通用性抑制物，它能够与相应的cyclin-⑶K复合物结合，抑制其蛋白激酶的激活，阻滞细胞周期的运行。本研究通过RT-PCR分析显示，随着维康醇处理HeLa细胞浓度逐渐增加，其表达量逐渐增多，与对照组相比差异具有统计学意义。上述结果表明，维康醇诱导HeLa细胞Gl期阻滞的主要机制可能是通过降低cyclin Dl,⑶K2，⑶K4表达量，并且上调P21表达量，从而负调控G1/S期检测点，阻滞细胞由Gl期进入S期。
[0082]综上所述，维康醇能抑制HeLa细胞增殖，其机制可能与维康醇诱导HeLa细胞cyclin D1，⑶K2，⑶K4表达上调，并且降低P21表达量，从而将HeLa细胞阻滞于Gl期有关抑制HeLa细胞增殖。
【权利要求】
1.一种维康醇在制备治疗宫颈癌药物中的应用，其特征在于:是由维康醇在某种浓度下对HeLa细胞增殖及周期调控的影响；所有实验设3个平行组或重复3次，结果以[± S表示，以t检验进行组间统计学差异比较，以P < 0.05为差异具有统计学意义，P < 0.01为差异具有极显著统计学意义。
2.根据权利要求1所述的维康醇在制备治疗宫颈癌药物中的应用，其特征在于:进行维康醇的配制:称取维康醇Img放入0.5mL离心管中，加入DMSO 4 U I将其溶解，即为50mg/ml维康醇母液；临用前无血清DMEM培养基或完全培养基稀释到所需浓度。
3.根据权利要求1所述的维康醇在制备治疗宫颈癌药物中的应用，其特征在于:对细胞进行培养:培养于含10%小牛血清的完全培养基中，置于37°C，5% C02，95%空气和100%饱和湿度条件下培养，细胞每两天传代换液一次。
4.根据权利要求3所述的维康醇在制备治疗宫颈癌药物中的应用，其特征在于:取处于指数生长期的HeLa细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成悬液，用血球细胞板计数，配成2 X 105/ml，取放有盖玻片的6孔细胞培养板，每孔加细胞悬液3ml，将每组药液分别加入各孔中；将细胞板放在37°C，于5% CO2的培养箱中分别孵育24h后取出；取出载玻片，加I滴混合Hoechst荧光染色液:压上爬满细胞的盖玻片，荧光显微镜下观察凋亡细胞形态。
5.根据权利要求2或3所述的维康醇在制备治疗宫颈癌药物中的应用，其特征在于:细胞经过维康醇处理24h后，收集细胞于离心管中，离心去除上清，加预冷的体积分数为70 %的乙醇3ml边加边震荡 ，使细胞完全分散，后置4°C冰箱过夜，然后离心弃去乙醇，加PBS洗2遍,最后加配好的PI染液(0.05mg/ml) ,RNase A(0.5mg/ml)避光染色30min ;用流式细胞仪检测各细胞周期所占的比例。激发波长Ex = 488nm ;发射波长Em = 650nm。
6.根据权利要求2或3所述的维康醇在制备治疗宫颈癌药物中的应用，其特征在于:进行 Western Blotting 实验。
7.根据权利要求2或3所述的维康醇在制备治疗宫颈癌药物中的应用，其特征在于:对细胞进行Cyclin Dl, Cdk4，P21含量的测定。
8.根据权利要求2或3所述的维康醇在制备治疗宫颈癌药物中的应用，其特征在于:对细胞进行半定量RT-PCR测试。
9.根据权利要求4-8所述的维康醇在制备治疗宫颈癌药物中的应用，其特征在于:得出实验结果。
【文档编号】A61K31/336GK103520144SQ201210225706
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2012年7月3日 优先权日:2012年7月3日
【发明者】刘亮亮, 郑秋生, 姚瑛, 张波, 王振华 申请人:郑秋生