一种靶向脑毛细血管内皮细胞的基因递释系统的制作方法
【专利摘要】本发明属于药物制剂领域，涉及一种短肽介导的靶向脑毛细血管内皮细胞的基因递释系统。所述基因递释系统包括靶向功能基、基因药物和载体。所述的靶向功能基为短肽，载体为聚β-氨基酯和聚乙二醇-聚β-氨基酯，短肽与聚乙二醇共价连接，基因药物通过包载或吸附的方式与载体形成纳米级基因递释系统。该基因递释系统通过将基因主动靶向递送至脑毛细血管内皮细胞内，使脑毛细血管内皮细胞表达所需要的分泌型药物蛋白，并进一步将其分泌递送至脑内，从而实现脑部神经退行性疾病的治疗。
【专利说明】一种靶向脑毛细血管内皮细胞的基因递释系统
【技术领域】
[0001]本发明属于药物制剂领域，涉及一种靶向脑毛细血管内皮细胞的基因递释系统，具体涉及一种短肽介导的靶向脑毛细血管内皮细胞的基因递释系统。
【背景技术】
[0002]随着人类社会的老龄化，脑神经退行性疾病的发病率正呈逐年上升的趋势，已经成为危害人类生命和健康的重大疾病之一。由于血脑屏障(BBB)的存在阻碍了化学药物、蛋白多肽和基因药物的脑内递送，严重影响了脑部疾病的治疗效果，目前，临床对于神经退行性疾病尚无有效的治疗措施和药物。本领域研究者关注于基因治疗可能是攻克和治愈神经退行性疾病最具希望和挑战的研究课题。
[0003]脑靶向纳米递药系统的研究为脑部疾病的治疗带来新的希望。目前，脑靶向的策略主要是通过受体介导或吸附介导的机制增加纳米递药系统透过血脑屏障，从而提高脑内的药物浓度，如专利“一种脑靶向递药系统”(专利申请号200910051970.3)，“脑血管内皮细胞靶向性聚乳酸纳米粒载体及其制法和应用”(专利申请号200610125443.9)，“一种脑靶向基因传释系统及其制备方法”(专利申请号200610116486.0)，“脑靶向脂质体药物制剂的制备方法”(专利申请号200310105969.7)，“一种99mTc肿瘤显像药物脑靶向脂质体制剂及其应用”(专利申请号200910141973.6)，“一种乙酰胆碱受体介导跨越血脑屏障的主动靶向递药系统”(专利申请号201010110665.X)，“苯甲酰胺类似物介导的脑靶向递药系统”(专利申请号201010111960.7)，“具有脑靶向递药特性的多肽及其制备方法”，(专利申请号201110029806.X)，“有机胺衍生物作为小分子药物脑靶向修饰基团的用途”(专利申请号201010144446.3)等。采用受体介导或吸附介导的机制使纳米递药系统透过血脑屏障，虽然一定程度上可以提高脑内的药物浓度，但仍然存在以下缺点，尤其是对于基因药物:①脑靶向的效率不高，通常仅能提高2~3倍；②组织选择性较差，通常在增加药物脑内递送的同时，可能更大程度地提高其它组织器官的药物浓度；③由于基因必须进入脑实质细胞内表达目的蛋白才能发挥治疗作用，故纳米基因递药系统必须克服BBB和神经细胞两种细胞屏障，因此进入神经元细胞核的基因量和基因转染效率就更低，往往难以达到治疗要求；④纳米载体进入脑实质后，由于脑内的滞留和蓄积而存在很大的安全性问题。鉴于此，亟需研究更为安全、有效的脑神经退行性疾病的基因治疗系统。
[0004]血脑屏障(BBB)是由极化的脑毛细血管内皮细胞、基膜和胶质细胞足突所构成，其中脑毛细血管内皮细胞起主要屏障作用。由于脑毛细血管内皮细胞与大部分神经细胞紧密相邻，因此脑毛细血管内皮细胞内表达的分泌型蛋白可分泌进入脑内，直接为神经细胞所摄取利用。鉴于此，通过靶向脑毛细血管内皮细胞的新策略将可实现基因表达产物的脑内递送，有利于脑内疾病的治疗。如:构建一种靶向性的非病毒基因载体，将基因主动靶向递送至脑毛细血管内皮细胞内，使脑毛细血管内皮细胞表达所需要的分泌型药物蛋白，并进一步将其分泌递送至脑内，进而与神经细胞表面的受体结合发挥药理作用。由于非病毒基因载体只需克服脑毛细血管内皮细胞一种细胞屏障，而且不需进入脑实质细胞，因此该靶向策略既可显著提高脑毛细血管内皮细胞的细胞核基因摄取量，提高基因的转染效率，又可避免纳米载体进入脑实质而引发的安全性问题。
[0005]TBl 肽(序列 TFFYGGCRGKRNNFKTKRY，编号 Angiop印78)是 AngioChem 公司通过生物信息学方法筛选获得的一条短肽。该短肽具有很强的脑毛细血管内皮细胞靶向性，脑动脉灌注试验显示其脑毛细血管内皮细胞分布容积(Vd)值是脑实质的12倍，全脑分布容积是Angiop印I的5倍，显示其可作为靶向脑毛细血管内皮细胞的功能分子。但是，由于TBl序列中间存在一个半胱氨酸(Cys)，既影响其结构稳定性，也不利于Cys修饰后保持肽的活性。
[0006]聚β -氨基酯(poly ( β-amino esters)，PAE)是一种新型的非病毒基因载体，是由二丙烯酸酯和含伯氨基化合物通过Michael加成反应聚合而成的一类阳离子聚酯。研究表明，PAE具有体内外转染效率高、毒性低、可生物降解的优势。
[0007]目前国内外未见采用TB短肽修饰PAE-C32靶向脑毛细血管内皮细胞的基因递释系统的报道。
【发明内容】
[0008]本发明的目的旨在针对现有脑靶向基因递释系统的不足，提供一种新的靶向脑毛细血管内皮细胞的基因递释系统，具体涉及一种短肽介导的靶向脑毛细血管内皮细胞的基因递释系统。该基因递释系统通过将基因主动靶向递送至脑毛细血管内皮细胞内，使脑毛细血管内皮细胞表达所需要的分泌型药物蛋白，并进一步将其分泌递送至脑内，从而实现脑部神经退行性疾病的治疗。
[0009]本发明的靶向脑毛细血管内皮细胞的基因递释系统，包括靶向功能基、药物和载体；所述的靶向功能基为短肽，载体为聚氨基酯和聚乙二醇-聚氨基酯，短肽与聚乙二醇共价连接，基因药物通过包载或吸附的方式与载体形成纳米级基因递释系统。
[0010]所述的基因递释系统粒径为10-300nm。
[0011]本发明中，靶向功能基是介导靶向脑毛细血管内皮细胞的短肽，选自序列I的TBl肽、序列2的TB2肽或序列3的TB3肽。优选TB2或TB3肽。
[0012]本发明中，将TBl肽的氨基酸序列进行了突变，突变后获得短肽TB2 (序列CTFFYGGSRGKRNNFKTKRY)和短肽 TB3 (序列 cTFFYGGSRGKRNNFKTKRY，c 为 D 型 Cys)，可明显改善TBl肽的结构稳定性，提高可修饰性，并保持TBl肽对脑毛细血管内皮细胞的靶向性。
[0013]本发明中，基因载体为聚β_氨基酯(PAE)和聚乙二醇(PEG)-聚β-氨基酯(PEG-PAE)，其中:ΡΑΕ为线性或枝状，优选线性，分子量为5000-20000Da，优选8000-12000Da ；PEG 分子量为 1000_20000Da，优选 2000_5000Da ;上述 PEG-PAE 的聚乙二醇部分可以是单甲氧基聚乙二醇，也可以是含其它活性基团的聚乙二醇；PAE和PEG-PAE可以以任意比例混合使用；上述活性基团是马亚酰亚胺基、巯基、胺基、羧基、生物素或亲和素中的一种；
[0014]其中的聚β -氨基酯(poly (β-amino esters)，PAE)是一种新型的非病毒基因载体，是由二丙烯酸酯和含伯氨基化合物通过Michael加成反应聚合而成的一类阳离子聚酯；与阳离子脂质体、聚乙烯亚胺(PEI)、聚赖氨酸(PLL)、树状高分子PAMAM等非病毒载体相比，所述PAE具有体内外转染效率高、毒性低、可生物降解的优势；[0015]本发明的实施例中，优选的，以PAE为基因载体，以多肽TB2或TB3为靶向功能基，获得高转染效率和高安全性的靶向性非病毒基因载体(TB-NP)，通过靶向脑毛细血管内皮细胞，实现基因表达产物的脑内递送，进一步实现脑部神经退行性疾病的治疗。
[0016]本发明中，基因药物通过包载或吸附的方式载入基因递释系统内。
[0017]所述的基因药物是指含有治疗基因的质粒DNA，所述治疗基因为神经营养因子基因。除治疗基因外，质粒DNA还包括治疗基因前后的序列，可以是启动子、增强子，促进基因转录和翻译的序列，能够使质粒DNA在被转染细胞中复制的序列。所述神经营养因子是神经营养生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子3 (NT-3)、神经营养因子4/5 (NT-4/5)神经营养因子6 (NT-6)、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞源性神经营养因子(⑶NF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子I (IGF)、转化生长因子β(TGF^ )、表皮生长因子(EGF)或血小板源性生长因子(PDGF)中的一种。
[0018]本发明的目的通过以下技术方案实现:
[0019]1、TB肽与脑毛细血管内皮细胞结合试验
[0020]采用5-羧基荧光素(5-FAM，绿荧光)标记短肽ΤΒ1、ΤΒ2、ΤΒ3，与BCEC共孵育6小时，荧光显微镜和流式细胞法测定短肽ΤΒ1、ΤΒ2、ΤΒ3与BCEC的结合情况，证实ΤΒ2肽和ΤΒ3肽具有与TBl类似的靶向BCEC特性。
[0021]2、ΤΒ1，ΤΒ2肽的细胞结合饱和实验
[0022]采用Na125I碘化TBl、ΤΒ2肽，经G25凝胶色谱柱分离除去游离125I。将不同浓度1251-TB的磷酸盐缓冲溶液(PBS，ρΗ7.4)与BCEC在4°C条件下共培养，将细胞裂解后测定125I放射性强度和细胞蛋白含量，进行结合`饱和分析，求算TBl、TB2肽与BCEC细胞表面受体复合物的解离常数Kd，证实TB2保持了 TBl与BCEC的亲和性。
[0023]3、TBl，TB2肽的药动学与组织分布
[0024]采用Na125I碘化TB1、TB2肽，SD大鼠静脉注射1251-TB的PBS溶液，定时采血和组织样品，测定TB1，TB2肽的药动学与组织分布，体内实验证实TB2保持了 TBl对BCEC较强的靶向性。
[0025]4、载基因纳米粒的制备与表征
[0026]将TB2肽与马亚酰亚胺基-PEG-PAE共价相连得到TB2-PEG-PAE，将PAE与TB2-PEG-PAE按9:1比例混和溶解后，与等体积的质粒DNA溶液中混合，即得到载基因的PAE纳米粒(TB-NP)，通过凝胶色谱柱分离纯化TB-NP。Zeta/激光粒度仪测定TB-NP的平均粒径和电位，透射电镜观察TB-NP的形态。
[0027]5、体外转染
[0028]通过纳米粒包载绿荧光蛋白报告基因(pEGFP)，定性检测绿荧光蛋白和定量测定绿荧光细胞阳性率，考察NP表面修饰TB2后对BCEC的转染效率。证实NP表面修饰TB2后可显著增加对BCEC细胞的基因转染效率。
[0029]6、TB-NP靶向BCEC实现基因产物脑内递送的体外评价
[0030]通过纳米粒包载人源脑源性神经营养因子治疗基因(TB-NP-hBDNF)，采用TB-NP-hBDNF转染BCEC细胞，以转染后的BCEC细胞接种于transwell插件(24孔)中，建立体外BBB连接模型。测定已建立的BBB模型中供体池、接收池中分泌出的hBDNF蛋白量随时间变化的动力学，评价基因产物hBDNF的脑内递送特征和效率。[0031 ] 7、TB-NP靶向BCEC的活体成像评价
[0032]通过纳米粒包载溴乙锭单叠氮盐(EMA)标记的hBDNF质粒DNA,活体成像法评价TB-NP对脑部BCEC的靶向性。
[0033]8、TB-NP-hBDNF治疗AD模型鼠的效果评价
[0034]采用大鼠双侧海马(CA1-CA3)区注射Amyloid- β 25_35建立AD模型，通过Morris水迷宫实验评价TB-NP-hBDNF治疗对模型大鼠空间学习和记忆障碍的改善作用。
[0035]9、基因递释系统对BCEC的毒性评价
[0036]采用3- (4，5- 二甲基噻唑-2) _2，5_ 二苯基四氮唑溴盐(MTT法)评价TB-NP对BCEC的毒性。
[0037]结果显示，TB2肽和TB3肽具有与TBl类似的靶向BCEC特性；TB1、TB2与BCEC细胞表面受体复合物的解离常数Kd分别为261.1nM,206.nM，表明TB2保持了 TBl与BCEC的亲和性及较强的靶向性；当PAE与DNA的质量比为100:1时PAE可完全包封DNA，包封率为99.3% ；NP表面修饰TB2后可显著增加对BCEC细胞的基因转染效率；TB_NP靶向BCEC实现基因产物脑内递送的体外评价结果显示，基因产物具有很高的脑内分泌效率；活体成像评价结果显示TB修饰NP后对脑部BCEC有良好的靶向性。本发明经动物试验结果表明TB-NP-hBDNF对Amyloid- β 25_35诱导的大鼠学习和记忆障碍具有明显的改善作用。
[0038]本发明的靶向脑毛细血管内皮细胞的基因递释系统的优点有:`[0039]通过靶向脑毛细血管内皮细胞，能实现脑部神经退行性疾病的治疗，既可明显提高脑毛细血管内皮细胞的细胞核基因摄取量，提高基因的转染效率，又避免了纳米载体进入脑实质而引发的安全性问题。
[0040]为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的靶向脑毛细血管内皮细胞的基因递释系统进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
【专利附图】
【附图说明】:
[0041]图1，TB肽与脑毛细血管内皮细胞结合图，
[0042]其中，上一行为荧光显微镜观察结果:(A) TBl肽、(B) TBl肽、(C) ΤΒ2肽(放大倍数200倍)；下一行为流式细胞检测结果:(D)阳性率、(E)荧光强度。
[0043]图2，TBl，ΤΒ2肽的细胞结合饱和曲线图。
[0044]图3，TBl, ΤΒ2肽的药动学与组织分布，
[0045]其中，(A)药动学，(B)脑部分布容积，(C)器官组织分布。
[0046]图4，TB-NP 的表征，
[0047]其中，(A)粒径分布图，(B)透射电镜图。
[0048]图5，TB-NP-EGFP的体外BCEC细胞转染，
[0049]其中，A:荧光显微镜结果；B:48h流式细胞仪测定结果。
[0050]图6，体外BBB模型中基因产物hBDNF的脑内递送，
[0051]其中，(A)体外BBB模型的跨细胞电阻，(B)体外BBB模型中基因产物hBDNF的脑内递送情况。[0052]图7，TB-NP靶向BCEC的活体成像，
[0053]其中，(A) 2小时，(B) 8小时，(C) 24小时，左侧为TB-NP组，右侧为NP组。
[0054]图8，TB-NP-hBDNF基因治疗对AD大鼠空间学习和记忆的影响。
[0055]图9，基因递释系统的细胞毒性。
【具体实施方式】:
[0056]实施例1、TB肽与脑毛细血管内皮细胞结合试验
[0057]合成5-羧基荧光素(5-FAM，绿荧光)标记的短肽TB1、TB2、TB3，每个短肽分子标记一个5-FAM。BCEC细胞以每孔10000个细胞的密度接种于24孔板中培养2天，显微镜观察汇合度80%左右用于细胞结合试验。移除培养液，加入300 μ L浓度为48nmol/mL的TB短肽溶液(含10%胎牛血清)，37°C培养6小时，冰冷PBS洗3次，荧光显微镜和流式细胞法测定短肽TBl、TB2、TB3与BCEC的结合情况。结果如图1显示，TBl、TB2、TB3短肽均能与BCEC很好的结合，而且结合阳性率和荧光强度均无显著性差异，表明TB2肽和TB3肽具有与TBl类似的靶向BCEC特性。
[0058]实施例2、TBl，TB2肽的细胞结合饱和实验
[0059]采用Na125I碘化TBl、TB2肽，经G25凝胶色谱柱分离除去游离125I。BCEC细胞以每孔10000个细胞的密度接种于24孔板中培养2天，显微镜观察汇合度80%左右用于结合饱和试验。移除培养液，加入300 μ L含有不同浓度1251-TB的PBS溶液(ρΗ7.4)，使1251-TB终浓度分别为 0.1,0.2,0.5，1,2,5,10，50，100，500，1000nM，4°C培养 120min，冰冷 PBS 洗 3次，每孔200 μ LlN NaOH裂 解，然后100 μ L2N HCL中和，测定125I放射性强度，同时采用BCA法测定细胞蛋白含量，每次实验重复4次。实验结果采用Graph Pad Prism 5.0进行结合饱和分析，求出TB肽与BCEC细胞表面受体复合物的解离常数Kd。实验结果如图2所示:TB2、TBl与BCEC细胞的结合饱和曲线相似；TB1、TB2与BCEC细胞表面受体复合物的解离常数Kd分别为261.1nM,206.nM，上述结果表明TB2保持了 TBl与BCEC的亲和性。
[0060]实施例3、TB I，TB2肽的药动学与组织分布
[0061]药动学:采用Na125I碘化TBl、TB2肽，SD大鼠静脉注射含有80 μ Ci1251-TB的PBS溶液(0.4mL/大鼠)，定时(5分钟，10分钟，15分钟，30分钟，45分钟，60分钟)采血0.2mL。组织分布:给药方法同上，定时(5分钟,60分钟)处死大鼠，4°C Hepes-Ringer缓冲液灌注，迅速取大脑、小脑、心、肝、脾、肺、肾称重，分离大脑毛细血管和脑实质。Y计数仪测定各血样及组织中放射性强度，计算TB肽的药动学参数及组织分布，各器官摄取TB肽的量以每克组织中占注射剂量的百分比表示(％ID/g tissue)。
[0062]如图3A所示，TB2与TBl的动力学曲线相似。计算其药动学参数，TB2、TBl在血中的 AUCchoo 分别为 3.00%ID.h/mL, 3.01%ID.h/mL, MRT 分别为 3.16h, 3.10h。TB2 的AUCO-⑴、MRT与TBl相比均无显著性差异，表明TBl经氨基酸突变到TB2后，其药动学行为未发生显著性改变。此外，TB2与TBl相比，其组织分布也没有显著性差异(图3B，3C)。尾静脉注射1251-TB260分钟后，TB2在大脑和小脑中的分布量分别为0.062±0.002%ID/g,
0.058±0.003%ID/g (图3B)，TB2在脑毛细血管部位的分布容积为80.7± 11.1 μ L，远高于其在脑实质部位的分布容积6.6±5.3 μ L，表明ΤΒ2保持了 TBl对BCEC较强的靶向性。
[0063]实施例4、TB-NP的制备与表征[0064]采用5-氨基-1-戊醇和I，4- 丁二醇二丙烯酸酯合成分子量为1000ODa的PAE及马亚酰亚胺基-PEG-PAE (PEG分子量为3400Da)，将TB2肽与马亚酰亚胺基-PEG-PAE共价相连得到TB2-PEG-PAE。将PAE与Maleimide-PEG-PAE按9:1比例混和溶解后，加入到等体积的质粒DNA溶液中混合，即得到载基因的PAE纳米粒(TB-NP)，通过凝胶色谱柱分离纯化TB-NP。Zeta/激光粒度仪测定TB-NP的平均粒径和电位，透射电镜观察TB-NP的形态。
[0065]结果显示，当PAE与DNA的质量比为100:1时PAE可完全包封DNA，采用PicoGreen试剂盒定量测定DNA包封率为99.3%。Zeta/激光粒度仪测定TB-NP的平均粒径35.4nm(图4A)，平均Zeta电位约+25mV，透射电镜显示粒子形态呈圆形，粒径在50nm以下(图4B)。
[0066]实施例5、TB-NP的体外转染
[0067]将BCEC细胞种于24孔板，接种密度为I X IO5个细胞/孔，观察丰度达到70%~90%时进行转染。通过纳米粒包载报告基因PEGFP对BCEC转染，质粒DNA (EGFP)的浓度为2.5 μ g/孔，48h后观察EGFP的表达情况，定性检测绿荧光蛋白和定量测定绿荧光细胞阳性率，考察NP表面修饰TB2后对BCEC的转染效率。
[0068]由图5A可知，NP表面连接TB2后，BCEC中绿荧光蛋白的表达显著增加；流式细胞仪测定结果(图5B)也显示TB-NP组绿荧光细胞阳性率高达86%，显著高于NP组，并且与商用试剂盒Lipo-Plus相当(80%)。上述结果表明，NP表面修饰TB2后可显著增加对BCEC细胞的基因转染效率。
[0069]实施例6、TB-NP靶向BCEC实现基因产物脑内递送的体外评价
[0070]将BCEC细胞种于24孔板，接种密度为I X IO5个细胞/孔，观察丰度达到70%~90%时进行转染。通过纳米粒包载报告治疗基因(TB-NP-hBDNF)对BCEC转染。将已转染的BCEC细胞以5000个/孔的密度接种于transwell插件(24孔)中，建立体外BBB连接模型。插件供体池中加培养液100 μ L，接受池加培养液细胞液600 μ L，培养箱中培养，每天更换新鲜培养基，采用细胞电阻仪测定BBB模型的跨细胞电阻，考察紧密连接的形成。紧密连接的形成后每天抽取插件供体池中细胞液IOOyL以及接受池中的细胞液600 μ L，酶联免疫法测定已建立的BBB模型中供体池、接收池中分泌出的hBDNF蛋白量随时间变化的动力学，计算评价基因产物hBDNF的脑内递送特征和效率。
[0071]如图6A所示，体外BBB模型中BCEC跨细胞电阻从第四天开始即保持相对稳定的状态，只在140 Ω左右范围上下波动，与文献报导基本一致，表明体外BBB模型构建成功，已经形成紧密连接。从图6B可以看出，在形成紧密连接以后，BCEC细胞往细胞两侧分泌的蛋白基本保持同样的量，表明所构建的载体系统靶向BCEC后基因产物的递送并无明显极性；另一方面，在构建BBB模型后直到第八天BCEC细胞仍保持高水平的hBDNF分泌量，表明基因产物具有很高的脑内分泌效率。
[0072]实施例7、TB-NP靶向BCEC的活体成像评价
[0073]采用光解反应将质粒标记溴乙锭单叠氮盐(EMA):将200 μ ghBDNF质粒DNA加入至5μ gEMA水溶液中，冰浴中放置15min，采用薄层层析紫外灯(254nm)直接照射30分钟，加入乙醇使终浓度为70%，HOOOrpm离心30min，即得EMA标记的质粒DNA。将EMA标记的质粒DNA按实施例4载入TB-NP中，尾静脉注射入20克裸鼠体内，剂量为50 μ g/裸鼠。给药后分别于2小时、8小时、24小时乙醚麻醉，放入活体成像系统内观察。如图7所示，2小时、8小时TB-NP组裸鼠脑部的荧光显著高于未修饰NP组，表明TB修饰NP后对脑部BCEC有良好的靶向性。
[0074]实施例8、TB-NP-hBDNF治疗AD模型鼠的初步效果
[0075]采用大鼠双侧CA1-CA3区注射Amyloid-β 25_35建立AD模型，通过Morris水迷宫实验评价TB-NP-hBDNF治疗对模型大鼠空间学习和记忆障碍的改善作用。
[0076]AD模型鼠的制备:将Amyloid-β25_35溶于注射用水(2g/L)，密封37°C振摇76h使其成凝聚态，_20°C冻存备用。SD大鼠采用10%水合氯醛麻醉后固定于脑立体定位仪上，于两侧海马(CA1-CA3)区各缓慢(I μ L/min)注入凝聚态Amyloid-β 25_355 μ L，留针5分钟后缓慢撤针，缝合切口，阴性对照组(Sham control)注射等量生理盐水,动物苏醒后常规饲养。
[0077]分组与给药:动物手术后随机分成3组，每组8只，与阴性对照组共4组，手术后尾静脉注射(表2)，隔天给药，连续给药7次(14天)后开始水迷宫实验。
[0078]水迷宫试验:实验前5天为学习阶段。每只大鼠每天接受4次训练，每次训练90s，两次训练间隔时间为30s。每次训练的大鼠入水点为随机顺序排列的4个象限，每相邻两天的入水顺序不同。摄像头记录大鼠在水池中的游泳轨迹及大鼠到达平台的潜伏期。若大鼠在90s内上台，允许其在平台上停留20s ;若908内大鼠不能发现并爬上平台，则将其导引至平台并使之在平台上停留20s，其潜伏期定为90s。实验第六天进行探索试验。每只大鼠试验两次，分别将大鼠从第三象限的起点和终点放入水中，记录并分析90s内大鼠跨越平台的次数。实验结果如图7所示,AD模型组的潜伏期(Day4, Day5)均显著高于假手术组(Sham control),表明大鼠双侧CA1-CA3区注射Amyloid-β 25_35可导致大鼠学习和记忆障碍，模型建立成功(图8Α)。而TB-NP-hBDNF组的潜伏期(Day4，Day5)均显著低于AD模型组，表明TB-NP-hBDNF可明显改善Amyloid-β 25_35所致的大鼠学习和记忆障碍(图8Α)。NP-hBDNF组的潜伏期(Dayl至Day5)与AD模型组无显著性差异，表明NP-hBDNF对Amyloid- β 25_35所致的大鼠学习和记忆障碍(图8Α)无明显改善作用。跨台试验结果也显示TB-NP-hBDNF组的跨台次显著高于AD模型组，与Sham control组相比无显著性差异。上述结果表明TB-NP-hBDNF对Amyloid-β 25_35诱导的大鼠学习和记忆障碍具有明显的改善作用。
[0079]表1分组与给药
[0080]
【权利要求】
1.一种靶向脑毛细血管内皮细胞的基因递释系统，其特征在于，其包括靶向功能基、基因药物和载体； 所述的靶向功能基为短肽，所述的载体为聚β-氨基酯和聚乙二醇-聚β-氨基酯，所述短肽与聚乙二醇共价连接，基因药物通过包载或吸附的方式与所述载体制成纳米级基因递释系统。
2.按权利要求1所述的基因递释系统，其特征在于，所述的靶向功能基是介导靶向脑毛细血管内皮细胞的短肽，选自序列I的TBl肽、序列2的ΤΒ2肽或序列3的ΤΒ3肽。
3.按权利要求1所述的基因递释系统，其特征在于，所述的聚β_氨基酯为线性或枝状，分子量为5000~20000道尔顿。
4.按权利要求1所述的基因递释系统，其特征在于，所述的聚氨基酯和聚乙二醇-聚β-氨基酯以任意比例混合。
5.按权利要求1所述的基因递释系统，其特征在于，所述的聚乙二醇-聚氨基酯的聚乙二醇部分是单甲氧基聚乙二醇，或是含其它活性基团的聚乙二醇。
6.按权利要求5所述的基因递释系统，其特征在于，所述的活性基团是马亚酰亚胺基、巯基、胺基、羧基、生物素或亲和素中的一种。
7.按权利要求1所述的基因递释系统，其特征在于，所述的纳米级基因递释系统粒径为10-300纳米。
8.按权利要求1所述的基因递释系统，其特征在于所述的基因药物是含有治疗基因的质粒DNA。`
9.按权利要求8所述的基因递释系统，其特征在于所述的治疗基因为神经营养因子基因。
10.按权利要求9所述的基因递释系统，其特征在于所述的神经营养因子选自神经营养生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子3、神经营养因子4/5、神经营养因子6、睫状神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、转化生长因子β、表皮生长因子或血小板源性生长因子。
【文档编号】A61P25/28GK103505744SQ201210225177
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月30日 优先权日:2012年6月30日
【发明者】庞志清, 蒋新国, 高会乐, 苏婧晗, 钱勇, 魏彦 申请人:复旦大学