芪参益气滴丸在对抗抗癌药物心脏毒性中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了芪参益气滴丸在对抗抗癌药物的心脏毒性中的应用。芪参益气滴丸可以改善抗癌药物引起的心肌损失和心功能损伤。芪参益气滴丸能够改善多柔比星引起的大鼠心肌ATP的降解、过氧化物酶体增殖物激活受体α的降低、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子1α的降低，减轻心肌的远心性肥大和心肌损伤，增加心脏表面血流量，改善心功能。
【专利说明】芪参益气滴丸在对抗抗癌药物心脏毒性中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药领域，尤其是涉及芪参益气滴丸在对抗抗癌药物心脏毒性中的应用。
【背景技术】
[0002]癌症和心血管疾病(cardiovascular diseases,CVD)已成为中国成人主要死亡原因，而70%以上的老年癌症患者合并有CVD。有CVD的癌症患者增加了抗肿瘤化疗药物的心血管毒性，提高了化疗风险。研究抵抗化疗药物的心血管毒性对癌症的治疗具有重要的临床意义。[0003]多柔比星(DOX)属蒽环类抗生素，是目前最有效的抗肿瘤药物之一，但是持续使用可以导致充血性心力衰竭，其严重的剂量依赖性心脏毒性限制了其临床应用。DOX引起心肌损伤与自由基、铁离子代谢失衡、钙超载、线粒体损伤和细胞凋亡等相关。新近的研究表明DOX还可引起心肌ATP降低，引起过氧化物酶体增殖物激活受体a (peroxisomeproliferator-activated receptor- α , PPAR α )的下调和抑制 AMP 激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)的憐酸化。
[0004]PPARa的激活是调节心脏脂肪酸氧化(fatty acid oxidation, FA0)酶类基因表达的关键因素之一。过氧化物酶体增殖物激活受体Y辅激活子la (perox1-someproliferator-activated receptor- Y coactivator-1 α , PGC-1 α )是心脏代谢和做功必不可少的调控子，PGC-1a与PPARa共活化可调节FA0，对心肌能量代谢和心肌损伤有重要调控作用。激活AMPK可增加葡萄糖和脂肪酸的代谢来维持ATP水平从而减轻心肌损伤，保护心脏功能HMAMPK的活化增强了脂肪酸氧化，导致葡萄糖氧化降低，增加了糖酵解的有害副产品的堆积，使ATP利用度降低，从而使心脏功能和效率降低。总体上AMPK的激活调控心肌代谢尚存在争议。上述研究提示，通过调控心肌能量代谢，有可能改善DOX引起的心肌结构和心功能损伤。但是，目前临床上缺少调控心肌能量代谢，改善心肌结构和心功能损伤的药物。
[0005]芪参益气滴丸(QSYQ)是由黄芪、丹参、三七和降香油组成的中药复方制剂。于2003年经中国国家食品药品监督管理局批准用于治疗冠心病、心绞痛，具有剂量小、服用方便、溶出速度快、可直接经粘膜吸收入血、生物利用度高、疗效高及无胃肠刺激、无明显毒副作用的特点。
[0006]临床前药效学试验表明，QSYQ可以使心肌梗塞犬的梗塞范围缩小，缺血性心电图改善，血清酶CK和LDH活性降低，血浆ET和TXB2水平降低，6-Keto-PGFl α活性和6-Keto-PGFl α /ΤΧΒ2比值升高；可使心肌缺血再灌注损伤大鼠的梗塞范围缩小，SOD活性增加。QSYQ可使大鼠体外血栓长度缩短，重量减轻，并可使血浆及全血粘度降低；可使高脂血症家兔的TC、TG、LDL-C, VLDL-C水平降低，HDL-C水平升高，使主动脉TC含量和肝脏TG及MDA含量降低；并可使花生四烯酸和胶原诱导的血小板聚集率降低；犬血流动力学试验表明，QSYQ可通过扩张冠脉血管使冠脉流量增加，使心肌耗氧指数降低；在不增加左室做功情况下，使心搏出量和心输出量增加等。
[0007]但是，QSYQ能否有改善抗癌药物所引起的大鼠心肌结构和心功能损伤，能否调控心肌能量代谢等尚不清晰。[0008]为解决上述技术问题，本发明对芪参益气滴丸进行了研究，发现其具有对抗抗癌药物的心脏毒性的作用。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于提供芪参益气滴丸在对抗抗癌药物的心脏毒性中的应用。
[0010]本发明所述应用是芪参益气滴丸能改善抗癌药物所致大鼠的心肌结构损伤和心功能的降低。
[0011]本发明所述应用是芪参益气滴丸能够改善多柔比星所致的大鼠肌肉损伤和心功能障碍。
[0012]本发明所述应用是芪参益气滴丸能够改善多柔比星引起的大鼠心肌的远心性肥大。
[0013]本发明所述应用是芪参益气滴丸能够增加心脏表面血流量。
[0014]本发明所述应用是芪参益气滴丸能够上调过氧化物酶体增殖物激活受体α /过氧化物酶体增殖物激活受体Y辅激活子Ia蛋白水平，抑制AMP激活的蛋白激酶磷酸化。
[0015]本发明所述应用是芪参益气滴丸能够降低游离脂肪酸，增加ATP含量。
[0016]本发明所述芪参益气滴丸，属于现有技术，在市场上可以购买得到。也可按照现有技术制备得到，本发明所述芪参益气滴丸，其中药材各组分的重量百分比如下:
[0017]黄芪22.2%-66.8%，
[0018]丹参11.6%-33.4%，
[0019]三七2.5%-13.5%，
[0020]降香14.5 % -44.3 %。
[0021]优选地，所述组分的含量:黄芪44.7%、丹参26.7%、三七6.3%、降香22.3%。
[0022]或
[0023]黄芪41.2%、丹参 23.8%、三七 4.5%、降香 30.5%0
[0024]本发明的芪参益气滴丸制备方法为:取丹参、三七药材，用水煎煮，滤过，滤液浓缩后用乙醇沉淀，上清液回收乙醇，浓缩成浸膏，即丹参三七浸膏；另取黄芪，水煎煮，滤过，滤液浓缩后用乙醇沉淀，上清液回收乙醇，浓缩成浸膏，即黄芪浸膏；取降香，加水回流提取，收集降香挥发油；将以上丹参三七浸膏，黄芪浸膏，及降香挥发油和滴丸辅料混合均匀后，按照制剂学常规技术，制成滴丸剂。
[0025]本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
[0026]试验例一
[0027]I材料和方法
[0028]1.1 动物
[0029]Sprague-Dawley大鼠,雄性,体重(189 土 12) g,购于北京大学医学部动物中心,合格证号:SCXK(京)2006-0008。动物饲养在温度为22±2°C，湿度为40±5%的条件下，自由饮食、饮水，12h光照/黑暗交替。实验前动物禁食12h，但自由饮水。实验操作规程按欧委会指南(2010/63/EU)、北京大学动物研究委员会指南执行。实验草案获北京大学医学部实验动物伦理委员会批准(LA2011-67)。
[0030]1.2主要试剂
[0031]芪参益气滴丸(QSYQ，批号:110708)由天津天士力制药股份有限公司提供(tianjin, China),规格:每袋0.5g;注射用盐酸多柔比星速溶型(DoxorubicinHydrochloride for Inijection, D0X,批号:9QL0161)购于意大利辉瑞制药有限公司(Latina, Italy),规格:每瓶冻干粉末含盐酸多柔比星IOmg,乳糖50mg,对羟基苯甲酸甲酯Img ;异氟烧购于河北九派制药有限公司(Shijiazhuang, China) ;TEMED和过硫酸铵APS 均购于 Sigma-Aldrich 公司(St Louis, USA) ;ECL 发光液购于 Pierce Biotechnology公司(Rockford, USA);组织裂解液RIPA购于CST公司(Vermont，USA)，蛋白酶抑制剂购自 Merck(Darmstadt, German),蛋白 marker 购于 Fermentas(Burlington, Canada)；全蛋白提取试剂盒购于Bio-Rad公司(California, USA) ；5X蛋白上样缓冲液和脱脂奶粉均购于北京普利莱基因技术有限公司(Beijing，China) ;BCA蛋白定量试剂盒购于Bio-Rad(California,USA);牛血清白蛋白(BSA)购于 Amresco 公司(Pennsylvania,USA)；PVDF 膜购于 millipore 公司(Billerica, USA) ;PBS 粉剂、EDTA 抗原修复缓冲液(50X)、DAB显色试剂盒(20X)均购于北京中杉金桥生物技术有限公司(Beijing，China);大鼠三磷酸腺苷(ATP)、大鼠一磷酸腺苷(AMP)、大鼠游离脂肪酸(FFA)酶联免疫分析ELISA测试盒购于 R&D Systems 公司(Minneapolis, USA) ;PPAR α、PGC-1 α 抗体购于 Abcam 公司(Cambridge, USA) ;AMPK α、p-AMPK a (Thrl72)抗体购于 CST 公司(Vermont，USA)。
[0032]1.3D0X所致大鼠心肌结构和心功能损伤模型建立和实验分组
[0033]取24只SD大鼠，按2.5mg/kg的给药量，隔日腹腔注射D0X，3次/周，连续2周，总剂量为15mg/kg。在DOX`注射6次(第12日)后，用超声心动图检测左室射血分数，将左室射血分数降低10%者列入DOX所致心功能降低大鼠。取符合上述条件的DOX所致心功能降低大鼠14只，按完全随机法分为DOX所致心功能降低+生理盐水组(D0X 4W+NS, η =7)和DOX所致心功能降低+QSYQ治疗组(D0X 4W+QSYQ，n = 7)。DOX 4W+NS组，从第12日起，每日灌胃给予等量的生理盐水lml，连续2周。DOX 4W+QSYQ组，按0.2g/mL的给药量，每日灌胃给予QSYQlml，连续2周。另取部分大鼠，隔日腹腔注射等量生理盐水lml，3次/周，连续2周。从第12日后，停止注射生理盐水，每日灌胃给予生理盐水Iml，连续2周，为正常对照组(Control 4ff, η = 6)。
[0034]1.4大鼠左心室壁厚度和心功能的测定
[0035]在实验开始前、实验2周末、实验4周末，用高频超声诊断仪(Vevo770, VisualSonics, Toronto, Canada), 17.5MHz高频率探头，测定大鼠左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs)、左室舒张期后壁厚度(LVPWd)、左室收缩期后壁厚度(LVPWs)、左室射血分数EF)和左室短轴缩短率FS)。
[0036]1.5心脏表面血流量的测定
[0037]在给予QSYQ治疗2周末，用20% (w/v)乌拉坦，按lml/100g的给药量，行肌肉麻醉，开胸，暴露心脏，将心脏平行放置于激光多普勒血流量图像仪(PeriScan PIM3,Perimed, Stockholm, Sweden)激光探头下，通过 PeriScan PIM 3 系统(Perimed,Stockholm, Sweden)测定大鼠心脏表面血流量。
[0038]1.6大鼠心脏与体重的比值
[0039]在QSYQ 治疗 2 周末，用电子天平(CP64，Sartorius AG, Germany)称体重(BW)。开胸取出心脏，用生理盐水将血洗净，用吸纸吸去水分，用天平(CP64, Sartorius AG,Germany)称取全心质量(HW)。计算大鼠心脏与体重的比(HV//BW)。
[0040]1.7心肌形态学观察
[0041 ] 在QSYQ治疗2周末，取心脏，4 %多聚甲醛固定24h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，伊红-苏木精染色，体示显微镜(SZ-40, Olympus, Tokyo, Japan)下观察大体形态,光学显微镜(Digital Sight DS-5M-U1, Nikon, Tokyo, Japan)下观察心肌形态学的变化。
[0042]1.8心肌组织ATP、AMP、FFA的测定
[0043]在QSYQ治疗2周末，用ELISA法，检测大鼠心肌ATP、AMP、FFA的含量。根据ATP、AMP,FFA 的 ELISA 检测试剂盒说明书操作。ATP 按 150ng/ml，100ng/ml, 50ng/ml, 25ng/ml,
12.5ng/ml 的标准品；AMP 按 900nmol/L，600nmol/L，300nmol/L，150nmol/L, 75nmol/L ；FFA按 480 μ mol/L, 320 μ mol/L, 160 μ mol/L, 80 μ mol/L, 40 μ mol/L ;各取 50 μ I 依次加入一排6孔中，2孔加样品稀释液的作为零孔，剩下孔加已用样品稀释液稀释的样品50μ 1，酶标板加盖，37°C孵育30min，稀释20倍的浓缩洗涤液洗5次，拍干，空白孔除外每孔加入酶标试剂50μ 1，37°C孵育30min，上述洗涤液洗5次，拍干，每孔先加入显色剂A 50 μ 1，再加入显色剂Β50μ 1，轻轻震荡混匀，37°C避光显色15min，每孔加终止液50μ 1，终止反应，用酶标仪(MULTISKAN ΜΚ3，Thermo, USA) 450nm波长依序测量各孔的吸光度(0D值)，根据标准曲线计算ATP、AMP、FFA浓度。
[0044]1.9心肌组织PPAR α、PGC-1 α、AMPK α和ρ-ΑΜΡΚ α蛋白含量的测定
[0045]在QSYQ治疗2周末，麻醉大鼠下，取大鼠心脏，用Western blotting方法检测PPAR α、PGC-1 α、AMPK α和ρ-ΑΜΡΚ α蛋白含量。每IOOmg组织加入Iml蛋白裂解液，冰上匀浆。4°C，13000rpm，离心30min，取上清，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。进行 SDS-PAGE 电泳，用 12 % 分离胶胶检测 GADPH(37kd)、PPARa (42kd)和 AMPKa (62kd)；8%胶检测p-AMPKa (62kd)和PGC-1 a (130kd)，加入5 %浓缩胶。蛋白上样量分别为GADPH (50 μ g)、PPAR a (50 μ g)、AMPK a (50 μ g)、ρ-ΑΜΡΚ a (300 μ g)和 PGC-1 a (300 μ g)，电泳，浓缩胶80V，分离胶120V，待溴酚蓝电泳至胶底时终止电泳。湿法电转移至PVDF膜，220mA转90_120min，将转完的PVDF膜封闭(AMPKa和PPAR α用5%脱脂奶粉，ρ-ΑΜΡΚ α和PGC-1a用3% BSA溶液)，室温振摇封闭I小时。分别加入一抗GADPH I: 3000，AMPK a、PPARal: 1000,PGC-1 a I: 500，pAMPK_al: 200，4°C过夜。TBS-T 洗 3 次，每次 lOmin。用封闭液稀释 HRP 标记的二抗，GADPH、AMPK_a、PPAR_a 为 I: 5000，AMPK-α 和 PGC-1 a为 I: 2000，与膜共同孵育 lh。TBS-T 洗 3 次，每次 lOmin，ECL(Pierce，Rockfor，USA，)曝光，将底片照相，Labfforks软件对图像进行灰度分析。
[0046]1.10统计方法
[0047]所有实验结果以平均值土标准误(mean土SEM)表示,用GraphPad Prism软件分析，作图。组间比较采用单因素方差分析(one-way AN0VA),并用Tukey' s honestly进一步进行组间两两比较。P <0.05为差异有统计学意义。
[0048]2 结果[0049]2.1QSYQ对DOX引起的大鼠左心室壁厚度和心功能降低的改善作用
[0050]图1 是对照 4 周组(Control 4ff) (Al)、DOX 注射 2 周末(DOX 2ff) (A2)、DOX4W+NS (A3)、DOX 4W+QSYQ(A4)组大鼠心脏超声心动图的图像。与Control 4W相比，DOX2ff(A2)大鼠的左室收缩末期内径(LVID)增大、左室后壁厚度(LVPW)显著变薄。DOX 4W+NS没有恢复。QSYQ投予2周后(A4)，左室收缩末期内径(LVD)、左室后壁厚度(LVPW)明显好转，该结果提示QSYQ可以改善由DOX引起的大鼠远心性心肌肥大。
[0051]表1 是 Control 2W、DOX 2W、Control 4W、DOX 4W+NS、D0X4W+QSYQ 组大鼠心脏1^10(1、1^108、1^?胃(1、1^?'^3卩％和卩5%的比较。与 Control 2W 相比，DOX 2W 大鼠 LVIDs显著升高，LVPWcU 1^?胃8 3?%和FS%显著下降。与Control 2W相比，DOX 4W+NS除LVIDs有所恢复外，其余均无明显改变。QSYQ治疗2周后(DOX 4W+QSYQ)，LVIDs, LVPffd, LVPffs,EF^^P FS%显著地恢复。该结果提示QSYQ可以改善由DOX引起的大鼠心功能降低。
[0052]表1 QSYQ对DOX所致大鼠心脏功能的超声心动图数据
[0053]
【权利要求】
1.芪参益气滴丸在对抗抗癌药物的心脏毒性中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于芪参益气滴丸能改善抗癌药物所致大鼠的心肌结构损伤和心功能的降低。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于芪参益气滴丸能够改善多柔比星所致的大鼠心肌损伤和心功能障碍。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于芪参益气滴丸能够改善多柔比星引起的大鼠心肌的远心性肥大。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于芪参益气滴丸能够增加心脏表面血流量。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于芪参益气滴丸能够上调过氧化物酶体增殖物激活受体α /过氧化物酶体增殖物激活受体Υ辅激活子Ia蛋白水平。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于芪参益气滴丸能够降低游离脂肪酸，增加ATP含量。
8.根据权利要求1所述应用，其特征在于所述芪参益气滴丸由以下重量配比的中药原料药制备而成
黄芪 22.2% -66.8%,
丹参 11.6% -33.4%,
三七 2.5% -13.5%,
降香 14.5% -44.3%0
9.根据 权利要求1所述应用，其特征在于所述芪参益气滴丸由以下重量配比的中药原料药制备而成，黄芪41.2%、丹参23.8%、三七4.5%、降香30.5% ;芪参益气滴丸制备方法为:取丹参、三七药材，用水煎煮，滤过，滤液浓缩后用乙醇沉淀,上清液回收乙醇,浓缩成浸膏，即丹参三七浸膏；另取黄芪，水煎煮，滤过，滤液浓缩后用乙醇沉淀，上清液回收乙醇，浓缩成浸膏，即黄芪浸膏；取降香，加水回流提取，收集降香挥发油；将以上丹参三七浸膏，黄芪浸膏，及降香挥发油和滴丸辅料混合均匀后，按照制剂学常规技术，制成滴丸剂。
【文档编号】A61P9/00GK103520270SQ201210224083
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2012年7月2日 优先权日:2012年7月2日
【发明者】韩晶岩, 唐东昕, 李萍萍, 赵海萍, 潘春水, 刘育英, 杨晓媛, 陈媛媛, 王传社 申请人:天士力制药集团股份有限公司