靶向作为vegfr-2共受体cd146的新功能在抗肿瘤血管新生治疗中的应用的制作方法
【专利摘要】靶向作为VEGFR-2共受体CD146的新功能在抗肿瘤血管新生治疗中的应用。本发明首次提出细胞黏附分子CD146是VEGFR-2的共受体，抗CD146抗体与抗VEGF抗体联合应用于抑制肿瘤血管生成可能成为临床治疗癌症的新策略。与常规治疗肿瘤的靶向单一分子的抗体药物相比，靶向两种不同分子的抗体联合能够更有效地抑制肿瘤生长。CD146作为VEGFR-2的共受体能够辅助其更有效地传递VEGF介导的下游信号进而发挥促进血管生成功能。抗CD146抗体与抗VEGF抗体联合治疗肿瘤的作用机理主要是两种抗体联合能够共同抑制VEGF-VEGFR-2信号通路的活化、内皮细胞的迁移及血管生成等功能，进而更加有效的抑制肿瘤生长(如胰腺癌等)。这两种抗体联合应用或与其他临床治疗手段相配合(如临床放化疗)都将成为抑制肿瘤血管新生的新策路，同时可用于肿瘤血管新生机理等基础研究。
【专利说明】靶向作为VEGFR-2共受体CD146的新功能在抗肿瘤血管新生治疗中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于治疗肿瘤的组合物。具体地，本发明涉及抗⑶146抗体与抗VEGF抗体的组合物，其可用于治疗肿瘤。更具体地，本发明涉及的抗CD146的单克隆抗体AA98或其功能片段与抗VEGF的单克隆抗体贝伐单抗或其功能片段的组合物能够共同抑制VEGF-VEGFR-2信号通路的活化及其引起的内皮细胞的迁移及血管生成等功能，从而更加有效地抑制肿瘤生长，更具体地抑制胰腺肿瘤。
【背景技术】
[0002]癌症是当前危害人类生命健康的头号杀手。我国每年恶性肿瘤的发病人数约260万。死于癌症者占死亡总人数的20%以上，居城市居民死亡原因的第一位(根据2005年统计资料)。
[0003]目前，在肿瘤三大常规〈放疗，化疗和手术> 治疗中，药物治疗是一个重要方面。目前影响肿瘤药物治疗效果的因素是多方面的，包括药物的特异性、运输方式、渗透性以及诱发肿瘤耐药性。其中药物的特异性和耐药性是肿瘤治疗学急需解决的关键问题。抗肿瘤血管治疗以其肿瘤特异性、广谱性、无或低耐药性等优势已成为肿瘤治疗中的一种重要手段。其理论依据主要是上世纪七十年代Folkman提出的血管生成的概念，即新生血管为肿瘤提供营养和氧供应，进而促进肿瘤的生长及转移。
[0004]大量研究发现，与肿瘤血管生成向关的因子已有30余种，如血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF),转化生长因子(transforming growthfactor-, TNF),成纤维细 胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF),肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF),促血管生成素(angiopoietins)等。其中，VEGF 被证实是最主要的直接作用于血管生 成 的高度特异性的生长因子。肿瘤细胞能合成并周期性分泌VEGF所分泌的VEGF与血管内皮细胞上的VEGF受体(VEGFRs)相结合，从而促进肿瘤血管生成。VEGF促血管生成的信号转导主要通过其与VEGFR-2的结合来实现的。目前上市的抗血管生成药物大多都是以这些信号转导通路中的关键信号分子作为药物靶点而设计的，如抗VEGF的单克隆抗体贝伐单抗(Bevacizumab, Roche公司),抗VEGFR-2的单克隆抗体DC101等。与此同时，研究发现VEGFR-2存在共受体，例如⑶44，它能够与VEGFR-2相互作用，作为其共受体调节VEGFR-2介导的血管生成过程。因此，靶向此类共受体也能够有效地抑制肿瘤的血管生成进而抑制肿瘤生长。
[0005]与此同时，靶向肿瘤血管的抗体免疫治疗中仍存在一些问题及瓶颈，如抗体治疗往往不能彻底杀死全部肿瘤细胞，剩余细胞容易在停药后复发。并且，单一靶点的抗体治疗具有局限性，不能够达到有效地治疗效果。因此寻找新的治疗靶标并且发现更有效的治疗策略是亟待解决的问题。
【发明内容】
[0006]本发明首次提出⑶146是VEGFR-2的共受体，抗⑶146的单克隆抗体AA98与抗VEGF的单克隆抗体贝伐单抗(Bevacizumab, Roche公司)的组合物可以作为治疗肿瘤的
新型靶向药物。在动物肿瘤模型中(如人胰腺癌)，与单--种抗体药物治疗肿瘤相比较，
AA98与贝伐单抗的组合物可以更加有效地抑制肿瘤血管生成进而抑制肿瘤生长。
[0007]抗CD146抗体AA98与贝伐单抗抗体联合在抗肿瘤治疗中的应用是基于以下重要的科学发现:⑴⑶146与VEGFR-2相互作用，是VEGFR-2的共受体；⑵抗⑶146单克隆抗体AA98能够阻断CD146与VEGFR-2之间的相互作用，进而阻断VEGF刺激引起的VEGFR-2的活化及下游信号(Akt和p38/NF- K B)的激活；(3)抗CD146单克隆抗体AA98抑制由VEGF诱导的内皮细胞的迁移及血管生成；(4)裸鼠荷瘤模型中(人胰腺癌细胞系SW1990)，AA98与贝伐单抗联合用药更有效地抑制肿瘤血管生成进而抑制肿瘤生长。
[0008]综上所述，CD146作为VEGFR-2的共受体能够调节并辅助VEGF-VEGFR-2信号的传递，进而影响内皮细胞的迁移及血管生成。相对于AA98或贝伐单抗单独用药，我们自主研制的抗CD146功能性抗体AA98与贝伐单抗联合用药在裸鼠荷瘤模型中能够更加显著地抑制肿瘤血管生成进而抑制肿瘤生长。因此，我们提出靶向作为VEGFR-2的共受体⑶146能够更加有效地抑制肿瘤生长，抗CD146的单克隆抗体AA98与贝伐单抗的药物组合物是治疗肿瘤的新型靶向药物。AA98可以通过抑制VEGFR-2与⑶146之间的相互作用，抑制VEGF引起的信号通路的激活，进而阻断血管生成，切断肿瘤的养分供应，从而抑制肿瘤生长。AA98与贝伐单抗联合能够更加有效地切断决定肿瘤生长的信号通路的活化，更加显著的抑制肿瘤的生长。
[0009]具体地，本发明提供以下各项:
[0010]1.一种包含抗⑶146抗体或所述抗CD146抗体的功能片段和抗VEGF抗体或所述抗VEGF抗体的功能片段的组合物，所述组合物用于抑制肿瘤血管新生，从而抑制肿瘤生长。
[0011]2.根据第1项所述的组合物，其中所述肿瘤是胰腺肿瘤。
[0012]3.根据第1项或第2项所述的组合物，其中所述抗CD146抗体是抗CD146单克隆抗体AA98,而所述抗VEGF抗体是贝伐单抗。
[0013]4.根据第1项所述的组合物在制备用于抑制肿瘤生长的药物中的用途。
[0014]5.根据第4项所述的用途，其中所述肿瘤是胰腺肿瘤。
[0015]6.根据第4项或第5项所述的用途，其中所述抗CD146抗体是抗CD146单克隆抗体AA98,而所述抗VEGF抗体是贝伐单抗。
[0016]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中:
[0018]图1?CD146与VEGFR-2在分子水平相互作用。A，人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中，免疫共沉淀方法发现⑶146与VEGFR-2相互作用；B，HEK293T中，免疫共沉淀方法验证CD146与VEGFR-2之间的相互作用；C，体外pull-down实验发现CD146的胞外区与VEGFR-2胞外区存在直接相互作用；
[0019]图2.抗CD146单克隆抗体AA98通过阻断⑶146与VEGFR-2之间的相互作用(A)，阻断VEGF诱导的VEGFR-2信号通路的活化(B-F)；
[0020]图3.在体外水平，AA98抑制VEGF诱导的内皮细胞迁移(A)及血管生成(B)；
[0021]图4.荷瘤小鼠模型中，与AA98或贝伐单抗单独给药组比较，AA98与贝伐单抗联合用药能够更加有效地抑制肿瘤生长。(A)不同给药组肿瘤大小示意图；(B)相比较于AA98或贝伐单抗单独给药，AA98与贝伐单抗联合给药能够更加有效地抑制肿瘤的大小；(C)相比较于AA98或贝伐单抗单独给药，AA98与贝伐单抗联合给药能够更加有效地抑制肿瘤的重量；(D)相比较于AA98或贝伐单抗单独给药，AA98与贝伐单抗联合给药能够更加有效地抑制肿瘤血管生成。
【具体实施方式】
[0022]本说明书中使用的抗体AA98(Yan, X 等 A novel ant1-CD146monoc1nalantibody, AA98, inhibits angiogenesis and tumor growth.Blood.2003 ； 102 (I):184-191.)、AAl (本实验室自主生产，保藏机构:中国普通微生物保藏中心；保藏号=CGMCCN0.2310 ;保藏日期:2007.12.28)等可分别根据中国专利申请号99107586.2 (CN1234405)、中国专利申请号200810057260.7 (CN101245101)的描述获得。贝伐单抗(Bevacizumab)购自Roche公司。
[0023]实施例一:细胞水平，CD146与VEGFR-2相互作用；
[0024]⑶146与VEGFR-2两者均是内皮细胞的标志物，并且是血管生成过程中起关键作用的分子，但是两者的联系并不清楚。为了研究两者之间的关系，我们在细胞水平，利用免疫共沉淀等方法证实，⑶146与VEGFR-2存在相互作用。抗⑶146单克隆抗体AA98能够阻断CD146与VEGFR-2之间的相互作用。
[0025]主要材料:人脐静脉内皮细胞系(HUVECs) (ATCC，CRL-1730)，稳定转染CD146cDNA的 HEK293T 细胞系(ATCC，CRL-11268) (HEK293T/CD146)等。
[0026]主要试剂:细胞裂解液，PBS，鼠源抗⑶146单克隆抗体AAl (本实验室自主生产。保藏机构:中国普通微生物保藏中心；保藏号=CGMCC N0.2310 ;保藏日期:2007.12.28)，兔抗 VEGFR-2 抗体(购自 Cell Signaling Technology 公司，货号 #2479)，His_sCD146 蛋白(购自 Sino Biological Inc.，货号50794-M08H)，Fc_VEGFR_2蛋白(购自 Sino BiologicalInc.，货号 10012-H02H), Fe 蛋白(购自 Sino Biological Inc.，货号 10702-HNAH)，VEGF蛋白(购自 Upstate Biotechnology 公司，货号 B500014)。
[0027]主要方法:免疫共沉淀及体外pull-down实验，具体方法如下:
[0028]免疫共沉淀:
[0029]I)将IXlOVml的人脐静脉内皮细胞或经过瞬时转染VEGFR-2质粒(10 y g) (LenaClaesson-Welsh et al.EMBO J.2005 July 6 ；24(13):2342-2353.)的 HEK293T/CD146 接种于IOOmm培养皿中，当细胞密度达到90%后将细胞轻轻刮下，4°C离心5分钟离心收集于Ep管中。
[0030]2)力卩入 600 ii I 裂解液 RIPA Buffer (50mM Tris-HCl, pH 7.4，I % NP-40，0.25 % Na-deoxycholate,150mM NaCl,ImM EDTA，ImM Na3V04,ImM NaF，ImM PMSF和 ImM proteinase inhibitors cocktails (蛋白酶抑制剂，购自 Roche 公司，货号04693116001))，冰上裂解 30 分钟，4°C离心(12，000g) 15 分钟。[0031]3)吸取上清为细胞裂解液，经Bradford法测定蛋白浓度之后，将总蛋白浓度稀释至 lmg/ml0
[0032]4)在裂解液中加入20 ii I protein G_Agarose，4°C孵育I小时，去除与20 ii Iprotein G-Agarose非特异结合的蛋白质。
[0033]5)离心取上清，加入2 ii g的CD146单克隆抗体AAl或兔抗VEGFR-2抗体，4°C孵育2小时。
[0034]6)再次加入 50 U I protein G-Agarose, 4°C孵育 I 小时。
[0035]7)离心弃上清,沉淀的agarose beads用含蛋白酶抑制剂的PBS洗3次,每次5分钟后加入上样缓冲液100 U I涡旋2分钟，100°C煮10分钟，离心取上清。
[0036]8)处理好的蛋白样品及全细胞裂解液留样一起用于Western blot检测。
[0037]体外pull-down 实验:
[0038]I)将 Fc-VEGFR-2 蛋白 200ng 或 Fe 蛋白 200ng 与 His_CD146 蛋白 200ng —起融于500 u I PBS的EP管中，4°C孵育I小时。
[0039]2)加入 20 U I protein G beads, 4°C孵育 I 小时。
[0040]3) 4°C离心5分钟,弃上清,沉淀的agarose beads用含蛋白酶抑制剂的PBS洗3次，每次5分钟后，加入上样缓冲液50 u I涡旋2分钟，100°C煮10分钟。
[0041]4)处理好的蛋白样品用于Western blot检测。
[0042]结果如图1显示，在HUVECs (A)中，用抗⑶146抗体AAl捕获⑶146的同时可以结合VEGFR-2，反之亦然，说明CD146与VEGFR-2存在相互作用。在HEK293T/CD146 (B)中，转染VEGFR-2的细胞中，兔抗VEGFR-2的抗体可以同时捕获VEGFR-2与CD146，但在只表达⑶146的细胞中，Western blot的结果中检测不到⑶146，此结果验证了 A的结论，即⑶146与VEGFR-2存在相互作用。在体外pull-down实验中，如(C)所示，CD 146与VEGFR-2之间存在直接相互作用。另外，利用抗CD146单克隆抗体AA98或AAl(100iig/ml)分别孵育HUVECs, 370C I小时后，用细胞培养基清洗三遍，将以上经过处理的细胞用于免疫共沉淀实验，如(D)所示，在HUVECs中，抗CD146单克隆抗体AA98能够阻断内源的CD146与VEGFR-2之间的相互作用。以上结果说明内皮细胞中⑶146与VEGFR-2直接相互作用，抗⑶146单克隆抗体AA98能够阻断两者之间的相互作用。
[0043]实施例二:抗CD146抗体通过阻断CD146与VEGFR-2之间的相互作用，阻断VEGF刺激引起的VEGFR-2信号通路的活化；
[0044]粘附分子⑶146在血管生成过程中具有关键作用。作为VEGFR-2的共受体，⑶146调节VEGFR-2信号通路。抗CD146单克隆抗体AA98能够阻断CD146与VEGFR-2之间的相互作用，进而阻断VEGF刺激引起的VEGFR-2信号通路的活化。
[0045]利用抗CD146单克隆抗体AA98或AAl (100 u g/ml)分别孵育HUVECs，37°C I小时后，用细胞培养基清洗三遍后，再用VEGF(50ng/ml)刺激后裂解细胞用于生化分析信号通路。如图2(A)所示，在HUVECs中，AA98能够阻断内源的⑶146与VEGFR-2之间的相互作用。如(B-F)所示，VEGF刺激(5分钟)能够引起VEGFR-2的磷酸化，以及下游信号分子，如Akt (15分钟)，p38(15分钟)，NF-kB(10小时)的活化。AA98能够阻断由VEGF刺激引起的VEGFR-2及下游分子Akt，p38，NF-kB的活化。说明CD146能够参与并调节VEGF-VEGFR-2信号通路活化。[0046]实施例三:抗⑶146抗体抑制VEGF刺激引起的内皮细胞的迁移及血管生成能力；
[0047]血管生成主要为肿瘤提供养分，并为肿瘤细胞转移的提供途径，因此对于肿瘤的生长起到至关重要的作用。抑制血管生成就能够很大程度的抑制肿瘤的生长。VEGF是肿瘤细胞分泌的主要细胞因子，其介导的信号通路最终决定肿瘤血管生成。CD146参与并调节VEGF-VEGFR-2信号通路，抗⑶146的抗体抑制VEGF刺激引起的内皮细胞的迁移及血管生成。
[0048]主要材料:人脐静脉内皮细胞系，96孔Transwell板(Corning HTS Transwell-96Cell Migration Products)等。
[0049]主要试剂:VEGF(购自Upstate Biotechnology 公司，货号 B500014),抗 CD146 抗体 AA98、AAl,鼠 IgG (mlgG,购自 Sigma-Aldrich 公司，货号 15381)，Matrigel (不含生长因子，BD Biosciences，货号 354234)。
[0050]主要方法:细胞迁移实验，内皮细胞成血管实验。具体方法如下:
[0051]细胞迁移实验:
[0052]l)HUVECs细胞以完全培养基重悬，制成单细胞悬液(lX105/ml)。
[0053]2) Transwell下室加入含10 %胎牛血清的RPM1-1640培养基(购自Gibco，货号31800-022) (200 yl/孔)，上室加入细胞悬液(100 U I/孔，每种处理设三个平行孔)，
[0054]3)向上室的细胞中加入抗体AA98或AAl (IOOii g/ml)与刺激剂VEGF (100ng/ml)。在37°C二氧化碳培养箱中孵育过夜。
[0055]4)将膜上层的细胞用棉签擦掉，用镊子将96孔transwell板的膜揭下，膜下层朝上放于载玻片上。
[0056]5)下层细胞以4%多聚甲醛室温固定15分钟后，用1%结晶紫染色15分钟，镜检记录每个视野下的细胞数量。
[0057]内皮细胞成血管实验是在Nagata等人建立的实验方法的基础上改进而来，具体操作如下:
[0058]l)HUVECs细胞以完全培养基重悬，制成单细胞悬液(lX105/ml)。
[0059]2)在96孔板中包被冰浴的Matrigel (50 yl/孔)，37°C固化30分钟。
[0060]3)向每个孔中加入100 U I细胞悬液，同时相应地加入刺激剂VEGF(100ng/ml)及抗体 AA98 或 AAl (100 u g/ml)。
[0061]4) 37°C培养箱中孵育过夜，之后在倒置显微镜下观察，拍照。
[0062]实验结果如图3(A)所示，VEGF能够增加内皮细胞的迁移能力及，与AAl对照组相比，抗CD146抗体AA98能明显降低VEGF刺激所引起的内皮细胞的迁移力，抑制率约为53%。同样的，用VEGF刺激HUVECs可以促进HUVECs形成血管样结构。然而，相对于AAl处理组，AA98明显地抑制VEGF刺激所引起的内皮细胞的血管生成能力。以上结果证实，⑶146对于VEGFR-2所介导的血管生成过程是必须的。
[0063]实施例四:在裸鼠荷瘤模型中，与单独的AA98或贝伐单抗相比较，AA98与贝伐单抗的组合物能够更加显著地抑制人胰腺癌肿瘤血管生成进而抑制肿瘤生长。
[0064]在肿瘤的发生发展过程中，血管生成为肿瘤提供养分，并为肿瘤细胞转移的提供途径。目前靶向肿瘤血管生成已经成为临床上治疗肿瘤的主要策略之一。动物实验证实，AA98与贝伐单抗联合用药能够更加有效地抑制肿瘤生长。[0065]实验方法:选择60只4周大小雌性的BalB/C裸鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，随机分为6组以分别給予不同的抗体进行治疗，每组10只。分别在背部皮下注射I X IO7个人胰腺癌细胞系SW1990细胞(ATCC，CRL-2172)(重悬在100 u I PBS中)。待肿瘤体积达到0.06cm3,开始腹腔注射抗体,分别为mIgG(购自Sigma-Aldrich公司，货号 15381 ;200iig/只)，hIgG(购自中杉金桥，货号 ZDR-5001 ;200iig/只)，AAl (200 u g/只)，AA98 (200 u g/只)，贝伐单抗(购自Roche公司；200 u g/只)，AA98+贝伐单抗(AA98和贝伐单抗分别200 u g/只，共计400 u g/只)，每周2次，测量肿瘤的长、宽，以便计算肿瘤体积。4周后脱颈法处死所有小鼠,剥离肿瘤。将肿瘤称重后，用4% PFA固定24小时,石蜡包埋，切片，免疫组化分析。以下为石蜡切片的免疫组化过程:
[0066]I)取出片子，入二甲苯溶液37°C脱蜡两次，每次30分钟；
[0067]2)入无水乙醇X2-95% -80% -70% -50% _30%和蒸馏水中水化，室温每次5分钟；
[0068]3) 0.3%过氧化氢/甲醇溶液37°C避光处理30分钟，消除内源性过氧化物酶的活性，PBS洗三次；
[0069]4)pH6.0柠檬酸修复液100°C水浴30分钟抗原热修复，自然冷却；
[0070]5) 5%的正常羊血清(购自中杉金桥公司，货号ZLI_9021)37°C封闭I小时；
[0071]6)加入PBS稀释的一抗(兔抗CD31多抗，购自Abcam公司，货号ab28364 ;1: 50稀释)，4°C孵育过夜；
[0072]7)PBS洗三次；山羊抗-兔-生物素(购自中杉金桥公司，货号ZB-2010 ;1: 1000稀释)在37°C孵育I小时，PBS洗三次；
[0073]8)亲和素-HRP(购自 Hyclone-pierce 公司，货号 NlOO ;1: 1000)在 37°C孵育 45分钟；
[0074]9)现配的DAB(购自中杉金桥公司，货号ZL1-9032 ;1: 1000稀释)避光显色2_7
分钟，苏木素复染。
[0075]10)逐级脱水:50-70-80-90-100-100%乙醇-二甲苯，晾干，中性树脂封片。
[0076]11)显微成像系统中拍片。
[0077]结果显示，如图4所示，AA98与贝伐单抗组合物实验组中，组合物对于肿瘤生长的抑制效果更明显。与对照组(mlgG或hlgG组)相比较，组合物对于肿瘤体积的抑制百分比为70 %，而单独的AA98或贝伐单抗的抑制率只有46 %或48 %。经过AA98与贝伐单抗的组合物处理的肿瘤的血管密度更少，分别为AA98或贝伐单抗单独用药组的血管密度的40%或30%。以上结果说明，AA98与贝伐单抗的组合物能够更有效地抑制肿瘤血管生成进而抑制肿瘤生长。
【权利要求】
1.一种包含抗CD146抗体或所述抗CD146抗体的功能片段和抗VEGF抗体或所述抗VEGF抗体的功能片段的组合物，所述组合物用于抑制肿瘤血管新生，从而抑制肿瘤生长。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肿瘤是胰腺肿瘤。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述抗CD146抗体是抗CD146单克隆抗体AA98,而所述抗VEGF抗体是贝伐单抗。
4.根据权利要求1所述的组合物在制备用于抑制肿瘤生长的药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述肿瘤是胰腺肿瘤。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的用途，其中所述抗CD146抗体是抗CD146单克隆抗体AA98,而所述抗VEGF抗体是贝伐单抗。
【文档编号】A61K39/395GK103505727SQ201210223311
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月28日 优先权日:2012年6月28日
【发明者】阎锡蕴, 姜天霞, 罗永挺, 段红霞, 卢迪, 杨东玲, 冯静 申请人:中国科学院生物物理研究所