一种功能性近红外荧光纳米微粒及其制备与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种近红外荧光纳米微粒（Near-infrared?Fluorescence?Nanoparticles）的制备及其在成像技术中的应用方法。近红外荧光纳米粒以所装载的近红外荧光染料作为发光中心，以壳聚糖、聚赖氨酸为基本骨架，经海藻酸钠自组装包裹成壳制备而成。透射电子显微镜显示近红外荧光纳米粒的平均粒径在15nm左右，动态光散射测试表明其平均动态水合半径为~160nm。近红外荧光纳米粒的光稳定性较荧光染料分子有显著增强，在0~1.5%的NaCl水溶液中可以稳定存在。
【专利说明】一种功能性近红外荧光纳米微粒及其制备与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及纳米近红外荧光材料，具体地说是一种功能性纳米近红外荧光微粒及其制备和应用。
【背景技术】
[0002]纳米尺度上的生物分析化学是纳米生物技术的最主要发展方向。在纳米生物技术中，基于近红外荧光纳米探针的活体荧光成像技术是当今国际生物分析科学领域的研究前沿和重要发展方向之一，也是各国的研究热点。功能性纳米荧光材料是近年来纳米材料研究中的一个新生长点，其应用焦点目前主要集中在生物【技术领域】如生物活体成像检测，生物大分子原位示踪、荧光显微镜检测、免疫组织化学、细胞化学等。现在已报道的荧光活体成像技术及其存在的问题包括如下几个方面:
[0003](I)近红外突光染料体内成像技术(文献1C.，Jonak, H., Skvara, R., Kunst feld，et al.1ntradermal indocyanine green for in vivo fluorescence laser scanning microscopy of human skin:a pilot study.Plos One，2011，6，e23972.文献 2L.A.Yannuzz1.1ndocyanine green angiography:a perspective on use in the clinical setting.Am.J.0phthalmol.2011，151，745)。以口引哚菁绿(ICG)为代表的近红外染料，人体毒性低，可直接应用于活体成像，如体内血管造影，注射式皮肤造影等。但吲哚菁绿体内代谢速度快，光稳定性低，使其应用受到限制。
[0004](2)荧光量子 点应用于成像技术(文献3H.S.Choi, B.1.1pej P.Misra, et al.Tissue—and organ-selective biodistribution of nir fluorescent quantum dots.Nano Lett.2009，9，2354.文献 4Y.Wang, P.Anilkumar，L Caoj et al.Carbon dots of different composition and surface functionalization:cytotoxicity issues relevant to fuorescence cell imaging.Exp.Bi0.Med.2011，236，1231) ?焚光量子点可以分为两类:一类是以CdSe，ZnS等无机材料形成的量子点，光学性质稳定，荧光量子产率高， 但存在重金属毒性问题，活体成像应用受限；另一类是以有机质为原料制成的碳点，生物相容性优于无机量子点，同时拥有独特的光学性质，但焚光量子产率较弱，发射光波段位于短波长可见光，不适合活体成像。
[0005](3)纳米载体装载焚光物质成像技术(文献5E.1.Altinogluj T.J.Russin, J.M.Kaiser,et al.Near-1nfrared emitting fluorophore—doped calcium phosphate nanoparticles for in vivo imaging of human breast cancer.ACS Nano, 2008, 2, 2075.文献 6M.Nykj R.Kumar, T.Y.0hulchanskyy, et al.High contrast in vitro and in vivo photoluminescence bioimaging using near infrared to near infrared up-conversion in Tm3+and Yb3+doped fluoride nanophosphors.Nano Lett.2008，8，3834。以装载焚光物质的类型分为两类:一类装载量子点成像，另一类装载荧光染料。两种方法都是通过载体的保护提高染料的荧光稳定性，延长体内成像时间，并通过载体赋予其靶向。与染料直接成像方法相比应用范围更广，目前应用主要集中在实验室的动物活体实验阶段。[0006]吲哚菁绿是一种近红外荧光三碳菁染料，它的吸收和发射峰的最大值均位于组织的“最佳窗口”内，近红外光的组织穿透性比蓝绿光要强很多，大大地降低了人体中血红蛋白等的吸收干扰，已通过美国FDA批准应用于临床的肝脏损伤诊断和眼底血管造影检测， 成为观测生理指标的最佳选择之一。然而吲哚菁绿分子本身荧光强度低，光稳定性弱，无活性基团不易进行分子标记，用于体内成像时靶向性差。如果能够通过使用纳米载体包裹吲哚菁绿，既可以增强其荧光稳定性，延缓体内成像时间，也可以发挥纳米颗粒的增强渗透效应(EPR)引起的被动靶向作用，从而改善和提高吲哚菁绿的体内成像质量，为发展新的体内光学成像探针提供新的途径。
【发明内容】
[0007]为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种以吲哚菁绿近红外荧光染料作为发光中心，以壳聚糖、聚赖氨酸等为基本骨架，经海藻酸钠自组装包裹成壳的纳米荧光微粒。 所得到的近红外荧光纳米微粒具有荧光稳定性高，体内成像时间长，同时又具备良好生物相容性等特点。
[0008]为了实现上述目的，本发明的技术方案如下:
[0009]功能性纳米近红外荧光微粒以近红外染料平面共轭结构为发光中心，采用静电结合成粒技术制备而成，并且纳米球表面具有化学结合能力的功能官能团。
[0010]具体为:以聚阴离子作为交联剂，与装载有阴离子近红外染料壳聚糖材料形成纳米粒内核，再经海藻酸钠等交联形成稳定的外壳结构，其所结合方式如下:
[0011]
【权利要求】
1.一种功能性近红外荧光纳米微粒，其特征在于:于液相中，以吲哚菁绿(ICG)为发光中心，采用壳聚糖(CA)、聚赖氨酸(PLL)中的一种或二种以上聚合物，经过静电自组装后， 再引入海藻酸钠(ALG)，经过二次静电自组装方法获得具有近红外发光功能的纳米颗粒。
2.按照权利要求1所述的功能性近红外荧光纳米微粒，其特征在于:其制备过程如下:将近红外荧光染料吲哚菁绿溶于0.05-0.2M的HAc/NaAc缓冲溶液中(pH 4飞)，制成 0.8~3mg/mL的ICG溶液；经过0.22 u m过滤膜处理；同时将分子量为5~800kDa的壳聚糖，溶于0.05~0.2M的HAc/NaAc缓冲溶液中(pH 4、),制成1.(Tl2mg/mL的壳聚糖溶液,经过0.22 y m过滤膜处理,在磁力搅拌状态下,通过进液泵将25~100 ii L的ICG溶液滴入2~5mL壳聚糖溶液，制得ICG-CA静电结合溶液； 将多聚磷酸钠(STPP)加入到HAc/NaAc缓冲溶液中，配置6~12mg/mL的STPP溶液，并经0.22 ii m过滤膜处理；在磁力搅拌状态下，通过进液泵将10(T350 y L的STPP溶液滴入 ICG-CA静电结合溶液，制得ICG-CA-STPP纳米粒溶液；然后将海藻酸钠加入到HAc/NaAc缓冲溶液中，配置5~20mg/mL的ALG溶液，并经 0.22um过滤膜处理；使用I~2.5M的NaOH溶液调整ICG-CA-STPP纳米粒溶液的pH至pH 4-5 ;在磁力搅拌下，通过进液泵将l(T300ii L的海藻酸钠溶液滴入ICG-CA-STPP纳米粒溶液中，制得海藻酸钠包裹的ICG-CA-STPP纳米粒溶液。
3.根据权利要求1或2所述的功能性近红外荧光纳米微粒，其特征在于:微粒纳米表面具有可用于化学修饰或标记的活性功能团。
4.一种权利要求1所述的功能性近红外荧光纳米微粒的制备方法，其特征在于:将近红外荧光染料吲哚菁绿溶于0.05、.2M的HAc/NaAc缓冲溶液中(pH 4飞)，制成0.8~3mg/mL的ICG溶液；经过0.22 u m过滤膜处理；同时将分子量为5~800kDa的壳聚糖，溶于0.05~0.2M的HAc/NaAc缓冲溶液中(pH4、),制成1.(Tl2mg/mL的壳聚糖溶液,经过0.22 y m过滤膜处理,在磁力搅拌状态下,通过进液泵将25~100 ii L的ICG溶液滴入2~5mL壳聚糖溶液，制得ICG-CA静电结合溶液；将多聚磷酸钠加入到HAc/NaAc缓冲溶液中，配置6~12mg/mL的STPP溶液，并经 0.22iim过滤膜处理；在磁力搅拌状态下，通过进液泵将10(T350iiL的STPP溶液滴入 ICG-CA静电结合溶液，制得ICG-CA-STPP纳米粒溶液；然后将海藻酸钠加入到HAc/NaAc缓冲溶液中，配置5~20mg/mL的ALG溶液，并经0.22 um水系膜过膜处理；使用1~2.5M的NaOH溶液调整ICG-CA-STPP纳米粒溶液的pH至 pH 4~5 ;在磁力搅拌下，通过进液泵将10~300 ii L的ALG溶液滴入ICG-CA-STPP纳米粒溶液中，制得海藻酸钠包裹的ICG-CA-STPP纳米粒溶液。
5.一种权利要求1-4任一项所述的功能性近红外荧光纳米微粒在生物分子标记中的应用，其特征在于:所述生物分子包括多肽、抗体、抗原、蛋白、核酸等分子中的一种或二种以上。
6.一种权利要求1-4任一项所述的功能性近红外荧光纳米微粒在生物体内活体荧光成像中的应用。
7.一种权利要求1-4任一项所述的功能性近红外荧光纳米微粒在药物分子标记中的应用。
【文档编号】A61K49/00GK103509552SQ201210222884
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月29日 优先权日:2012年6月29日
【发明者】马小军, 谭明乾, 吴昊 申请人:中国科学院大连化学物理研究所