含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球的制备及其在超声-磁共振图像配准融合导航中的应用的制作方法

本发明涉及一种纳米生物材料及其制备，尤其涉及一种含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球及其制备和应用。

背景技术：

临床术前诊断前列腺癌的金标准是经直肠超声(trus)引导的前列腺穿刺活检术及病理诊断。但是超声引导的前列腺穿刺活检术检出前列腺癌的假阴性率及并发症发生率很高另外超声成像分辨力较低，易造成漏诊或误诊。靶向前列腺活检是一种新兴技术，利用高分辨率多参数磁共振图像可检出更多有效的可疑前列腺病灶，提供更为准确的穿刺靶点信息。近年来，mri/trus图像融合靶向活检已成为前列腺穿刺活检的主流方式。

mri/trus图像融合穿刺技术理论上是将提前获取并预存在系统中的患者前列腺mri图像通过相关软件或专家在认知或视觉上与实时trus图像配准融合，操作者可依据融合图像中mri提供的目标信息进行trus实时引导完成目标穿刺活检。实现不同模态图像融合的先决条件和关键是图像配准技术，图像配准精度的高低直接决定图像融合结果的质量，而用于配准的标记物选择又是图像配准成功与否的重要前提。

目前临床上广泛应用前列腺的边缘点、轮廓及解剖结构作为标记点进行配准，如前列腺内的钙化、尿道内口、前列腺的边缘轮廓以及前列腺内相关病灶等。虽然此类方法简便、无创，但是前列腺是易于变形的器官，不仅前列腺切除术前后腺体会变形。另外，如患者体位、直肠超声探头和mri直肠线圈的内径不一致、不同充盈程度的膀胱以及介入过程中活检针的插入所形成的压力都会使前列腺产生不同程度的位移和形变，此时依赖前列腺几何形态及局部点、线、面、表明轮廓特征等进行配准的方法误差就很大，进而影响配准准确性。软件辅助的mri/trus融合平台可利用电磁跟踪定位系统、智能机械臂中的位置编码器和软件跟踪系统应用弹性配准或刚性配准方法进行图像配准融合，虽可最大程度地减少由于操作者对解剖结构及病变位置的错误判断而可能导致的配准错误，但是在图像配准融合过程中仍需要标记物在起始点层面配准，起始点层面配准所需的标记物同样存在上述和所述的不足之处。

纳米医学是通过应用各类纳米探针达到检测和治疗疾病的目的，其出现为临床医学，分子影像学及医学检测技术等医学领域带来了革命性的进步，近年来纳米医学在手术定位及导航方面发展迅猛。介孔二氧化硅是已获得fda临床试验批准的刚性纳米材料，具有包括大孔体积，高表面积，可调节孔径，可功能化，可生物降解以及良好的生物相容性等优点，已作为药物递送平台被广泛应用，但是大多数的纳米探针仍处于临床前或基础研究阶段。海藻酸钠是一种天然的阴离子聚合物，具有无毒性、生物可降解性等特点，且可与阳离子形成离子交联凝胶，以海藻酸钠为药物载体的研究屡见不鲜，但是利用其成胶性在体内塑形定位应用于前列腺mri/us图像配准融合穿刺导航技术的研究还未见报道。

技术实现要素：

针对现有技术，本发明提出的一种含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球及其制备方法，制备的含钆介孔二氧化硅海藻酸纳米微球具有mri/us双模态成像效果、可塑形固化、安全无毒、生物可降解。

为了解决上述技术问题，本发明提出的一种含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球，包括的组分有粒径为100-200nm的介孔二氧化硅纳米颗粒、含钆类磁共振对比剂、孔道包封剂、海藻酸钠和氯化钙；将所述的介孔二氧化硅纳米颗粒作为装载含钆类磁共振对比剂的载体和超声显像材料，利用虹吸作用将含钆类磁共振对比剂装载至所述介孔二氧化硅纳米颗粒，介孔二氧化硅纳米颗粒的表面通过所述孔道包封剂的氢键作用修饰，然后依次与海藻酸钠水溶液和氯化钙水溶液混合，利用ca²⁺和含钆介孔二氧化硅海藻酸钠混悬液中藻酸盐的α-l-古洛糖醛酸嵌段之间的高亲和力，交联固化形成直径为3.8～4.2mm、硬度为10～25hw的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球。

进一步讲，本发明的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球中，所述的孔道包封剂是油酸甲酯或是油酸。

上述含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球的制备方法，包括以下步骤：

步骤1)：将粒径为100-200nm介孔二氧化硅纳米颗粒分散于质量百分数为0.1％-6.4％的含钆类磁共振对比剂水溶液，介孔二氧化硅纳米颗粒与含钆类磁共振对比剂水溶液的质量体积比为1g/100ml，室温下搅拌反应24h，离心干燥后收集的产物即为装载了含钆类磁共振对比剂的介孔二氧化硅纳米颗粒；

步骤2)：将步骤1)得到的产物分散到适量的有机溶剂内，加入油酸甲酯或是油酸，其中，油酸甲酯或是油酸与介孔二氧化硅纳米颗粒的质量比为3:1，室温下搅拌反应24h，蒸发有机溶剂后，用无水乙醇或乙醇水溶液洗涤3次，分离、干燥后，所得即为含钆介孔二氧化硅纳米颗粒；

步骤3)：将海藻酸钠溶于去离子水中，经过机械搅拌，得到质量百分数为2～3％的海藻酸钠水溶液，优选为3％。

步骤4)：将步骤2)中得到的含钆介孔二氧化硅纳米颗粒加入至步骤3)制得的海藻酸钠水溶液中，其中，含钆介孔二氧化硅纳米颗粒与含钆介孔二氧化硅海藻酸钠水溶液的质量体积比为50mg/ml～200mg/ml，优选为100mg/ml；室温搅拌至均匀，得到含钆介孔二氧化硅海藻酸钠混悬液；

步骤5)：按照体积比为1:1将步骤4)得到的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠混悬液与摩尔浓度为0.5mol/l～4mol/l的氯化钙水溶液交联固化，交联反应时间为3min，得到直径为3.8-4.2mm、硬度为10-25hw的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球。

进一步讲，本发明的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球的制备方法，其中：

步骤1)中，所述含钆类磁共振对比剂包括钆贝葡胺、钆喷酸葡胺、钆布醇、钆特酸葡甲胺，亦包括其它能在磁共振成像的对比剂；含钆类磁共振对比剂水溶液的质量百分数优选为1.6％。

步骤2)中，所述有机溶剂为四氢呋喃或无水乙醇；所述蒸发有机溶剂的方法采用旋转蒸发仪或放置在通风橱内蒸发有机溶剂；所述乙醇水溶液的体积分数为65％-70％。

步骤5)中，将含钆介孔二氧化硅海藻酸钠混悬液与摩尔浓度为0.5mol/l～4mol/l的氯化钙水溶液交联固化的过程采用双通道微量注射泵进行，所述双通道微量注射泵包括两个注射器分别记为通道a注射器和通道b注射器，并包括以下步骤：

在通道a注射器内装入步骤4)制备得到的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠混悬液；在通道b注射器内装入摩尔浓度为0.5mol/l～4mol/l的氯化钙水溶液；将两个注射器分别安装在双通道微量注射泵的通道a和通道b上，并使两个注射器的针头位于同一位置，启动双通道微量注射泵，所述双通道微量注射泵的速度为0.01-0.05m/s，当注射器a和注射器b推出的液量均为0.2ml，停止推动，停留3分钟，最终在两个注射器的针头出液孔处形成了直径为3.8-4.2mm的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球。

上述制备方法制得的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球(直径约4mm)，以粒径为100-200nm介孔二氧化硅纳米为载体和超声显像材料，利用虹吸作用装载进含钆类磁共振对比剂，介孔二氧化硅表面通过油酸甲酯的氢键作用修饰封住孔道，防止货物泄露；利用ca²⁺和含钆介孔二氧化硅海藻酸钠混悬液中藻酸盐的α-l-古洛糖醛酸嵌段之间的高亲和力，交联固化形成含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球。由于含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球安全无毒、可代谢具有mri/us双模态成像能力且可塑形固化，因此，本发明的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球可以应用于超声-磁共振图像配准融合导航中，即将该含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球作为标记物用于磁共振图像(mri)与超声图像(us)的配准融合导航，例如，可以作为标记物具体应用于前列腺mri/us图像配准融合穿刺导航技术。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球的原材料安全无毒且可代谢吸收。

(2)本发明的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球，用于在前列腺mri/us图像配准融合导航上，简便、准确、快速，实际操作时，只需将氯化钙水溶液和含钆介孔二氧化硅海藻酸钠混悬液通过双针注射方式即可完成含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球的植入。

(3)本发明的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球具有mri/us双模态成像能力，在前列腺mri/us图像配准融合导航过程中作为标记物，可克服前列腺内植入性标记物的损伤性和前列腺解剖结构作为标记物的不稳定性和因操作者经验不足的不确定性，提高mri/us图像融合成功率，进而提高穿刺准确率。

附图说明

图1(a)是实施例1制得的含钆介孔二氧化硅纳米颗粒的透射电镜图；

图1(b)是实施例1制得的含钆介孔二氧化硅纳米颗粒的粒径分布图；

图2是实施例1制得的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球的外观及大小示意图；

图3(a)至图3(d)是实施例3中制备的不同含钆介孔二氧化硅纳米颗粒质量浓度、海藻酸钠水溶液浓度与制得的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球硬度的关系曲线，其中：

图3(a)是含钆介孔二氧化硅纳米颗粒与海藻酸钠水溶液的质量体积比为50mg/ml，海藻酸钠水溶液质量百分数分别为1％、2％和3％制得的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球硬度的关系曲线；

图3(b)是含钆介孔二氧化硅纳米颗粒与海藻酸钠水溶液的质量体积比为100mg/ml，海藻酸钠水溶液质量百分数分别为1％、2％和3％制得的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球硬度的关系曲线；

图3(c)是含钆介孔二氧化硅纳米颗粒与海藻酸钠水溶液的质量体积比为150mg/ml，海藻酸钠水溶液质量百分数分别为1％、2％和3％制得的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球硬度的关系曲线；

图3(d)是含钆介孔二氧化硅纳米颗粒与海藻酸钠水溶液的质量体积比为200mg/ml，海藻酸钠水溶液质量百分数分别为1％、2％和3％制得的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球硬度的关系曲线；

图4是实施例5所述植入前列腺凝胶模型的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球磁共振t1wi图像；

图5是实施例5所述植入前列腺凝胶模型的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球us图像。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步的说明，但下述实施例绝非对本发明有任何限制。

本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。下述实施例中的介孔二氧化硅纳米颗粒可以按照溶胶-凝胶法制备，其粒径为100-200nm。

实施例1：制备含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球，具体步骤如下：

1)称取1g介孔二氧化硅纳米颗粒(粒径为107nm)，加入100ml质量百分数为0.1％的钆贝葡胺水溶液，室温搅拌24h；

2)产物分离后分散到50ml无水乙醇溶液中，加入3g油酸甲酯，然后在室温下通风橱中搅拌24h。然后，为除去过量的反应物，将产物通过无水乙醇洗涤3次，然后3000rpm低速离心5min，并在40℃下真空干燥24小时，得到含钆介孔二氧化硅纳米颗粒，该纳米颗粒呈球形，其透射电镜如图1(a)，其粒径分布图如图1(b)所示，平均粒径为160nm。

3)将3g海藻酸钠溶于去离子水中，经过机械搅拌得到质量百分数为3％的海藻酸钠水溶液；

4)称取100mg含钆介孔二氧化硅纳米颗粒，加入1ml上述的质量百分数为3％的海藻酸钠水溶液，经过机械搅拌混匀后得到含钆介孔二氧化硅纳米颗粒质量浓度为100mg/ml的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠混悬液；

5)双通道微量注射泵的通道a注射器内装入步骤4)制得的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠混悬液，通道b注射器内装入摩尔浓度为1mol/l氯化钙水溶液；将两个注射器分别安装在双通道微量注射泵的通道a和通道b上，将两个注射器的针头相互接触，均以0.03m/s的速度匀速各推注0.2ml，推注过程中含钆介孔二氧化硅海藻酸钠混悬液会与氯化钙水溶液接触，从而发生交联固化，交联固化反应3min后，形成直径约4mm的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球，如图2所示。

采用邵氏硬度计(o型)测量得本实施例得到的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球的硬度为18.4hw，塑形效果良好。

实施例2：制备含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球，具体步骤如下：

1)称取1g介孔二氧化硅纳米颗粒，加入100ml质量百分数为6.4％钆贝葡胺水溶液，室温搅拌24h；

2)产物分离后分散到50ml四氢呋喃溶液中，加入3g油酸甲酯，然后在室温下通风橱中搅拌24h。然后，为除去过量的反应物，将产物通过体积分数为65％的乙醇水溶液洗涤3次，然后3000rpm低速离心5min，并在40℃下真空干燥24小时，得到含钆介孔二氧化硅纳米颗粒。

3)将2g海藻酸钠溶于去离子水中，经过机械搅拌得到质量百分数为2％的海藻酸钠水溶液；

4)称取100mg含钆介孔二氧化硅纳米颗粒，加入1ml上述的质量百分数为2％的海藻酸钠水溶液，经过机械搅拌混匀后得到含钆介孔二氧化硅纳米颗粒质量浓度为100mg/ml的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠混悬液；

5)双通道微量注射泵的通道a注射器内装入步骤3)制得的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠混悬液，通道b注射器内装入0.5mol/l氯化钙水溶液；将两个注射器的针头相互接触，均以0.03m/s的速度匀速各推注0.2ml，推注过程中含钆介孔二氧化硅海藻酸钠混悬液会与氯化钙水溶液接触发生交联固化，3min后，形成直径约4mm的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球。

采用邵氏硬度计(o型)测量得本实施例得到的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球的硬度为12.8hw，塑形效果较好。

实施例3：本发明制备得到的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球的塑性效果。

利用不同含量的组分按照以下步骤制备得到一系列的用于测得产物邵氏硬度的试样：

1)称取1g介孔二氧化硅纳米颗粒，加入100ml质量百分数为1％钆贝葡胺水溶液，室温搅拌24h；

2)产物分离后分散到50ml四氢呋喃溶液中，加入3g油酸甲酯，然后在室温下通风橱中搅拌24h。然后，为除去过量的反应物，将产物通过乙醇水溶液(乙醇体积分数为65％)洗涤3次，然后3000rpm低速离心5min，并在40℃下真空干燥24小时，得到含钆介孔二氧化硅纳米颗粒。

3)准备3个容器，将1g、2g、3g海藻酸钠溶于每个容器的适量的去离子水中，经过机械搅拌制备得到质量百分数分别为1％、2％和3％的海藻酸钠水溶液；

4)称取上述制备的含钆介孔二氧化硅纳米颗粒分别与上述的质量百分数为1％、2％和3％的海藻酸钠水溶液共混，制备得到含钆介孔二氧化硅纳米颗粒质量浓度分别为50mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠混悬液；

5)按照实施例1中步骤5)的方法将步骤4)制得的各质量体积浓度的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠混悬液分别与浓度为0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4mol/l的氯化钙水溶液均以0.03m/s的速度匀速各推注0.2ml，交联固化3min后，形成含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球。

图3(a)示出了含钆介孔二氧化硅纳米颗粒与海藻酸钠水溶液的质量体积比为50mg/ml，海藻酸钠水溶液质量百分数分别为1％、2％和3％制得的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球硬度的关系曲线；图3(b)示出了含钆介孔二氧化硅纳米颗粒与海藻酸钠水溶液的质量体积比为100mg/ml，海藻酸钠水溶液质量百分数分别为1％、2％和3％制得的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球硬度的关系曲线；图3(c)示出了含钆介孔二氧化硅纳米颗粒与海藻酸钠水溶液的质量体积比为150mg/ml，海藻酸钠水溶液质量百分数分别为1％、2％和3％制得的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球硬度的关系曲线；图3(d)示出了含钆介孔二氧化硅纳米颗粒与海藻酸钠水溶液的质量体积比为200mg/ml，海藻酸钠水溶液质量百分数分别为1％、2％和3％制得的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球硬度的关系曲线。对所得的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球采用邵氏硬度计(o型)测量，测量结果如表1所示，从表1可知，在本发明制备方法中限定的工艺条件内获得的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球的硬度在10.8～24.6hw范围，即所得的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球的塑形效果较好。

表1

实施例4：将本发明制备得到的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球作为标记物，在前列腺mri/us图像配准融合导航方面的应用。

(1)制备含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球：

称取1g介孔二氧化硅纳米颗粒(粒径为160nm)，加入100ml质量百分数为1％钆贝葡胺水溶液，室温搅拌24h，产物分离后分散到50ml无水乙醇溶液中，加入3g油酸甲酯，然后在室温下通风橱中搅拌24h。然后，为除去过量的反应物，将产物通过无水乙醇洗涤3次，然后3000rpm低速离心5min，并在40℃下真空干燥24小时，得到含钆介孔二氧化硅纳米颗粒。将3g海藻酸钠溶于97g去离子水中，经过机械搅拌得到质量百分数为3％的海藻酸钠水溶液；称取100mg含钆介孔二氧化硅纳米颗粒，加入1ml上述的质量百分数为3％的海藻酸钠水溶液，经过机械搅拌混匀后得到含钆介孔二氧化硅纳米颗粒质量浓度为100mg/ml的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠混悬液；双通道微量注射泵的通道a注射器内装入步骤3)制得的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠混悬液，通道b注射器内装入1mol/l氯化钙水溶液；将两个注射器的针头相互接触注射入前列腺凝胶模型内，均以0.03m/s的速度匀速各推注0.2ml，推注过程中含钆介孔二氧化硅海藻酸钠混悬液会与氯化钙接触发生交联固化3min后，形成含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球。

(2)将上述制备得到的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球的应用。

使用粒子植入针将上述制备得到的已固化的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球植入前列腺凝胶模型，随后，进行核磁共振扫描，获取核磁共振t1wi图像，含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球在t1wi像上呈高信号，如图4中箭头所指部位所示。将植入有上述制备得到的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球的前列腺凝胶模型相同位置进行超声扫描，含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球超声回声明显，如图5中箭头所指部位所示。将上述制备得到的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球作为标记物，将其超声层面定位到磁共振上显示的层面，实现两种影像模态的配准。

使用本发明的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球的配准融合导航原理是：在超声引导穿刺前，通过双通道微量注射泵以双针注射法或经粒子植入法将含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球植入前列腺模型的前列腺模拟物旁，通过核磁共振扫描获取前列腺模型的影像资料，将核磁共振图像数据拷贝至图像融合工作站，然后对前列腺模型进行超声引导的前列腺穿刺，含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球在核磁共振及超声成像下均可显影，可实现两种影像模态的精确配准，然后通过手动或相关软件自动调取前列腺模型核磁共振图像进行两种图像融合，采取半透明显示或突出显示病灶等方法就可在超声图像上叠加显示核磁共振上的病灶影像，再对此病灶进行靶向穿刺。

本发明的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球在上述应用方面的特性：

含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球安全无毒、可代谢吸收，塑形效果佳；含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球在核磁共振t1wi上呈高信号，能够与周围组织产生明确信号对比；含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球在超声扫描下亦产生与周围组织有明确对比的回声；含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球可经双针注射法在植入部位固化，也可在体外固化后经粒子植入的方式植入。

综上，本发明的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球，取材方便，采用介孔二氧化硅纳米颗粒、含钆类磁共振对比剂、孔道包封剂、海藻酸钠和氯化钙制得，具有磁共振和超声双模态成像、体内外塑形固化、安全无毒、可代谢吸收等优点，使得制备得到的纳米微球能够保证最终成像结果的稳定性和可靠性。本发明的制备工艺简单、成本低廉，实际应用时，使用双针注射法或粒子植入法，操作简单、快速，只需将两种成像模式下的含钆介孔二氧化硅海藻酸钠纳米微球影像进行配准即可，可克服前列腺内植入性标记物的损伤性和前列腺解剖结构作为配准标记物的不稳定性和因操作者经验不足的不确定性，提高mri/us图像配准融合成功率，进而提高穿刺准确率。另一方面合成工艺简单、原料成本低、易于量产，带来巨大的经济效益和社会效益。

尽管上面结合附图对本发明进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨的情况下，还可以做出很多变形，这些均属于本发明的保护之内。