具有生物净化活性的新的乳酸菌制剂的制作方法

专利名称:具有生物净化活性的新的乳酸菌制剂的制作方法
本发明涉及一种乳酸菌制剂，该制品对人和动物的健康极其有效，其中同时使用纯净乳杆菌(Lactobacillus clearans)以及粪肠球菌(肠球菌属)活细胞或死细胞的任一种或两者，其中所说的纯净乳杆菌是由本发明人首先分离的，并且属于乳杆菌属但具有常规已知菌中没有发现的特定性能，该制品与脂质代谢有密切关系，允许每种细菌的优点都能被更清楚和有效地显现出来。
据报导，消化道中有300种和100兆个细菌个体，总共有1kg重并且其数目远远超过总共才60兆的人体细胞。经过多年的免疫学研究和探讨，逐渐阐明了它们与人和动物健康和各种疾病的有效关系，目前专家认为肠内菌群起重要的器官功能。属于乳酸菌的有益细菌，例如双歧杆菌属和乳杆菌属的细菌，当占主导地位时是以平衡方式共同存在的。这种平衡可以被各种因素所打破，例如日常饮食的数量和品质、用力过度、失眠、和精神压力，导致有害细菌如Welch细菌和韦荣氏球菌的增生。有益细菌被排挤导致越来越多的有害物质产生，从而会引起各种疾病和加速整体老化，从粪便失调，如腹泻和便秘，至由有毒血液引起的疾病，如慢性疲劳、皲裂皮肤、肝脏机能障碍、高血压和动脉硬化。
俄国人Metchnikoff(1845-1916)提出的理论是老化的主要原因是肠内腐败发酵形成的毒素中毒，并且提倡养成饮用乳酸菌饮料如酸奶的习惯作为治疗法以有助于防止老化。自那时起乳酸菌经过了难以预测的历史变化，没有可能去把握这种细菌的真正实践利用。其原因是不能解释由目前免疫学研究揭示和由实验阐明的事实。
Metchnikoff的假说已经产生，并且目前在保健科学中成为普通知识，随近代微生物学的发展，有益肠细菌所起的各种重要功能得到阐明，例如减少肠酸性和促进肠能动性以帮助消化食物和吸收营养、同时抑制和降解有害物质、合成维生素和氨基酸、保护肠道免受病原体的感染、并且增强免疫能力。
此外，随着近来健康的趋势，乳酸菌作为很多人们的饮料和抗肠胃胀气剂已经建立了坚实的基础。然而，不可否认，这些产品没有引起期望积极效果的人们的注意，未能实现通过日常饮食或使用乳酸菌来达到健康和改善症状。遗憾的是，乳酸菌产品仍然仅作为提神产品被食用，或者仍然趋向于类似咖啡那样被认为是偏爱。
鉴于上述，需要一种可以很快施用以显出常规乳酸菌饮料或制品中所没有的较好效果的产品。尽管本发明人以前便发现了命名为纯净乳杆菌(Lactobacillus clearans)的新菌种对保健目的是非常有效的，但他们具体注意到了这个菌种缺少足够的肠道净化作用。为产生一种具备更高潜力等的菌株来弥补这种缺陷，本发明人付出了很多努力，导致不可避免的结论是单独使用细菌本身仅产生有限的效果。因此，在寻找乳酸菌的制品中认识到要同时使用另一种活性物质，所说的乳酸菌制剂才能够使健康个体精力充沛，并且能够更新处于半病或半健康的个体平安和恢复健康的观念。
经过寻找相容的生物学或非生物学配对物来消除上述缺陷的深入研究，结果本发明人基于发现了与纯净乳杆菌同属于乳杆菌属的粪肠球菌完成了本发明，其中所说的粪肠球菌是一种能够减少甘油三酯和胆固醇中至少一种的菌种。也就是说，本发明是一种乳酸菌制剂，该制品含有纯净乳杆菌活细胞和能够减少至少甘油三酯和胆固醇中一种或多种的粪肠球菌活细胞。
本发明的第二个方面是一种乳酸菌制剂，该制品含有纯净乳杆菌活细胞和能够减少至少甘油三酯和胆固醇中一种或多种的粪肠球菌的死细胞。
本发明的第三个方面是一种乳酸菌制剂，该制品含有纯净乳杆菌活细胞和能够减少至少甘油三酯和胆固醇中一种或多种的粪肠球菌的活细胞和死细胞。
本发明所说的纯净乳杆菌是一种属于乳杆菌属的新菌株，并且具有以下的生化特性1、2、3和4。具体说，它包括乳杆菌属的菌株，其1)当向5g肉膏、5g蛋白胨、1g葡萄糖、1gCaCO3、和1L水(中性pH)中添加0.5gNa2S·9H2O和/或0.5mL NH4OH时能够使Na2S·9H2O和NH4OH都减少；2)在含有1g酪蛋氨基酸和维生素(A900IU、B11mg、B21mg、B61mg、B125γ、烟酰胺16mg、泛酸钙8mg、C64mg、和D2120IU)的Stephenson-Wetham培养基((简称S-W)lgKH2PO4、0.7gMgSO4·7H2O、1gNaCl、4g(NH4)2HPO4、0.03gFeSO4·7H2O和5g葡萄糖)中培养的细菌培养物对数生长期期间添加0.5gNa2S·9H2O和/或0.5mL NH4OH却不显出生长促进作用；3)天然分离的菌株形式，对Na2S·9H2O的抗性大于常规已知的乳酸菌但弱于除臭乳杆菌(Lactobacillus deodorans)；并且4)是革兰氏阳性、杆状、非游动、过氧化氢酶阴性、并且不是硝酸盐还原性和不是明胶降解性的，不能产生吲哚或硫化氢，具有从葡萄糖和乳糖形成乳酸的高能力，并且通过添加乙酸而促进生长(参见JP公开号(KoKoKu)H4-632)。
除普通乳杆菌的作用外，纯净乳杆菌的优点包括常规乳杆菌缺乏的有效的肠净化作用(JP专利1714413和JP申请11-15177中所述)，例如1)分解肠的腐败恶臭物质；2)增加肠菌群中有益细菌，如双歧杆菌和乳杆菌，并且有害细菌显著减少，如Welch细菌和韦荣氏球菌，由此提供肠菌群中的较好平衡以改进肠的环境；并且3)抑制引起肠感染的病原体的起始生长，并且消除毒性。
这些作用将如下通过试验进行描述。首先进行体外试验。将15mL10倍稀释的粪便引入测试管(18×180mm)中。然后用样品细菌接种测试管，所说的样品细菌1)在高压下120℃灭菌15分钟，和2)没有灭菌。用橡皮塞塞住测试管72小时，使其37℃下厌氧培养。然后通过注射器从测试管内部抽出1mL空气，并且注入5L气袋中以6个人一组进行嗅觉测试。根据表1所示的粪便气味标准来评价气味。表1粪便气味标准
使用纯净乳杆菌的三个典型菌株具体说是FERM BP-6972、FERM BP-6971、FERM BP-6973，用来在前述的体外试验中测试脱臭能力。表2的结果显示在高压下灭菌的样品明显被脱臭，气味评价为具有弱或轻微的粪便气味。另一方面，未灭菌的样品所显出的脱臭程度不如高压灭菌的样品，因为产生了有恶臭的物质，也许是粪便中有很多腐败细菌活性的结果，但无论如何它们也被明显脱臭。这3种纯净乳杆菌的典型菌株在前述试验中的结果用其它相似的菌株也类似再现。表2纯净乳杆菌的脱臭能力(体外)
在接下来的体内试验中，将150mL用纯净乳杆菌FERM BP-6973制备的酸奶一天食入一次，并且在食入20-30天、50-60天和80-90天后测定粪便的气味，得到的平均值见表3。结果的测定是通过将10个个体的0.5g粪便样品引入20L气味袋中，放在室温下储藏，30分钟后由6位一组评价气味。5个没有食入酸奶的个体的平均粪便气味得分为100。尽管粪便气味依据饮食含量而有很大的不同，但10个食入了酸奶的个体，其气味平均在食入了1个月后降低约50％，2个月后降低约70％，并且3个月后降低约85％。然而，在3个月后，继续食入酸奶达到80-90％的最大气味降低率。表3食入由纯净乳杆菌制备的酸奶后的粪便气味
说到净化和天然世界中细菌的关系，本发明人将所分析的物质缩小至可容易测试的恶臭物质，其广义上可分成硫化合物、氮化合物和碳化合物。据发现，能够分解恶臭硫化合物如Na2S·9H2O、恶臭氮化合物如NH3和恶臭碳化合物如乙酸、丁酸和类似的低级脂肪酸的细菌能够分解聚合物中的大部分恶臭硫化合物、恶臭氮化合物、恶臭碳化合物，这被称作SNC理论。根据该理论继续以下试验。
将0.5gNa2S·9H2O或0.5mL氨水(NH4OH)添加到1mL合成培养基中，所说的合成培养基含有5g肉提取物、5g蛋白胨、3g丁酸钠、5g葡萄糖和3gCaCO3，用纯净乳杆菌接种培养基，在37℃下厌氧培养72小时，并且随时测定所添加的Na2S·9H2O或NH4OH的降低情况。通过JIS K0102-1985的碘滴定法测定Na2S·9H2O，并且通过JISK0102-1985的吲哚苯酚蓝色吸光度法测定NH4OH。结果见表4和5。表中显示纯净乳杆菌具有在72小时内将有毒恶臭Na2S·9H2O和NH4OH减少40-50％的能力。这意味着它可以分解和同化大部分的其它恶臭有毒物质。表4过硫化钠被纯净乳杆菌的分解和同化
表5氨被纯净乳杆菌的分解和同化
以上所述的体外感官测试和化学分析是对纯净乳杆菌脱臭作用的评价。将此时制备的10倍稀释的粪便样品在培养前离心，并且在培养72小时之后，收集5mL上清液并且稀释10倍，测定S2+和NH4+离子浓度，并且计算其降低的程度。表6的结果稀释粪便中S2+和NH4+离子的降低度高于在前述合成培养基中的降低度，说明粪便是纯净乳杆菌更合适的栖息地。通过JIS K0102-1985的碘滴定法测定S2+离子，并且通过JIS K0102-1985的吲哚苯酚蓝色吸光度法测定NH4+离子。表6S2+和NH4+通过纯净乳杆菌的降低
将2μL的前述上清液引入气相色谱仪中分析低级脂肪酸。气相色谱法使用Col.unisole F-200 30/60玻璃(3φ×3m)，载气速率50mL/min(He)，含有152kPa(0.55kg/cm2G)氢气和152kPa(0.55kg/cm2G)空气，柱温140℃且注射温度200℃。所测定的物质为乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸和正戊酸，所计算的浓度见表7。表7显示了高压灭菌后的样品低级脂肪酸浓度降低50-75％，而未灭菌的样品降低40-60％。表7低级脂肪酸通过纯净乳杆菌的降低
制备纯净乳杆菌三种典型菌株即FERMBP-6972、6971和6973的冻干细胞，并且等份混合形成制品。连续摄取2g的制品(5×108细胞/g)，并且随时间测定双歧杆菌和乳杆菌(除纯净乳杆菌外)、以及典型有害细菌如韦荣氏球菌和产气荚膜梭菌(Welch细菌)细胞数(个细胞/1g粪便)的变化，其中所说的双歧杆菌和乳杆菌已知是肠菌群中典型的有益细菌。表8显示了给20个健康个体口服施用的结果，而表9显示了给20个体质虚弱个体口服施用的结果。表8口服施用纯净乳杆菌制品对健康个体肠菌群的影响(20个健康个体的平均值)
表9口服施用纯净乳杆菌制品对体质虚弱个体肠菌群的影响(20个体质虚弱个体的平均值)
表8和9显示了在施用纯净乳杆菌制品之前，肠菌落中的有益菌在健康个体中比体质虚弱个体中平均多220％，而有害菌仅为约22.5％。这说明肠菌落的状态是健康表现状态的指数，也就是与肠菌落的健康情况有密切关系。一个新的发现是在健康个体中制品的摄入首先导致有益菌的增加，并且随着这种增加，有害菌逐渐减少。与这种形式相反，据发现天然虚弱个体的形式是首先有害菌减少，接着有益菌逐渐增加。总体来说，有益菌和有害菌的平均变化反映在有益菌的增加和有害菌的相应减少。这种趋势在3个月之后加剧，6个月后双歧杆菌增加50％并且1年后增加110％，而乳杆菌在6个月后增加300％，并且1年后增加950％。相反，梭菌在6个月后减少70％并且1年后减少85％，而韦荣氏菌在6个月后减少67.5％，并且1年后减少82.5％。
将大肠埃希氏杆菌O-157、肠炎沙门氏菌、弗氏志贺氏菌单独培养，和与纯净乳杆菌(FERM BP-6973)一起培养，以检查纯净乳杆菌的抗病原体作用，并且比较结果。培养所用的培养基组成包括每升10g肉提取物、10g蛋白胨、2g葡萄糖、2gNaCl和1gCaCO3，pH调至7.2。在37℃下进行厌氧培养，每72小时重复传代培养，此时将平板稀释并且涂片以检测细胞数的变化、菌落是否是S型(原始)还是突变成毒性消除的R型、其比率等等。试验所用的病原体得自MedicKK(注册的环境卫生研究所)。
表10显示了大肠埃希氏杆菌O-157单独培养的结果，表11显示了大肠埃希氏杆菌O-157和纯净乳杆菌混合培养的结果。表10显示了在O-157的单独培养中，整个20代传代培养物中细胞数一直是4-5×109细胞/g，没有出现R型。表11显示了在大肠埃希氏杆菌O-157和纯净乳杆菌的混合培养中，纯净乳杆菌细胞数有很少的变化，但大肠埃希氏杆菌O-157有明显的变化。在第5次传代培养物中出现R型，并且随着接下去的传代培养积累，R型的比率增加，直至通过第18次传代培养所有细胞均形成R型。在接下去继续的传代培养中没有S型回复。表10大肠埃希氏杆菌O-157单独培养结果
表11大肠埃希氏杆菌O-157和纯净乳杆菌混合培养结果
表12显示了肠炎沙门氏菌单独培养的结果，表13显示了肠炎沙门氏菌和纯净乳杆菌混合培养的结果。表12显示了在肠炎沙门氏菌的单独培养中，细胞数是3-5×109细胞/g。R型自发出现在第14代传代培养物中，通过第20次传代培养达到5％的比率。该比率在接下去的传代培养中增加，第50次传代培养达到最高峰23％。此后R型的比率保持在约20％。表13显示了在肠炎沙门氏菌和纯净乳杆菌的混合培养中，第5代传代培养物中R型为29％，并且随着接下去的传代培养积累，R型的比率增加，通过第10次传代培养达到50％，第20次传代培养达到90％，并且在第47次传代培养达到100％。在接下去的传代培养中S型回复为小于1％。在第70次传代培养之后，所有S型消失，没有进一步回复。表12肠炎沙门氏菌单独培养结果
表13肠炎沙门氏菌和纯净乳杆菌混合培养结果
表14显示了弗氏志贺氏菌单独培养的结果，表15显示了弗氏志贺氏菌和纯净乳杆菌混合培养的结果。表14显示了在弗氏志贺氏菌的单独培养中，R型自发出现在第10代传代培养物中，通过第20次传代培养达到9％的比率。该比率在接下去的传代培养中增加，第40次传代培养达到最高峰20％。此后R型的比率保持在约10-20％。表15显示了在弗氏志贺氏菌和纯净乳杆菌的混合培养中，R型出现在第5代传代培养物中，并且随着接下去的传代培养积累，R型的比率增加，并且通过第80次传代培养达到100％。在接下去的传代培养中出现S型回复，但小于1％。在第108次传代培养之后，所有S型消失，没有进一步回复。表14弗氏志贺氏菌单独培养结果
表15弗氏志贺氏菌和纯净乳杆菌混合培养结果
在10只8周岁雄性小鼠的组中，给每只腹膜内施用1×108细胞，以研究大肠埃希氏杆菌O-157、肠炎沙门氏菌和弗氏志贺氏菌的S型和R型毒性。S型使用保藏的菌株，并且此时R型使用通过纯净乳杆菌突变成100％R型的菌株。表16的结果显示了携带S型病原体的所有动物4周内全部死亡，而携带R型的动物除弗氏志贺氏菌导致第7天死亡外均没有死亡。表16大肠埃希氏杆菌O-157、肠炎沙门氏菌和弗氏志贺氏菌S型和R型对小鼠的毒性
将用上述纯净乳杆菌制备的酸奶给人口服施用，并且一月分析一次血样，以研究肠菌落的变化。80％以上的个体中胆固醇和甘油三酯含量比施用前下降约10％。
表17显示了本发明纯净乳杆菌和常规乳杆菌菌株之间作用的差异。表17纯净乳杆菌和常规乳杆菌菌株之间作用的比较
粪肠球菌是一类构成肠菌落的细菌，并且属于乳酸菌属，正常情况下每克粪便中存在约1×107细胞的量。它们以球形或卵形两种形式、或以短链形式出现。它们是革兰氏阳性球菌，具有耐热、干燥、氯、没食子酸等的潜能，并且相比普通链球菌可在10-45℃的较宽温度范围内生长。尽管有一些是病原菌株，但它们是无毒性的。活细胞起抗肠胃胀气作用，并且在日本可商购获得超过10年。据证明它们口服摄取是无毒性的。除市售产品外，近来显示一些菌株的活细胞或死细胞可有效降低血液胆固醇和甘油三酯。因此它们在预防和治疗典型有关的成人疾病(源于生活习惯的疾病)中保留了一席之地。，例如高血脂、高血压和动脉硬化。本发明中所称的粪肠球菌是指具有这种功能的菌株。
以下是制备本发明所用粪肠球菌活细胞的示例性方法。具体说，将通过用普通方法培养和离心的细胞悬浮于生理盐水中，洗涤，再离心，并且收集。可以使用可溶性淀粉作为防腐剂将它们冻干。作为制备粪肠球菌死细胞的示例性方法，可以将可溶性淀粉和当收集上述活细胞时获得的洗涤并离心的细胞在100℃热水中处理30分钟，然后冻干。
尽管粪肠球菌没有体外减少硫化钠(Na2S·9H2O)或氨水的能力，但它具有使10倍稀释的粪便弱脱臭的能力。表18给出了粪肠球菌的两种典型菌株即FERMBP-7230和FERMBP-7231的脱臭能力。试验与纯净乳杆菌进行的试验相同，并且标准与表1所给出的相同。表18粪肠球菌的脱臭能力(体外)
每天每人口服施用1×109细胞量的粪肠球菌两种典型菌株。施用前的粪便臭味定为100。在摄入后20-30天、50-60天和80-90天测定粪便臭味，结果见表19。表19显示了臭味被粪肠球菌降低，尽管脱臭能力较弱。表19粪肠球菌摄入期间的粪便臭味
制备粪肠球菌两种典型菌株即FERMBP-7230和BP7231的活细胞和死细胞，并且将等份活细胞和死细胞混合，得到制品。以1×109细胞/天/人的量摄取该制品6个月，并且在整个时期中，通过测定已知是典型有益菌的双歧杆菌和乳杆菌(除纯乳杆菌外)细胞数变化(细胞/1g粪便)、和典型有害菌如韦荣氏菌和产气荚膜梭菌的细胞数变化，来测定肠菌落细胞数的变化。表20显示了10个健康个体口服施用的结果。表20显示了活细胞具有比死细胞有略微较高的改进率。但其结果远不如纯净乳杆菌。表20给健康个体口服施用粪肠球菌制品对肠菌群的影响
进行大肠埃希氏杆菌O-157、肠炎沙门氏菌和弗氏志贺氏菌的混合培养，以研究粪肠球菌的抗病原体作用。病原体由S突变成R型的比率与自发出现的比率相同。各代传代培养物中病原细胞数逐渐减少，直至肠炎沙门氏菌通过第25次传代培养消失，弗氏志贺氏菌通过第33次传代培养消失，并且大肠埃希氏杆菌O-157通过第35次传代培养消失。虽然这说明了粪肠球菌的生长胜过病原体，但不能排除有一些抑制病原体生长的生理学活性物质产生的可能。
以1×109细胞/1g饲料的量，将前述粪肠球菌活细胞和死细胞制品添加到饲料中。用该饲料饲养小鼠3个月，并且和用单独常规饲料饲养的小鼠进行血清甘油三酯和胆固醇的比较。将小鼠分成10组，并且允许自由饲养。分别通过E-Tesy Wako和C-Test Wako装置测定甘油三酯和胆固醇。对照小鼠的平均含量为100％。结果见表21。表21显示了连续摄入活细胞或死细胞的小鼠，其两种参数的含量减少20-40％，没有可以怀疑其有效性的地方。表21小鼠中口服施用粪肠球菌制品对血清甘油三酯和胆固醇含量的影响
将15只8周岁自发性高血压(SHR)的大鼠分成3组。用含有粪肠球菌活细胞和死细胞制品的饲料以1×109细胞/g饲料的量饲养这些组。对照组不施用任何细胞制品。将动物饲养3个月。表22给出3个月后的血压。表22显示了血压降低了大约10％。表22口服施用粪肠球菌制品对大鼠血压的影响
实施例纯净乳杆菌和粪肠球菌的结合作用会出人意料地很快获得有效的效果。下面将描述本发明制品实例的制造方法，但本发明的范围不受这些制造实施例和操作实施例的限制。(制造实施例1)生产纯净乳杆菌制品将10L接种有纯净乳杆菌的培养基在37℃下厌氧培养72小时，所说的培养基中每升培养基含有5g肉提取物、5g蛋白胨、3g乙酸钠、1mL氨水、10g葡萄糖、0.5g胱氨酸和2g酵母提取物。将所得培养物离心，获得10g生物量。将其用500mL生理盐水洗涤并且离心，共2次。将洗涤的生物量引入500mL含有50g脱脂奶、30g海藻糖和0.5g牛磺酸的溶液中，并且彻底搅拌。将混合物通过普通方法冻干，得到82.5g细胞制品(3×109细胞/g)。将其与330g完全干燥的脱脂奶混合，得到含每克5×108活细胞的纯净乳杆菌制品。(制造实施例2)生产粪肠球菌活细胞制品将10L接种有粪肠球菌的培养基在37℃下需氧培养72小时，所说的培养基中每升培养基含有5g肉提取物、5g蛋白胨、2g氯化钠、2g酵母提取物和10g葡萄糖。将所得培养物离心，获得16g生物量。将其用800mL生理盐水洗涤并且离心，共2次。将洗涤的生物量引入500mL含有20g脱脂奶、30g可溶性淀粉和0.5g谷氨酸钠的溶液中，并且彻底搅拌。将混合物通过普通方法冻干，得到54g细胞制品(5×109细胞/g)。将其与486g完全干燥的可溶性淀粉混合，得到含每克5×108活细胞的粪肠球菌制品。(制造实施例3)生产粪肠球菌死细胞制品将制造实施例2获得的洗涤的生物量悬浮于500mL生理盐水中，然后引入50g可溶性淀粉，将溶液在110℃下热灭菌15分钟，并且将悬浮液通过普通方法冻干，得到53g细胞制品(大约5×109细胞/g)。死细胞制品还可以通过将细胞超声波破裂或类似方法来生产。(制造实施例4)生产纯净乳杆菌和粪肠球菌的混合物制品将制造实施例1生产的纯净乳杆菌制品与制造实施例2生产的粪肠球菌活细胞制品或制造实施例3生产的粪肠球菌死细胞制品等份混合，生产混合物制品。此时制品含有2.5×108细胞/g纯净乳杆菌和2.5×108细胞/g粪肠球菌，但在制造过程中可以改变纯净乳杆菌与粪肠球菌之间的比率，来生产任何所需细胞数的混合物。该制品的形式可以是粉末、颗粒、胶囊或其它具有适宜赋形剂的普通制剂形式。(实施例1)将15mL10倍稀释的粪便引入试管(18×180mm)中。然后用样品细菌接种试管，所说的样品细菌1)在高压下120℃灭菌15分钟，和2)没有灭菌。用橡皮塞塞住试管72小时，使其37℃下厌氧培养。然后通过注射器从试管内部抽出1mL空气，并且注入5L气袋中由一组6人进行嗅觉测试。根据表1所示的粪便气味标准来评价气味。对粪肠球菌死细胞来说，将0.1g制造实施例3生产的制品添加到试管中。表23的试验结果说明粪便的臭味被明显减弱，特别是用高压下灭菌的样品处理的稀释粪便的情况。与表2中单独用纯净乳杆菌接种的试验批次结果比较，上述结论是明显的。表23纯净乳杆菌和粪肠球菌混合物的脱臭试验(1)
(实施例2)将1g粪肠球菌(FERMBP-7230)活细胞制品或1g粪肠球菌(FERMBP-7230)死细胞制品和100mL由纯净乳杆菌FERMBP-6973在培养基中制备的酸奶的组合连续施用给10个个体，其中所说的培养基每升含有100g脱脂奶、50g蔗糖和2g琼脂，并且连续测定施用后20-30天、50-60天和80-90天的粪便气味。结果的测定是通过将10个个体的0.5g粪便样品引入20L气味袋中，放在室温下储藏，30分钟后由6人一组评价气味。5个没有食入酸奶的个体的平均粪便气味得分为100。表24中的平均值显示了粪便的臭味被明显减弱，并且不再令人不快。当与表2中单独施用纯净乳杆菌获得的结果比较，这种效果是明显的。表24纯净乳杆菌和粪肠球菌混合物的脱臭试验(2)
(实施例3)以实施例1相同的方式，用样品细菌接种10倍稀释粪便的试管，所说的样品细菌1)在高压下120℃灭菌15分钟，和2)没有灭菌。用橡皮塞塞住测试管72小时，使其37℃下厌氧培养。然后将培养物离心，分别收集5mL上清液并且稀释10倍，并且测定所得50mL溶液中的游离硫离子(S2+)和铵离子(NH4+)离子的浓度。还通过气相色谱测定低级脂肪酸的浓度。表25和26给出了测定结果。这些表说明灭菌和未灭菌样品中粪便的典型物质均以70-90％的大比率减少。与表6和7中单独用纯净乳杆菌接种时获得的结果比较，这种减少率是明显的。表25通过纯净乳杆菌和粪肠球菌混合物对减少毒性恶臭物质的试验(1)(灭菌的稀释粪便)
表26通过纯净乳杆菌和粪肠球菌混合物对减少毒性恶臭物质的试验(2)(未灭菌的稀释粪便)
(实施例4)将1g含有三种典型纯净乳杆菌菌株(具体说FERM BP-6972、FERM BP-6971和FERM BP-6973)等份混合物的纯净乳杆菌制品(5×108细胞/g)、和1g粪肠球菌FERM BP-7230的粪肠球菌活细胞制品(5×108细胞/g)或1g粪肠球菌FERM BP-7231的粪肠球菌死细胞制品(5×108细胞/g)，给20个健康个体和20个体质虚弱个体连续施用6个月。整个期间检测肠菌落，结果见表27和28。这些表说明口服施用与纯净乳杆菌混合的粪肠球菌活细胞或死细胞比单独施用纯净乳杆菌时(如表8和9)可更快地增加有益菌和减少有害菌。即，在健康个体中的改进快约25％，有益细菌数多10-50％，并且有害细菌数少20-40％。在体质虚弱的个体中，改进快了约20％，有益细菌数多10-30％，并且有害细菌数少20-50％。因此可以得出结论是在体质虚弱的个体中肠菌落的改进更有效。表27纯净乳杆菌和粪肠球菌混合物对肠菌落的影响(1)(健康个体)
表28纯净乳杆菌和粪肠球菌混合物对肠菌落的影响(2)(体质虚弱个体)
(实施例5)将向纯净乳杆菌、大肠埃希氏杆菌O-157、肠炎沙门氏菌或弗氏志贺氏菌的混合培养物中添加粪肠球菌的活细胞或死细胞，在37℃下厌氧培养，并且每72小时重复传代培养，此时将平板稀释并且涂片检测细胞数的变化以及大肠埃希氏杆菌O-157、肠炎沙门氏菌和弗氏志贺氏菌的S-R突变的比。结果见表29、30、31、32、33和34。使用纯净乳杆菌的FERM BP-6973菌株，粪肠球菌是FERM BP-7231菌株。前述粪肠球菌死细胞制品的添加量为每L培养基1g的量。培养所用的培养基组成包括每升10g肉提取物、10g蛋白胨、2g葡萄糖、2gNaCl和1gCaCO3，pH调至7.2，并且在120℃下高压灭菌15分钟。下表揭示了用纯净乳杆菌和粪肠球菌活细胞接种诸如大肠埃希氏杆菌O-157、肠炎沙门氏菌和弗氏志贺氏菌的病原体，可快速形成这些病原体的细胞数，并且随着传代培养过程导致其突变成R型。大肠埃希氏杆菌O-157通过第100次传代培养100％突变成R型，并且在通过第15次传代培养消失。肠炎沙门氏菌和弗氏志贺氏菌分别通过第13次和15次传代培养100％突变成R型，然后消失。当单独使用纯净乳杆菌，如表11、13和15所示，这些病原体突变成R型要经过很多传代培养的过程，但细菌保持1-3×109细胞/g的恒定细胞数，不会消失。尽管向前述病原体添加纯净乳杆菌和粪肠球菌死细胞显出与接种活细胞获得的相同趋势，但突变成R型比用活细胞接种获得的缓慢，并且细胞数减少但不消失。无论如何，导致100％突变成R型的传代培养次数对大肠埃希氏杆菌O-157是15次，肠炎沙门氏菌是30次并且弗氏志贺氏菌是15次，其比单独用纯净乳杆菌作为接种物时快得多。表29纯净乳杆菌(FERM BP-6973)和粪肠球菌(FERM BP-7231)活细胞对大肠埃希氏杆菌O-157的影响 表30纯净乳杆菌(FERM BP-6973)和粪肠球菌(FERM BP-7231)活细胞对肠炎沙门氏菌的影响 表31纯净乳杆菌(FERM BP-6973)和粪肠球菌(FERM BP-7231)活细胞对弗氏志贺氏菌的影响
表32纯净乳杆菌(FERM BP-6973)和粪肠球菌(FERM BP-7231)死细胞对大肠埃希氏杆菌O-157的影响
表33纯净乳杆菌(FERM BP-6973)和粪肠球菌(FERM BP-7231)死细胞对肠炎沙门氏菌的影响
表34纯净乳杆菌(FERM BP-6973)和粪肠球菌(FERM BP-7231)死细胞对弗氏志贺氏菌的影响
(实施例6)将通过制造实施例1方法制备的纯净乳杆菌FERM BP-6972或纯净乳杆菌FERM BP-6972活细胞制品、通过制造实施例2方法制备的粪肠球菌FERM BP-7230或粪肠球菌FERM BP-7231活细胞制品、以及通过制造实施例3方法制备的粪肠球菌FERM BP-7230或粪肠球菌FERM BP-7231死细胞制品合并，并且添加到饲料中，提供给5只10周岁雄性小鼠的组。1g饲料中含有5×108细胞纯净乳杆菌和5×108细胞粪肠球菌(当合并使用时活细胞和死细胞各为2.5×108细胞)。允许动物自由饲养3个月。测定血清中的甘油三酯和胆固醇，与仅饲养正常饲料的对照小鼠比较。通过Triglyceride E-Tesy Wako测定甘油三酯，并且用Triglyceride C-Test Wako测定胆固醇。获得各组的平均含量。对照组小鼠的平均含量为100％。结果见表35。表35和21显示了向纯净乳杆菌中添加粪肠球菌活细胞或死细胞、以及粪肠球菌活细胞和死细胞，对降低甘油三酯和胆固醇的作用，比单独施用纯净乳杆菌时有效得多。与单独施用时获得的结果不同，合并使用死细胞比合并使用活细胞的效果更大。与对照组相比，含量降低了约1/2。表35纯净乳杆菌和粪肠球菌混合物对小鼠血清中甘油三酯和胆固醇的影响
(实施例7)将包括总共35只8周岁自发性高血压大鼠(SHR)的7个组，用含有实施例6细胞制品的饲料喂养7个月。在给提供各个类型细胞制品和对照组施用之前和之后测定血压，所得结果示于表36。表36和22揭示了3个月后血压平均改进了约15％。与实施例6相同，粪肠球菌死细胞的作用比活细胞更有效。血压下降约10-20％，其结果比单独施用纯净乳杆菌时所获得的效果好。表36纯净乳杆菌和粪肠球菌混合物对大鼠血压的影响
表37显示了使用纯净乳杆菌、粪肠球菌和两者都使用的各种功能的作用表37比较汇总
◎杰出；○良好；□普通；△弱；×没有在我们这个日益老龄化的社会里健康保护和相关的措施逐渐在改变。我们的时代，治疗急性疾病和慢性疾病被认为是最重要的，在今天或不远的将来，正证明着按照我们较老龄化的社会向“预防性医学”甚至“营养性治疗”转移。它们不是在疾病到来之后进行的治疗办法。相反，通过教导摄取营养来建立人本身的健康是目前日益增加的主流，以便自然预防疾病。不夸张地说预防疾病以避免完全依赖治疗的情形是21世纪中治疗的先锋。
口服施用本发明的乳酸菌制剂可逐渐扩大有益肠细菌的影响，坚定护卫种肠粘膜，产生维生素并且合成氨基酸，始终抑制外来细菌和外来病原体的生长，消除它们的毒性，并且在乳酸菌制剂的指导下激活免疫功能。因此明显减少有害肠细菌，并且抑制恶臭腐败物质的产生，导致明显的脱臭粪便。变攻击时，乳酸菌制剂积极地以肠腐败菌为食，导致较清洁的肠环境并且正常化肠粘膜和周围血管和神经。
肠的净化，是人活力、能量。血液和肌肤的泉源，导致通过肠较好吸收了生命物质和相反较少吸收了毒性物质。其不可避免地导致较好的肝功能，由此降低血清中的甘油三酯和胆固醇，以及较清洁的血液。这种恢复生气的血液导致血压降低，从而生命物质如激素、酶、抗体和免疫物质不受阻碍地分布在整个全身系统。由此改进代谢，和使所有的系统功能精力充沛。也就是说，污染的肠被清洁了并且返回到它们原来的环境，导致完全的改进和健康的生命状态，没有疾病隐祸。可以说Metchnikoff关于长寿的学说在一个世纪后的今天得以实现。
本发明的乳酸菌制剂可以储藏2至3年而不会有任何损失，允许其可以生产成可随时随地容易使用的可携带货物方式，并且由此具有不可测量的价值。在人口日益老龄化的社会里，越来越老的个体有可能变得卧床不起；尽管废物的清理可以成为问题，但这种废物的脱臭将使这种工作不再令人不快，并且可能会对照顾者有益。
权利要求
1.一种乳酸菌制剂，含有纯净乳杆菌(Lactobacillus clearans)活细胞，和能够减少至少甘油三酯和胆固醇中一种或多种的粪肠球菌活细胞。
2.一种乳酸菌制剂，含有纯净乳杆菌(Lactobacillus clearans)活细胞和能够减少至少甘油三酯和胆固醇中一种或多种的粪肠球菌的死细胞。
3.一种乳酸菌制剂，含有纯净乳杆菌活细胞和能够减少至少甘油三酯和胆固醇中一种或多种的粪肠球菌的活细胞和死细胞。
专利摘要
本发明涉及一种乳酸菌制剂,包括纯净乳杆菌的活细胞和能减少至少甘油三酯和胆固醇中的一种或多种的粪肠球菌活细胞或死细胞或者粪肠球菌活细胞和死细胞。
文档编号A23L1/03GKCN1339301SQ00126203
公开日2002年3月13日 申请日期2000年8月24日
发明者秦忠世, 丸冈俊之 申请人:Bhph有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan