制备乳酸生物传感条的方法

专利名称：制备乳酸生物传感条的方法
技术领域：
本发明涉及一种对乳酸溶液进行测定的乳酸生物传感条。本发明还涉及一种新的乳酸生物传感条的制造方法及其在乳酸传感中的使用。
背景技术：
依靠个体检查和临床实验室结果，医师可以确定危重看护患者体内生物分析物的存在和浓度。在良好控制、高质量的环境中，临床实验室能提供多种自动化系统来进行大量检测和分析支持。然而，临床实验室却不能提供适于治疗创伤和多器官功能紊乱/衰竭患者所需的即刻结果。为了满足对即刻检验结果临床需求，几种的技术正在脱颖而出，这些技术通过在病床边使用包括电化学生物传感器、光学荧光传感器、用于凝血检测系统的顺磁性颗粒及用于化学和免疫化学检测的微机器设备的可靠的、自动化分析仪器进行检测。在可对具有多种分析物的化学嵌板进行快速操作的同时，这些技术也解决了诸如对检测设备进行校准的事先障碍。
这些检测可分为1)体外，其可在病床边进行；2)在活体外(ex vivo)或para vivo，其可在手腕部进行；和3)体内，其可在患者体内进行。这样的检测能够提供间接的成本效率、诸如降低劳动力成本的节约、减少血液验明和运输中错误、以及减少患者并发症。在包括重症监护病房、手术室、急诊科(ER)、介入科、普通患者监护病房以及门诊患者手术和流动看护病房的医院科室通常采用体外或病床边的设备。类似于临床实验室，体外诊断检测提供范围较广的诊断性检测。体外诊断检测系统通常并不与患者在线相连，并且需要一个进行血液采样的操作人员。
诊断市场中的主要诊断检测种类包括动脉血气体、血液化学、血糖、凝血、药物滥用检测、血红蛋白、血细胞容积、感染性疾病以及治疗性药物监测。其它种类包括癌症标志物、心脏病标志物、胆固醇检测、免疫检测、感染性疾病检测、乳酸以及溶血栓监测。
活体外诊断使用外部传感器进行在线实时检测，极少甚至没有血液丢失。在通常情况下，采样的血液流过一个封闭的系统来减少血液接触。活体外系统可以最小化患者中体内传感器相关的包括凝血、不准确、校正漂移和不能立即重新校正的问题。美国专利申请号第5,505,828号公开了的一个示范性的活体外系统。
在对极其危急和不稳定的患者进行治疗中，体内诊断具有相当的潜力。尽管许多公司正在进行研发，体内传感器的技术壁垒至今仍使其远离一般的商业应用。
因为活体外和体内诊断都是在线系统，所以它们可以减少发生在临床或体外检测中的质量控制和信息整合错误。质量控制错误通常归因于操作人员的错误，而并非仪器出错或设备故障。错误的例子包括不合适的样本体积、不准确的校准、使用失效的检测条、不充分的确认、不适当的仪器维护、检测过程的错误计时以及使用错误的材料。临床信息系统整合使得在病床边收集的检测数据能直接输入到患者的记录中。这样的做法提高了患者管理过程的效率，整合了实验室信息系统和临床信息系统，提供了患者信息的全部种类的“无缝”信息流。
乳酸是糖代谢的副产物，在无氧的环境下，即细胞中缺氧的情况下糖酵解的产物(丙酮酸)被转化为乳酸。所以对乳酸含量的估计在呼吸病症、心脏疾病、劳动力降低等等方面非常重要。正常人血液中的乳酸浓度范围为1.2-2.7mM。
例如，乳酸测定的方法采用了多种化学和物理的技术。传统的化验涉及对人血中的乳酸进行化学处理，并将其转化为可被分光光度测量的显色产物，该方法包括在检测中将血液和称为乳酸脱氢酶(LDH)的酶进行反应。因为在这样的过程中有NADH形成，所以要对340nm处的吸光度进行检测，这成为原来存在于血液中的乳酸的检测方法。
美国专利第6,117,920号公开了一种在线乳酸传感器的装置。该传感器装置包括乳酸传感器、吸取检测样品的导管以及在乳酸传感器和导管之间提供液体联系的第一液体流管路。该传感器装置还包括了传感器校准和抗凝结溶液源以及在传感器校准和抗凝结溶液源与所述乳酸传感器之间提供液体联系的第二液体流管路。
在实际操作中，将这样的检测方法用于血液样品的检测还是有一些困难的。这种方法的弊端包括缺乏特异性、标准化难度大、需要大量的血液以及不稳定和腐蚀性试剂的使用。这样的方法还涉及到光学检测，所以较为昂贵且耗费时间。而且样品还需要经过制备。另一个不利条件是使用上述现有技术方法对乳酸水平进行检测需要由有资格的人员在实验室中完成。
Asha Chaubey等人在Electrochimica Acta Vol 46，723-729(2000)中公开了乳酸脱氢酶在电化学处理的聚吡咯聚乙烯磺酸酯合成薄膜上的固化。据报道反应时间约为40秒，在冷藏条件下的有效期约为2周。在另一处公开的内容中(Asha Chaubey et al，Analyticla Chimica Acta Vol49，98-103，2000)，公开了乳酸脱氢酶在传导的聚苯胺薄膜上的固化。反应线性浓度为0.1mM到1mM乳酸浓度，在冷藏条件下的有效期约为3周。因此获得具有更长有效期和更短反应时间的传感器是理想的。
据此，提供能够克服上述弊端且不丧失检测效率和准确性的乳酸生物传感条相当重要。
发明目的本发明的主要目的是提供在水介质中对乳酸进行检测的新的乳酸生物传感条。
本发明的另一个目的是提供快速准确地对水介质中乳酸进行评估的乳酸生物传感条。
本发明的再一目的是提供低成本甚至能够由非医疗人员使用的乳酸生物传感条。
本发明的又一个目的是提供一种分析，其无需对血液样品进行精心预处理就能进行。
本发明的另一个目的是提供75％高活性的乳酸生物传感条。
本发明的另一目的是提供当场可读结果的乳酸传感条。
发明概述与传统方法比较，乳酸生物传感条拥有许多优点，例如反应快速、小尺寸方便性、反应特异、无需任何样品制备、成本低以及检测的敏感性高。该传感器与传统方法比较，最大优点是可以由普通人完成样品操作。
本发明提供用于对样品中乳酸进行分析的乳酸生物传感条，所述传感器包括导电材料的干条传感器，其至少具有i.外表面，ii.丝网印刷的参考电极，和iii.丝网印刷的工作电极。
据此，本发明提供乳酸传感器，其包括电绝缘基础支持物(1)；一对沉积于其表面上分隔的第一和第二银层(2)；一对石墨层，所述石墨层对的每一石墨层都沉积于各自的一层银层上并与各自的银层(2)电性相连；完全被各自的石墨层所覆盖的第一银层；在其中间部分地被各自的石墨层覆盖的第二银层，留出所述层未被覆盖的连接和工作区域；在所述第二银层电极层的工作区域表面的Ag/AgCl电极(4)；与介质一同沉积在覆盖第一银层的石墨层工作区域上的乳酸氧化酶；在所述支持物(1)上承载的所述的银/氯化银参考电极(4)及酶与介质的工作电极；覆盖有亲水性膜的参考电极和工作电极的整个工作区域。
在本发明的一个实施方案中，所使用的电绝缘基础支持物是由聚氯乙烯制造的。
在本发明的一个实施方案中，所述银层之间的距离介于0.5-1mm。
在本发明的另一实施方案中，所述每一银层的厚度介于15到25微米。
在本发明的另一实施方案中，所述电子介质层包含铁氰化钾层或二茂铁层。
在本发明的另一实施方案中，所述亲水性膜是由尼龙或聚酯制造的。
在本发明的另一实施方案中，所述电极的工作区域是用于分配分析物样品的靶区域。
在本发明的另一实施方案中，所述电极的连接末端区域是用于将电极连接到电计(electrometer)的区域。
本发明的乳酸生物传感条具有75％的活性以及30-40秒的乳酸检测反应时间。在冷藏条件下，本发明乳酸生物传感条的有效期约为4个月。在室温条件下(25-30℃)该生物传感条的有效期约为2个月。本发明的传感条是一次性使用的。
本发明还涉及乳酸生物传感条的制造方法，所述传感条包括电绝缘基础支持物(1)；一对沉积于其上的分隔的第一和第二银层(2)；一对石墨层，所述石墨层对的每一层石墨都沉积于各自的银层上并与该银层电性相连(2)；完全被各自的石墨层所覆盖的第一银层；在中间部分地被各自的石墨层覆盖的第二银层，留出未被覆盖所述层的连接和工作区域；在所述第二银层电极层的工作区域表面上提供的Ag/AgCl电极(4)；与介质一同沉积在覆盖有所述第一银层的石墨层的所述工作区域上的乳酸氧化酶(5)；在所述支持物(1)上承载的银/氯化银电极(4)及酶与介质的工作电极；所述方法包括，(a)通过任意传统方法在电绝缘基础支持物上沉积一对银层；(b)通过任意传统方法在所述银层上沉积一对石墨层，所述银层中的每一层被一石墨层沉积，在所述银层面对所述基础支持物表面的背离面所述第一石墨层完全覆盖所述第一银层，及所述第二石墨层部分地覆盖所述第二银层；(c)在第二银层的未沉积石墨层的所述第二银层部分沉积氯化银层以获得银/氯化银电极；(d)在沉积于银层上的所述第一石墨层上，通过物理性吸附含有电子介质的乳酸氧化酶以获得工作电极；及(e)在以上所述第一参考电极和第二工作电极上应用外层亲水膜获得在电绝缘基础支持物上单组件的预期电极对。
在本发明的一个实施方案中，所述电绝缘基础支持物包括聚氯乙烯。
在本发明的另一实施方案中，所使用的银层是通过丝网印刷步骤来涂敷的。
在本发明的另一实施方案中，所使用的石墨层是通过丝网印刷步骤来涂敷的。
在本发明的另一实施方案中，被测样品是体积为25-30μl的乳酸水溶液或血液样品。
在本发明的另一实施方案中，所使用的电子介质选自铁氰化钾和二茂铁。
在本发明的另一实施方案中，连接电极末端区域是用于将电极连接到电计的区域。
在本发明的另一实施方案中，所述亲水性膜是用尼龙或聚酯制造的。
附图简要说明

图1所示为本发明生物传感条的示意图。
图2所示为本发明乳酸生物传感条对标准乳酸检测样品的反应曲线。
图3所示为实验室中制备的标准乳酸检测样品的传感器校准曲线。
图4所示为本发明乳酸条的有效期稳定性特征。
发明的详细描述如图1所示，本发明包括支持电极组件(2)、(3)、(4)和(5)的电绝缘基础支持物(1)。电极组件包含两种电极系统工作电极系统(2)、(3)和(5)，该系统由石墨层沉积其上的银层、以及吸收于无机基质中的酶和介质层所构成。另一电极组件包括其上部分沉积有石墨层和银/氯化银层的银层构成的参考电极。图1所示为包含电极支持物基片的PVC基片(i)。导电性的银轨(ii)在所述导电性的银轨表面上丝网印刷导电石墨层(iii)，以使所述传感器与读数装置连接。
所述靶区域由所述工作电极(iv)及通过丝网印刷涂敷于轨末端的参考电极(v)组成。在印好的电极上涂敷一绝缘层对它们起保护作用；可用一种或更多说明将主要部分包被。导电性的石墨轨(ii)未伸展到所述参考电极和所述银轨的全长。
为实现对该生物传感条的校正，将该条用于检测当乳酸浓度处于1-8mM时溶液中的电流。检测每一个浓度的检测电流并作图，如图2所示。在图2中，曲线(1)是对应1mM乳酸溶液的反应曲线，曲线(2)对应的是2mM溶液，曲线(3)对应的是4mM溶液，曲线(4)对应的是6mM溶液，曲线(5)对应的是5mM溶液。这说明，如果个体中的浓度范围在1-8mM区域，本发明的生物传感条就可用于检测血液样品中的乳酸。通过分析该条电流的时间变化就能确定与获得稳定电流值所需要的反应时间相关的该系统的敏感性。这包括从标准检测溶液液滴放置到所述条上的时间开始进行电流检测直到电流渐进地达到稳定值的时间。观察到(图3)电流在30-40秒达到稳定值。通过检测储存不同时间段的传感器条上因已知浓度乳酸所产生的电流来确定有效期特征。数据如图4所示。在图4中，曲线(1)对应保存于冷藏条件(4℃)下的传感条而曲线(2)对应保存于25-30℃的传感条。
本发明提供了一个制备乳酸传感器条的方法，其包括为形成所述电极中的每一所述电极，通过涂敷银层，从而在基片上形成第一和第二电极；在所述第二电极的操作区域涂敷石墨层至氯化银；在第一电极工作区域的石墨层上涂敷介质和酶。在所述第一电极的区域应用外亲水性膜。优选地通过丝网印刷的步骤涂敷所述银层和石墨层。
本发明的主要特点在于传感器是干条传感器。发现在可检测乳酸浓度的预期范围内，在湿传感器系统中采用试剂相似的混合并不能产生较好的结果。本发明包含对电极组件起支持作用的基片，所述电极组件包括两种电极系统，被所述基片支持并以相互间隔关系沉积的工作电极与另一个作为参考电极的电极。所述乳酸传感条包括承载有第一电极或工作电极及第二电极或参考电极的基片，所述电极以相互间隔的关系来沉积。所述第一电极是工作电极且具有穿过操作区域伸入工作区域的末段。第二电极是参考电极且具有穿过操作区域伸入工作区域的末段。在这两种情况下，对于所述第一和第二电极的基础传导层，各自末端的材料是不同的。
将商业获得的乳酸氧化酶混合在磷酸缓冲液中，然后将适量的该溶液注射到预先印制的工作电极上。使该溶液在允许的温度下干燥，随后进行i.导电性轨的印刷，ii.参考电极的印刷，iii.工作电极的印刷，iv.膜在电极上的固定。
沿着操作和工作区域，所述工作电极和参考电极各自包含银材料基础导电层。石墨层沉积于所述工作电极的银层上并延伸到所述末端；所述石墨层涂敷于所述参考电极的操作区域并延伸到所述末端。Ag/AgCl沉积于所述参考电极的靶区域。工作电极包含带有介质复合物和乳酸氧化酶的传导性表面。当这种催化活性发生时，介质化合物从所述酶向所述电极转移电极。在所述电极的工作区域上必须提供亲水性膜。所述表面活性剂可以破坏血液中的脂蛋白复合体，乳酸随后被乳酸氧化酶氧化为丙酮酸。所述介质化合物在所述电极上被电化学地还原产生在所述电极中可被检测的电流，该电流与乳酸氧化的活性相关，由此得出样品中存在的乳酸量，该电流通过一系列偶联反应产生
氧化还原介质在基础电极被氧化并产生与乳酸浓度成比例的电流。可以通过任意常规的电子系统对该电流进行测量。
下列给出的实施例仅作为示例说明，不应该被解释为对本发明范围的限制。
实施例1含介质的石墨糊的制备在乙二醇一丁醚中将100mg石墨粉和聚乙烯吡咯啉(粘合剂)与0.01M铁氰化钾(介质)进行混合制备丝网可印刷的工作电极石墨糊。
实施例2干燥条的制备将所商业获得的含有2U乳酸氧化酶的乳酸氧化酶溶液(2μl)在混有石墨电极介质的传感条上进行物理吸收并保持在25℃过夜干燥。将所述干燥的电极包被一层亲水性尼龙膜。在对膜进行应用之前，将其放入含有10％表面活性剂(Tween 80)的蒸馏水中一段时间，随后将干燥的膜固定于所述条上。
实施例3乳酸标准乳酸溶液的制备在0.1M磷酸缓冲液中制备10mM储备乳酸溶液。使用磷酸缓冲液对所述储备溶液进行稀释得到2mM，4mM，6mM和8mM的标准溶液。
实施例4酶储备溶液的准备将15mg乳酸氧化酶溶解于100μl、0.1M的磷酸缓冲液中，得到浓度为5U/μl的储备溶液，为了得到酶的工作溶液，将所述储备液再稀释到1U/μl。
实施例5介质混合的石墨干燥条上的酶的固化2μl含有2U乳酸氧化酶的酶溶液在介质混合的石墨电极条上进行物理吸收并保持在25℃过夜干燥。将干燥的电极包被一层亲水性尼龙膜。在对所述膜进行应用之前，将其放入含有10％表面活性剂(Tween 80)的蒸馏水中一段时间，随后将干燥的膜固定于所述的条上。
实施例6酶活性采用Sigma的乳酸氧化酶活性规程来对乳酸氧化酶活性进行估计。其基本原理是乳酸氧化酶可将L-乳酸转化为丙酮酸和H2O2。H2O2随后在4-氨基安替吡啉(4AAP)和二甲基苯胺(DMA)存在时被过氧化物酶转化为一种显色染料。
在温度为37℃、pH为6.5的最适条件时，该染料可在光程为1cm、565nm处产生吸收。
通过以下公式计算所述固化酶的活性U cm-2＝AV/∈t s其中A为孵育前后的吸光度变化V是总体积(3ml)∈是醌二亚胺染料在565nm的毫摩尔消光系数(35.33)
t是反应时间(10分钟)s是酶电极的表面积发现在所述工作石墨条上固化的LOD的酶活性为是75％。
实施例7安培计反应的研究乳酸生物传感条包含作为工作电极的在石墨表面固化的酶(LOD)和连接于电计的输入端的Ag/AgCl参考电极，以0.4V偏执电压极化所述的乳酸生物传感条，来进行对乳酸(1-8mM)的安培计校准反应的测量(图2)。在8mM乳酸溶液中可获得60μA的最大电流，浓度再高的话也不能观察到电流的显著变化。对每种浓度的乳酸来说(图3)，乳酸溶液(1-8mM)的反应时间为40秒。结果具有5％以内的重复性。以下原理涉及到安培计的测量
本发明的优势1.乳酸生物传感条使得对样品中乳酸进行快速评估。
2.在冷藏条件下样品的有效期达4个月。
3.在1-8mM的乳酸浓度，所述条具有线性反应。
4.所述条是一次性使用的不会引起任何环境危害。
5.所述条可被甚至是没有经过正式医疗训练的人容易地使用。
权利要求
1.制备乳酸生物传感条的方法，所述生物传感条包含电绝缘基础支持物(1)；一对沉积于其表面上分隔的第一和第二银层(2)；一对石墨层，所述石墨层对的每一石墨层都沉积于各自的一银层上并与各自的银层(2)电性相连；完全被所对应的石墨层所覆盖的第一银层；留出未被覆盖的末端和工作区域后，在其中间部分地被各自的石墨层覆盖的第二银层；在所述第二银电极层的工作区域表面上提供的Ag/AgCl电极(4)；与介质一同沉积在覆盖第一银层的石墨层工作区域上的乳酸氧化酶(5)；在所述支持物(1)上承载的所述银/氯化银电极(4)及酶与介质层的工作电极(5)；覆盖有亲水性膜的银/氯化银参考电极(4)和工作电极(5)的工作区域；表现出75％的活性以及30-40秒的乳酸检测反应时间范围的本发明所述乳酸生物传感条；在冷藏条件下有效期约为4个月而在室温条件下(25-30℃)约为2个月；本发明的传感条是一次性使用的；所述方法包括，(a)在电绝缘基础支持物上沉积一对银层；(b)在所述银层上沉积一对石墨层，所述银层中的每一层被沉积上一石墨层，第一石墨层完全覆盖第一银层，且第二石墨层在其面对所述基础支持物的背离面上仅部分地覆盖第二银层；(c)在未沉积石墨层的第二银层部分沉积上氯化银层获得银/氯化银电极；(d)在沉积于银层上的第一石墨层上，通过物理性吸附含有电子介质的乳酸氧化酶以获得工作电极；及(e)在以上所述第一参考电极和第二工作电极上应用外层亲水膜获得在电绝缘基础支持物上单组件形式的预期电极对。
2.如权利要求1所述方法，其中所用的电绝缘基础支持物是聚氯乙烯。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述银层是通过丝网印刷的步骤涂敷的。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述石墨层是通过丝网印刷的步骤涂敷的。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述检测样品是体积为25-30μl的乳酸水溶液或血液样品。
6.如权利要求1所述的方法，其中所用的电子介质选自于铁氰化钾和二茂铁。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述电极的工作区域是用来分配分析物样品的靶区域。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述电极的连接末端区域是用来将电极与电计相连接的区域。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述亲水性膜是由尼龙或聚酯制造的。
全文摘要
本发明提供了用于样品中乳酸分析的乳酸生物传感条的制造方法，所述传感器包括导电材料的干条传感器，其至少含有i)外表面。ii)丝网印刷的参考电极及，iii)丝网印刷的工作电极。
文档编号C12Q1/00GK1742092SQ02830192
公开日2006年3月1日 申请日期2002年12月31日 优先权日2002年12月31日
发明者马诺伊·库马尔·潘迪, 阿沙·乔贝, 克里尚·康德·潘德, 拉金德拉·库马尔·夏尔马, 克里尚·库马尔·萨伊尼, 班西·达尔·马尔霍特拉, 拉杰什 申请人:科学与工业研究委员会