利用l-乳酸生物合成s-1,2-丙二醇的方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备S-1,2-丙二醇的方法。本发明所提供的制备S-1,2-丙二醇的方法具体包括用重组生物细胞将L-乳酸或其盐转化为S-1,2-丙二醇的步骤；所述重组生物细胞表达具有将L-乳酸或其盐转化为S-1,2-丙二醇功能的酶系统。所述酶系统包括如下（a1）-（a3）：（a1）具有将L-乳酸或其盐转化为L-乳酰辅酶A功能的酶1；（a2）具有将所述L-乳酰辅酶A转化为L-乳醛功能的酶2；（a3）具有将所述L-乳醛转化为S-1,2-丙二醇功能的酶3。本发明对建立拥有自主产权的、原料价格低廉的、合成途径全新的、转化效率较高的S-1,2-丙二醇的生物合成方法具有重要意义。
【专利说明】利用L-乳酸生物合成S-1 ’ 2-丙二醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种制备S-1，2-丙二醇的方法，特别涉及一种利用重组大肠杆菌将L-乳酸及其盐形式转化为S-1，2-丙二醇的方法。
【背景技术】
[0002]丙二醇的结构区别将其区分为1，2-丙二醇和1，3-丙二醇。1，2-丙二醇主要用来生产不饱和聚酯树脂、防冻剂、增塑剂替代乙二醇用于防冻飞行器及在食品中作冷却剂和热载体等，它还可用于非离子洗涤剂或保湿剂。丙二醇还是良好的溶剂，可用于食品调味品和香料，或医药工业的软膏油膏等。
[0003]光学活性1，2-丙二醇具有活性基团，可作为手性起始物用于药物、除草剂、信息素和液晶的合成，具有很高的研究价值。大肠杆菌中自身存在有生成1，2_丙二醇的代谢通路。在代谢L-鼠李糖和L-岩藻糖途径中，磷酸化后的糖由醛缩酶催化生成L-乳醛和二羟丙酮磷酸(DHAP)，后在厌氧的条件和NADH存在下L-乳醛被催化为L-1，2-丙二醇，即S-1.2-丙二醇。但由于原料价格过高，此通路并没有很好经济效益，所以没有很好的研究价值。在嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)中也有从甲基乙二醒(methylglyoxal)分别生成乳醒(Lactaldehyde)或丙酮醒(Acetol)最终生成1，2_丙二醇的路径，但其中有些路径只是猜想的，目前并没有证据表明存在实际的酶去催化。
[0004]关于生物催化合成R-1，2-丙二醇的研究，目前，国外已有关于生物催化合成R-1，2-丙二醇的报道，Tadashi等采用气升式发酵罐对酵母还原丙酮醇生成R_l，2-丙二醇和酵母氧化拆分外消旋1，2-丙二醇进行了研究，但仍未得到工业化应用，而国内少有报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种制备S-1，2-丙二醇的方法，具体为利用L-乳酸生物合成S-1，2-丙二醇的方法。
[0006]本发明所提供的一种制备S-1，2-丙二醇的方法，包括用重组生物细胞将L-乳酸或其盐转化为s-l，2-丙二醇的步骤；所述重组生物细胞表达具有将L-乳酸或其盐转化为S-1, 2-丙二醇功能的酶系统。
[0007]在上述方法中，所述将L-乳酸或其盐转化为S-1，2-丙二醇，具体包括如下(O- (3)的步骤:
[0008](1)将L-乳酸或其盐转化为L-乳酰辅酶A ；
[0009](2 )将所述L-乳酰辅酶A转化为L-乳醛；
[0010](3)将所述L-乳醛转化为S-12-丙二醇。
[0011]在上述方法中，所述酶系统具体包括如下(al) - (a3):
[0012](al)具有将L-乳酸或其盐转化为L-乳酰辅酶A功能的酶I ;
[0013](a2)具有将所述L-乳酰辅酶A转化为L-乳醛功能的酶2 ；[0014](a3)具有将所述L-乳醛转化为S_l，2_丙二醇功能的酶3。
[0015]在本发明中，所述酶I为丙酰辅酶A转移酶；所述酶2为辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶；所述酶3为3-羟基丙酸脱氢酶。
[0016]进一步,所述丙酰辅酶A转移酶为丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的丙酰辅酶A转移酶的点突变蛋白，其氨基酸序列具体如序列表中序列I所示；所述辅酶A依赖型琥拍酸半醒脱氢酶为小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)的辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶，其氨基酸序列具体如序列表中序列2所示；所述3-羟基丙酸脱氢酶为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的3_羟基丙酸脱氢酶，其氨基酸序列具体如序列表中序列3所示。
[0017]其中，序列I由524个氨基酸组成；序列2由462个氨基酸组成；序列3由292个
氨基酸组成。
[0018]所述重组生物细胞是将如下编码基因导入目的生物细胞后得到的表达所述酶系统的重组生物细胞: [0019]如序列表中序列4所示的所述丙酰辅酶A转移酶的编码基因；
[0020]如序列表中序列5所示的所述辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶的编码基因；
[0021]如序列表中序列6所示的所述3-羟基丙酸脱氢酶的编码基因。
[0022]其中，序列4由1575个核苷酸组成，编码序列表中序列I所示的蛋白；序列5由1389个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的蛋白；序列6由879个核苷酸组成，编码序列表中序列3所示的蛋白。
[0023]在本发明的一个实施例中，将所述酶系统的编码基因导入目的生物细胞，具体为通过将携带并表达所述酶系统的编码基因的重组质粒导入所述目的生物细胞中实现的。所述重组质粒具体为下述重组质粒A和下述重组质粒B。
[0024]在上述方法中，所述生物细胞可为微生物细胞、动物细胞或植物细胞。
[0025]在本发明的一个实施例中，所述生物细胞具体为大肠杆菌，如大肠杆菌Origami(DE3)。
[0026]进一步，所述重组生物细胞为下述的重组大肠杆菌I。
[0027]在本发明的一个实施例中，所述方法中，所述“用重组生物细胞将L-乳酸或其盐转化为S-1，2-丙二醇”具体为用所述重组生物细胞将L-乳酸钠转化为S-1，2-丙二醇。
[0028]在所述方法中，所述“用重组生物细胞将L-乳酸或其盐(如L-乳酸钠)转化为S-12-丙二醇”具体包括如下(A)和(B)的步骤:
[0029](A)向0D600=0.6的所述重组大肠杆菌I的培养液中加入终浓度为0.2%(0.2g/100mL)的L-阿拉伯糖，37°C 180rpm震荡培养，Ih后加入终浓度为0.05mM的IPTG，转至20°C 180rpm震荡培养16_18h ；
[0030](B)收集菌体，先用浓度为0.9% (0.9g/1OOmL)的NaCl水溶液洗两次，后用IOOmM磷酸盐缓冲液(PH7.4)重悬至0D600=30，加入终浓度为IOOmM的L-乳酸或其盐(如L-乳酸钠)，370C，200rpm,培养48h，从培养液中获得S-1，2-丙二醇。
[0031]本发明的再一个目的是提供如下(I)或(II)或(III)的生物材料。
[0032](I)如下DNA片段中的全部或部分:
[0033](bI)核苷酸序列为序列表中序列4所示的DNA片段(丙酸梭菌(Clostridiumpropionicum)的丙酰辅酶A转移酶的点突变优化后核苷酸序列)；
[0034](b2)核苷酸序列为序列表中序列5所示的DNA片段(小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)的辅酶A依赖型琥拍酸半醒脱氢酶的优化后核苷酸序列)；
[0035](b3)核苷酸序列为序列表中序列6所示的DNA片段(蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)的3_羟基丙酸脱氢酶的优化后核苷酸序列)；
[0036]以上所述优化为在不改变相应酶的氨基酸序列的前提下，将野生型基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子。
[0037](II)重组质粒A和/或重组质粒B:
[0038]所述重组质粒A为携带并表达(bl)中所述DNA片段的重组表达载体；所述重组质粒B为携带并表达(b2)中所述DNA片段和(b3)中所述DNA片段的重组表达载体。
[0039]在所述重组质粒A中，启动(bl)中所述DNA片段转录的启动子为araBAD启动子；在所述重组质粒B中，启动(b2)中所述DNA片段和(b3)中所述DNA片段转录的启动子均为T7启动子。
[0040]具体的，所述重组质粒A为在pBAD43载体的多克隆位点(如EcoR I和Hind III)处插入序列表中序列4所示DNA片段后得到的重组质粒(pBAD-pct);所述重组质粒B为在pETDUET-Ι载体的多克隆位点I (如Nco I和Hind III)处插入序列表中序列5所示DNA片段，同时在多克隆位点2 (如Nde I和Xho I)处插入序列表中序列6所示DNA片段后得到的重组质粒(pETDUET-pm)。
[0041](III)重组大肠杆菌I或/和重组大肠杆菌2或/和重组大肠杆菌3:
[0042]所述重组大肠杆菌I为携带`(II)中所述重组质粒A和所述重组质粒B，并表达(bl)中所述DNA片段、(b2)中所述DNA片段和(b3)中所述DNA片段的大肠杆菌；
[0043]所述重组大肠杆菌2为携带(II)中所述重组质粒A，并表达(bl)中所述DNA片段的大肠杆菌；
[0044]所述重组大肠杆菌3为携带(II)中所述重组质粒B，并表达b2)中所述DNA片段和(b3)中所述DNA片段的大肠杆菌。
[0045]在本发明的一个实施例中，所述重组大肠杆菌I为采用所述重组质粒A和所述重组质粒B共转化大肠杆菌Origami (DE3)后，得到的表达所述酶1_酶3的大肠杆菌。
[0046]当然，只要是采用本发明所提供的利用L-乳酸生物合成S-1，2-丙二醇的三步反应，或是其中的若干步反应，来合成s-l，2-丙二醇，则含有(bl)- (b3)所述DNA片段，或是其中的若干DNA片段的表达盒、重组细胞系，以及除上述重组大肠杆菌外的其他重组菌也均属于本发明的保护范围。
[0047]所述生物材料在利用L-乳酸或其盐(如L-乳酸钠)合成S-1，2-丙二醇中的应用也属于本发明保护范围。
[0048]本发明建立了全新的以L-乳酸或其盐(如L-乳酸钠)为原料，通过生物合成途径制备S-1, 2-丙二醇的方法。本发明对建立拥有自主产权、原料价格低廉、合成途径全新、转化效率较高的S-1，2-丙二醇生物合成方法具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0049]图1为重组表达载体pBAD-pct、中间质粒pETDUET-pdcd和重组表达载体pETDUET-pm的酶切鉴定图谱。其中，泳道M为DNA分子量标准；泳道I和3为重组表达载体pBAD-pct的BamH I单酶切结果；泳道2和4为未经酶切的重组质粒pBAD-pct对照；泳道5和6为中间质粒pETDUET-pdcd的Sph I单酶切结果；泳道7和8为重组表达载体pETDUET-pm的BsaA I单酶切结果。
[0050]图2 为 S-1, 2-丙二醇标准品和重组菌株 Origami (DE3) /pBAD-pct/pETDUET-pm的发酵滤液的HPLC图谱的HPLC图谱。其中，a)为S-1，2-丙二醇标准品的HPLC图谱；b)为重组菌株Origami (DE3) /pBAD-pct/pETDUET-pm的发酵滤液的HPLC图谱。
[0051]图3 为 S-1, 2-丙二醇标准品和重组菌株 Origami (DE3) /pBAD-pct/pETDUET-pm的发酵滤液的质谱鉴定结果图谱。其中，A为S-1，2-丙二醇标准品；B为重组菌株Origami(DE3) /pBAD-pct/pETDUET-pm的发酵滤液由乙酸乙酯萃取后样品
【具体实施方式】
[0052]本发明中制备S-1，2-丙二醇的方法，是在生物细胞中通过酶系统将L-乳酸或其盐(如L-乳酸钠)转化为S-1，2-丙二醇。具体包括如下三步骤:
[0053](I)将L-乳酸或其盐转化为L-乳酰辅酶A ；
[0054](2 )将所述L-乳酰辅酶A转化为L-乳醛；
[0055](3)将所述L-乳醛转化为S-1, 2-丙二醇。
[0056]以上6步反应顺次所·对应的酶为如下(al) - (a3):
[0057](al)具有将L-乳酸或其盐转化为L-乳酰辅酶A功能的酶1，如丙酰辅酶A转移酶；
[0058](a2)具有将所述L-乳酰辅酶A转化为L-乳醛功能的酶2，如辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶；
[0059](a3)具有将所述L-乳醛转化为S-1，2-丙二醇功能的酶3，如3-羟基丙酸脱氢酶。
[0060]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0061]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0062]pBAD43载体:Addgene公司，产品目录号为VYA0258。
[0063]pETDUET-Ι载体:Novagen公司，产品目录号为71146。
[0064]大肠杆菌Origami (DE3):Novagen公司，产品目录号为70627。
[0065]实施例1、用于生物合成S-1，2-丙二醇的重组大肠杆菌的构建
[0066]一、重组表达载体pBAD-pct和pETDUET-pm的构建
[0067]1、3步催化反应中步骤(1)所用酶基因的选择及优化
[0068]针对3步反应中步骤(1)的催化反应,选取丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的丙酰辅酶A转移酶的基因(pet)的CDS全序列(GenBank:AJ276553.1的第485-2059位)，经过设计和反复验证得到适合于在大肠杆菌中表达的优化型丙酰辅酶A转移酶基因序列，即将野生型丙酰辅酶A转移酶基因序列在不改变氨基酸序列的前提下转变成大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子优化序列，从而提高丙酰辅酶A转移酶在大肠杆菌培养环境中的表达水平。
[0069]接着，根据相关文献报道(TaekHo Yang, Tae Wan Kim, Hye Ok Kang, Sang-HyunLee，Eun Jeong Lee, Sung-Chul Limj Sun Ok 0h，Ae-Jin Song, Si Jae Park, Sang Yup Lee.Biosynthesis of polylactic acid and its copolymers using evolved propionateCoA transferase and PHA synthase.Biotechnology and Bioengineering,2010，105，I50-160.)，将以上所得的优化型丙酰辅酶A转移酶基因序列中对应于丙酰辅酶A转移酶蛋白氨基酸序列第193位Val的三个核苷酸改为大肠杆菌偏好(高频使用)的编码Ala的密码子，旨在减小蛋白表达过程中外源蛋白对宿主大肠杆菌的抑制作用(参考文献“TaekHo Yang, Tae Wan Kim, Hye 0k Kang, Sang-Hyun Lee, Eun Jeong Lee, Sung-Chul Lim, Sun0k Oh, Ae-Jin Song, Si Jae Park, Sang Yup Lee.Biosynthesis of polylactic acidand its copolymers using evolved propionate CoA transferase and PHA synthase.Biotechnology and Bioengineering, 2010, 105, 150-160.” 中有报道)。
[0070]根据上述方法，最终获得按大肠杆菌偏好设计的优化型点突变丙酰辅酶A转移酶编码基因，其基因序列为序列表中序列4，共由1575个核苷酸组成。该基因编码的蛋白为序列表中序列I所示氨基酸序列组成的蛋白(即点突变丙酰辅酶A转移酶)，与野生型丙酰辅酶A转移酶基因(GenBank:AJ276553.1的第485-2059位)编码的蛋白相比，其中第193位的 Val 突变为 Ala (V193A)。
[0071]针对步骤(2)的催化反应,选取小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)的辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶的基因(pcdD)，对其采用同上的方式进行密码子优化。优化后的所述辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶基因的核苷酸序列如序列表中序列5所示，共由1388个核苷酸组成。该基因编码序列表中的序列2所示的蛋白质。
[0072]针对步骤(3)的催化反应,选取腊样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的3_羟基丙酸脱氢酶的基因(_sB)，对其采 用同上的方式进行密码子优化。优化后的所述3-羟基丙酸脱氢酶基因的核苷酸序列如序列表中序列6所示，共由879个核苷酸组成。该基因编码序列表中的序列3所示的蛋白质。
[0073]2、重组表达载体pBAD-pct的构建
[0074]以序列表中序列4所示DNA片段为模板，用引物I和引物2进行PCR扩增。
[0075]引物1:5’ -GAGGAATTCATGCGCAAAGTTCCGATTA-3，(下划线部分为限制件内切酶EcoRI的识别序列，其后的序列为序列4的第1-19位)；
[0076]引物2:5’ -CCGGAAGCTTAGCTTTTCATTTCTTTCAGG-3> (下划线部分为限制性内切酶Hind III的识别序列，该序列的第9-30位为序列4的第1554-1575位的反向互补序列)。
[0077]用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切PCR扩增产物，胶回收后与经过同样双酶切的PBAD43载体骨架大片段相连，得到重组质粒。将经过限制性内切酶BamH I单酶切初步鉴定正确(目的条带752bp和6956bp，图1中的泳道I和3)的重组质粒送样测序。将经测序表明在PBAD43载体的多克隆位点EcoR I和Hind III之间插入序列表中序列4所示DNA片段后得到的重组质粒命名为pBAD-pct。在重组表达载体pBAD-pct中，启动序列4所示DNA片段转录的启动子为araBAD启动子。
[0078]3、重组表达载体pETDUET-pm的构建
[0079]以序列表中序列5所示DNA片段为模板，用引物3和引物4进行PCR扩增，得到PCR产物I。以序列表中序列6所示DNA片段为模板，用引物5和引物6进行PCR扩增，得到PCR产物2。
[0080]引物3:5’-GAGTCATGAACACCAACGATCTGGAATC-3，(下划线部分为限制性内切酶BspHI的识别序列，该序列的第6-28位为序列5的第1-23位)；[0081 ]引物4:5’-CGCAAGCTTAACGGATAGAAAAACCATT-3’ (下划线部分为限制性内切酶HindIII的识别序列，该序列的第8-28为序列5的第1369-1389位的反向互补序列)。[0082]引物5:5 ’ -CGCGCTAGATGGAACATAAAACTTTATCA-3，(下划线部分为限制性内切酶Bfa I的识别序列，其后的序列为序列6的第1-21位)；[0083]引物6:5，-GCGCTCGAGTTACCCCCTTATATATTTT-3，(下划线部分为限制性内切酶 XhoI的识别序列，其后的序列为序列6的第861-879位的反向互补序列)。[0084]用限制性内切酶BspH I (与Nco I为同尾酶)和Hind III双酶切PCR产物1，胶回收后与经过Nco I和Hind III双酶切的pETDUET-Ι载体骨架大片段相连，得到中间质粒pETDUET-pdcd。将中间质粒pETDUET-pdcd用限制性内切酶Sph I单酶切，结果得到大小约为1222bp和5513bp的两个目的条带(图1中的泳道5和泳道6)，与预期结果一致，证明中间质粒pETDUET-pdcd构建正确。[0085]再用限制性内切酶Bfa I和Xho I双酶切PCR产物2，胶回收后与经过Nde I (与Bfa I为同尾酶)和Xho I双酶切的中间质粒pETDUET-pdcd骨架大片段相连，得到重组质粒。将重组质粒用限制性内切酶BsaA I单酶切，结果得到大小约为1708bp、2270bp和3584bp的三个目的条带(图1中的泳道7和泳道8)，与预期结果一致。[0086]将以上经酶切鉴定初步证实构建正确的重组质粒送样测序，将经测序表明在pETDUET-Ι载体的多克隆位点Nco I和Hind III和之间插入序列表中序列5所示DNA片段，同时在多克隆位点Nde I和Xho I之间插入序列表中序列6所示DNA片段后得到的重组质粒命名为pETDUET-pm。在重组表达载体pETDUET-pm中，启动序列5所示DNA片段转录的启动子和启动序列6所示DNA片段转录的启动子均为T7启动子。[0087]二、用于从L-乳酸或其盐合成S-1，2-丙二醇的重组大肠杆菌的构建[0088]将步骤一中的重组表达载体pBAD-pct和pETDUET-pm共转化进入大肠杆菌0rigami(DE3)中，转化后涂布到含有100 μ g/mL氨苄霉素和100 μ g/mL壮观霉素的LB固体培养基平板上进行压力筛选，挑取若干个单菌落，接种到含100 μ g/mL氨苄霉素和100 μ g/mL壮观霉素的LB液体培养基中，37°C剧烈振荡培养过夜。以菌液为模板，分别用引物对I(引物I/引物2)、引物对2 (引物3/引物4)、引物对3 (引物5/引物6)进行PCR扩增，分别能扩增得到大小约为1580bp、1396bp和885bp的目的条带的单克隆菌株为阳性重组菌株，命名为 0rigami(DE3)/pBAD-pct/pETDUET-pm。实验同时设置将pBAD43 空载体和 pETDUET-1空载体共转化进入大肠杆菌Origami (DE3)的对照,所得重组菌株命名为Origami (DE3)/pBAD43/pETDUET-l。[0089]实施例2、以L-乳酸钠为底物生物合成S-1，2-丙二醇[0090]一、通过生物发酵将L-乳酸钠转化为S-12-丙二醇[0091]将实施例1构建的重组大肠杆菌Origami (DE3) /pBAD-pct/pETDUET-pm过夜培养，得到种子液，按体积比1%的比例接种到新的LB培养基中，37°C 180rpm震荡培养。当0D600至0.6左右时加入终浓度为0.2% (0.2g/100mL)的L-阿拉伯糖，Ih后加入终浓度为0.05mM的IPTG进行诱导，转至20°C 180rpm震荡培养16_18h。[0092]诱导过后收菌,4°C,5000rpm,离心 lOmin。后用 0.9% (0.9g/100mL)NaCl 洗两次。后用100mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)重悬至0D600约为30左右。加入终浓度为100mM的L-乳酸钠作为底物，37°C，200rpm反应24小时进行全细胞反应。之后，取发酵液，用于进行产物检测。对照菌株Origami (DE3)/pBAD43/pETDUET_l以相同方法进行发酵测试。实验重复三次。其中，IOOmM磷酸盐缓冲液(pH7.4)的配方如下=K2HPO4.3H2018.3g，ΚΗ2Ρ042.7g，定容至IL去离子水中。
[0093]二、目标产物S-1，2-丙二醇的检测
[0094]1、高效液相色谱检测
[0095]S-1, 2-丙二醇标准品溶液的制备:取S-1，2-丙二醇标准品(sigma，目录号540250)，用去离子水配制成适当浓度的溶液。
[0096]待测样品溶液的制备:将步骤一所获得的发酵液，12000rpm, 2min离心后取上清，用0.22 μ m滤膜过滤，得到待上机的待测样品溶液。
[0097]将S-1，2-丙二醇标准品溶液和待测样品溶液均按照如下条件进行HPLC检测:色谱柱为有机酸柱 300mmX7.8mm Aminex HPX-87H(Bio-Rad);流动相为 6mM H2SO4 ;流速为
0.5ml/min ;上样量为10微升；柱温55°C ;示差折光检测器。根据S-1，2-丙二醇标准品溶液和待测样品的HPLC图谱判定步骤一所获得的发酵液中是否含有S-1，2-丙二醇。
[0098]实验同时设置对照菌株Origami (DE3)/pBAD43/pETDUET_l作为对照。
[0099]结果显示，S-1，2-丙二醇标准品的HPLC图谱如图2中a)所示，从图中可以看出，S-1, 2-丙二醇标准品的出峰时间为19.722min。重组菌株Origami (DE3)/pBAD-pct/pETDUET-pm的发酵滤液的 HPLC图谱如图2中b)所示，在与S-1，2-丙二醇标准品保留时间一致的位置也出现了目标峰。而对照菌株Origami (DE3)/pBAD43/pETDUET_l的发酵滤液中则没有该目标峰。根据以上结果，初步判定步骤一所获得的发酵液中含有S-1，2-丙二醇，L-乳酸至S-1, 2-丙二醇的途径已打通。
[0100]2、质谱鉴定
[0101]S-1，2-丙二醇标准品溶液的制备:取S-1，2-丙二醇标准品(sigma，目录号540250)，用乙酸乙酯配制成适当浓度的溶液。
[0102]待测样品溶液的制备:将步骤一所获得的发酵液，12000rpm, 10min，4°C离心，收集上清，调节PH〈2.0，后加入0.5倍体积的乙酸乙酯，萃取收集有机相。
[0103]将S-1，2-丙二醇标准品溶液和待测样品溶液(乙酸乙酯萃取后的有机相)，分别用
0.22微米有机滤膜过滤,分别进行GC/MS测定。具体条件如下:仪器型号=ThermoFisher公司生产的Trace ISQ气相色谱质谱联用仪(气相=Tracel300)。GC条件:色谱柱:TG-WAXMS毛细柱(30mX0.25mmX0.25 μ m)。载气:氦气,流速lml/min。程序升温:80°C维持Imin,后5°C /min升温至200°C,维持5min。进样方式:分流进样，220°C,分流比1:10,1 μ I进样。检测器:ΕΙ源，质谱离子源温度200°C，传输线温度250°C，从9.5min开始质谱检测，质量扫描范围:35-300m/z。
[0104]S-l, 2-丙二醇标准品溶液和待测样品溶液(乙酸乙酯萃取后的有机相)在气相检测的同一保留时间的出峰物质的质谱图分别如图3中A和B所示，从图中可以看出，两质谱图相吻合，证明是同一物质。根据以上结果，进一步判定步骤一所获得的发酵液中含有S-1, 2-丙二醇，L-乳酸至S-1，2-丙二醇的途径已打通。
【权利要求】
1.一种制备s-l，2-丙二醇的方法，包括用重组生物细胞将L-乳酸或其盐转化为S-1, 2-丙二醇的步骤；所述重组生物细胞表达具有将L-乳酸或其盐转化为S-1，2-丙二醇功能的酶系统。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述酶系统包括如下(al)_(a3): (al)具有将L-乳酸或其盐转化为L-乳酰辅酶A功能的酶I ; (a2)具有将所述L-乳酰辅酶A转化为L-乳醛功能的酶2 ； (a3)具有将所述L-乳醛转化为S-1，2-丙二醇功能的酶3。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述酶I为丙酰辅酶A转移酶； 所述酶2为辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶； 所述酶3为3-羟基丙酸脱氢酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述丙酰辅酶A转移酶的氨基酸序列如序列表中序列I所示； 所述辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示； 所述3-羟基丙酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表中序列3所示。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述重组生物细胞是将如下编码基因导入目的生物细胞后得到的表达所述酶系统的重组生物细胞: 如序列表中序列4所示的所述丙酰辅酶A转移酶的编码基因； 如序列表中序列5所示的所述辅酶A依赖型琥珀酸半醛脱氢酶的编码基因； 如序列表中序列6所示的所述3-羟基丙酸脱氢酶的编码基因。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述生物细胞为微生物细胞、动物细胞或植物细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述生物细胞为大肠杆菌。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于:所述重组生物细胞为权利要求9中所述的重组大肠杆菌I。
9.如下(I)或(II)或(III)的生物材料: (I)如下DNA片段中的全部或部分: (bl)核苷酸序列为序列表中序列4所示的DNA片段； (b2)核苷酸序列为序列表中序列5所示的DNA片段； (b3)核苷酸序列为序列表中序列6所示的DNA片段； (II)重组质粒A和/或重组质粒B: 所述重组质粒A为携带并表达(bl)中所述DNA片段的重组表达载体；所述重组质粒B为携带并表达(b2)中所述DNA片段和(b3)中所述DNA片段的重组表达载体。 (III)重组大肠杆菌I或/和重组大肠杆菌2或/和重组大肠杆菌3: 所述重组大肠杆菌I为携带(II)中所述重组质粒A和所述重组质粒B，并表达(bl)中所述DNA片段、(b2)中所述DNA片段和(b3)中所述DNA片段的大肠杆菌； 所述重组大肠杆菌2为携带(II)中所述重组质粒A，并表达(bl)中所述DNA片段的大肠杆菌； 所述重组大肠杆菌3为携带(II)中所述重组质粒B，并表达b2)中所述DNA片段和(b3)中所述DNA片段的大肠杆菌。
10.权利要求9所述的生物材料在利用L-乳酸或其盐合成S-1，2-丙二醇中的应用。
【文档编号】C12R1/19GK103589756SQ201310573064
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月15日 优先权日:2013年11月15日
【发明者】管祥辰, 王丽敏, 于波, 马延和 申请人:中国科学院微生物研究所