一种利用乳酸菌生物合成纳米氧化锌的方法及纳米氧化锌复合饲料添加剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及微生物发酵和纳米【技术领域】，提供了一种利用乳酸菌生物合成纳米氧化锌的方法及纳米氧化锌复合饲料添加剂。本发明利用乳酸菌合成纳米级氧化锌后可开发一种全新的富含纳米氧化锌的饲料添加剂。这种添加剂应用于乳猪饲料中，添加量低于1000ppm（以氧化锌计）。因此除有效防止动物锌中毒，减少锌对环境的污染之外，还能通过乳酸菌和氧化锌的共同作用，有效防止断奶猪仔的腹泻，改善肠道健康水平，甚至可以全部或部分替代抗生素，减少抗生素残留，提高食品安全性能。
【专利说明】一种利用乳酸菌生物合成纳米氧化锌的方法及纳米氧化锌复合饲料添加剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物发酵和纳米【技术领域】，更具体地，涉及一种利用乳酸菌生物合成纳米氧化锌的方法及纳米氧化锌复合饲料添加剂。
【背景技术】
[0002]纳米氧化锌具有独特的性状。纳米氧化锌是一种新型高功能精细无机产品，又称为超微细氧化锌，其粒径一般小于lOOnm。由于颗粒尺寸的细微化，比表面积增加，使纳米氧化锌产生了其本体块状材料所不具备的表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应等。
[0003]纳米氧化锌可作为饲料添加剂。将纳米氧化锌作为饲料添加剂添加到动物饲料中，其高生物活性和吸收率可以有效地减少腹泻，降低料肉比，并且对环境无污染，是代替高剂量普通氧化锌理想的饲料添加剂，在饲料行业的应用前景广阔。
[0004]传统生产方法高能耗高污染。目前纳米氧化锌的工业化生产多采用沉淀法等传统方法。这些传统方法多需要高温等高耗能条件，然而随着科技的进步，未来的纳米材料生产技术将向低成本、低消耗、低污染的方向发展。
[0005]生物合成纳米材料是“绿色”生产。生物合成纳米材料的方法将成为未来纳米材料生产技术的突破口，寻找新的具有较强吸附和还原能力的生物体并优化其还原条件将是这种新技术的主要目标。纳米生物合成技术具有清洁、无毒、环境友好和可持续发展，反应条件温和可控，不需添加任何还原剂，效率高等优点，是一种“绿色”生产方法，是目前纳米合成领域的研究热点。目前人们正尝试以植物、植物细胞以及植物提取物，微生物等生物载体合成纳米材料。
`[0006]微生物合成纳米材料是可行的。微生物在自然界分布广、易分离培养、生长繁殖快、结构简单且培养方法比较简单，作为纳米材料生物合成的载体具有很好的前景。如研究发现，经过矿化后的内孢菌酵母细胞壁上沉积壳鞘状的纳米结构二氧化硅，其厚度约150nm左右；以醋酸铜为原料，氢氧化钠为沉淀剂，在传统直接沉淀法的基础上，以光合细菌培养液为分散剂，制得了纳米氧化铜微粒，平均粒径为40nm左右；从金、银矿中筛选出对银离子具有强吸附能力的乳酸菌，以硝酸银为底物还原银离子。
[0007]因此，利用乳酸菌合成纳米氧化锌、开发富含纳米氧化锌的乳酸菌微生态制剂具有重要的意义。但目前未见相应技术报道。
【发明内容】
[0008]本发明要解决的技术问题是克服传统纳米氧化锌制备工艺中的不足，提供一种利用乳酸菌生物合成纳米氧化锌的方法。
[0009]本发明要解决的另一技术问题是提供所述方法合成的纳米氧化锌。
[0010]本发明要解决的还一技术问题是提供所述纳米氧化锌的应用。
[0011]本发明的目的通过以下技术方案予以实现:提供一种利用乳酸菌生物合成纳米氧化锌的方法，包括以下步骤:
S1.发酵培养乳酸菌，得到发酵液；
S2.在SI得到的发酵液中搅拌加入可溶性锌盐溶液底物，得到混 合液；
S3.调节混合液pH值到6.0~7.0，将混合液置于60~90°C的水浴中孵化10~60分
钟；
S4.将S3孵化后的混合液恒温陈化8~24小时；
S5.陈化后的混合液经离心收集纳米氧化锌和乳酸菌体的混合物；
S6.将纳米氧化锌和乳酸菌体的混合物干燥后得到纳米氧化锌和乳酸菌体，将纳米氧化锌和乳酸菌体的混合物煅烧后得到单一的纳米氧化锌产品。
[0012]其中，SI所述乳酸菌发酵方式为常规发酵或高细胞密度发酵中的一种。
[0013]其中，SI所述的乳酸菌为发明人从断奶乳猪粪便中筛选驯化后得到的锌耐受性较高的唾液乳杆菌L3，所述唾液乳杆菌L3菌株于2013年04月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号是CCTCCM2013126 ;保藏单位的地址为:中国.武汉.武汉大学。也包括且不限于植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、其它市售的唾液乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、粪肠球菌以及屎肠球菌、双歧杆菌等对肠道有益的乳酸菌的一种或几种。
[0014]SI所述发酵培养的条件优选为:
种子培养基和发酵培养基选用MRS液体培养基，pH值为6.2~6.4，121°C湿热灭菌20~30min，冷却至37°C备用；甘油菌种活化培养12~16h后，接入发酵培养基，接种量为3%~5% (V/V)，培养10~12h后加入等体积量的新鲜培养基继续培养8~10h，细胞数达IO9 ~1010CFU/ml。
[0015]所述MRS液体培养基的组成为:
蛋白胨log、牛肉膏10g、酵母浸膏5g、葡萄糖20g、K2HP042g、柠檬酸二胺2g、MgSO4.7Η200.58g、MnSO4.4Η200.25g、吐温 801ml、乙酸钠 10g、水 1000ml, ρΗ6.2 ~6.4，121。。灭菌 15min。
[0016]S2所述发酵液和可溶性锌盐溶液底物等体积量。
[0017]所述可溶性锌盐优选氯化锌(ZnCl2)或硫酸锌(ZnSO4),锌盐浓度为0.1~1.0M。浓度优选为0.35M。
[0018]S3所述水浴的温度优选为80°C，加热时间优选为25min。
[0019]S4所述陈化的温度为37°C，陈化时间为9小时。
[0020]优选地，S5所述离心的条件为3500rpm, 20min。
[0021]优选地，S6所述干燥条件为60~90°C。更为优选地，S6所述干燥条件为80°C恒温干燥箱干燥24h。获得富纳米氧化锌、乳酸菌细胞及其代谢产物的混合物，可作为饲料添加剂。
[0022]优选地，S6所述煅烧条件为500~600°C。更为优选地，S6所述煅烧条件为于550°C煅烧lh。乳酸菌细胞及其他有机物均被灰化，获得更均一的纳米氧化锌，用途更加广泛。
[0023]本发明提供所述方法制备得到的纳米氧化锌。
[0024]本发明同时提供所述纳米氧化锌的应用，可作为一种全新的锌源添加在禽类或者猪的饲料中，尤其是添加于断奶乳猪饲料中。添加量低于lOOOppm。
[0025]本发明的有益效果是:
本发明提供了一种新的制备方法，在乳酸菌发酵液中添加一定浓度的可溶性锌盐底物，经过适宜工艺条件的孵化和陈化后得到含纳米氧化锌的乳酸菌混合液，乳酸菌是人和动物胃肠道的一种共生菌，是人和动物肠道有益菌是共认安全(GRAS)的可直接被人和动物食用的细菌，本发明采用乳酸菌合成纳米氧化锌乳酸菌，有效发挥乳酸菌作为益生菌的重要作用，发挥提高营养物质利用率、预防和治疗疾病、综合调节机体的免疫机能等方面功倉泛。
[0026]本发明开发得到富含纳米氧化锌的乳酸菌微生态制剂。本发明利用乳酸菌合成纳米级氧化锌后可开发一种全新的富含纳米氧化锌的饲料添加剂。这种添加剂应用于乳猪饲料中，添加量低于1000ppm (以氧化锌计)。因此除有效防止动物锌中毒，减少锌对环境的污染之外，还能通过乳酸菌和氧化锌的共同作用，有效防止断奶猪仔的腹泻，改善肠道健康水平，甚至可以全部或部分替代抗生素，减少抗生素残留，提高食品安全性能。
[0027]本发明在乳酸菌转化合成纳米氧化锌过程中，通过精确确定锌盐底物浓度、孵化的水浴温度、孵化时溶液的PH值、孵化时间和陈化的时间，得到形态分布均匀、粒径在IOOnm左右的纳米氧化锌和乳酸菌混合产物，并以此为基础制备由纳米氧化锌和乳酸菌细胞及代谢产物组成的饲料添加剂。
[0028]本发明提供的常温干燥后乳酸菌生物合成的纳米氧化锌、细胞和代谢产物的混合物可作为一种全新的锌源添加在断奶乳猪饲料中，替代普通氧化锌，添加量只有普通氧化锌的二分之一或更低，从而改善断奶猪仔的肠道功能，有效防止腹泻；同时，大大降低由于大剂量添加普通氧`化锌导致的严重的环境污染。
[0029]与现有技术相比，本发明具有如下优势:
(I)本发明将乳酸菌和纳米氧化锌两种物质有机结合，即作为目前普通氧化锌的替代品，使用量小，在改善乳猪肠道功能防止腹泻的同时也有效防止锌中毒，以及普通氧化锌对环境造成的污染。
[0030](2)本发明提供的纳米氧化锌具有很高的光催化活性，能自行分解出自由移动的带负电的电子(e)，同时留下带正电的空穴(h)，形成空穴-电子对，空穴可以激活氧和氢氧根，使吸附于其上的水和空气变成活性的氧和氢氧根，从而具有很强的氧化还原作用，能损伤细菌的细胞膜而达到杀灭细菌的作用。
[0031](3)本发明利用乳酸菌生物合成纳米级氧化锌，与现有传统方法相比，本发明能耗低，简单易行，达到节能减排、绿色生产的目的。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为实施例1利用唾液乳杆菌L3生物方法制备的纳米氧化锌煅烧后产品透射电镜图。
[0033]图2为实施例2利用植物乳杆菌生物制备的纳米氧化锌煅烧后产品透射电镜图。【具体实施方式】
[0034]下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明，除非特别说明，本发明采用的原料和方法、设备为本【技术领域】常规的原料、方法和设备。
[0035]实施例1
利用发明人与2011年06月从断奶乳猪粪便中筛选驯化后得到的高耐锌的唾液乳杆菌L3生物合成的纳米氧化锌产品制备方法包括如下步骤:所述高耐锌的唾液乳杆菌L3菌株于2013年04月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号是CCTCCM2013126。 [0036]S1.乳杆菌的发酵培养。种子培养基和发酵培养基选用MRS液体培养基，pH值为6.2~6.4，121 °C湿热灭菌20~30min，冷却至37°C备用。甘油菌种活化培养12~16h后，接入发酵培养基，接种量为3%~5% (V/V)，培养IOh后加入等体积量的新鲜培养基继续培养8h，细胞数达109CFU/ml，得到发酵液；
S2.SI培养结束后边搅拌边向发酵液中缓慢加入等体积量的0.35MZnCl2溶液。
[0037]S3.调节混合液pH值到6.0，将上述混合液置于80°C水浴中加热25min进行孵化。
[0038]S4.孵化结束后放入37°C恒温箱陈化9h。
[0039]S5.陈化后离心收集菌体和纳米氧化锌沉淀物。
[0040]S6.离心产物80°C恒温干燥箱干燥24h，得到粉末样品；将离心产物550°C煅烧lh，有机物完全灰化，得单一的纳米氧化锌，煅烧得到的单一纳米氧化锌透射电镜图见附图1所示。
[0041]乳酸菌在较高锌离子环境下其菌体细胞壁上吸附有锌结晶体。通过精确限定和控制底物浓度、孵化时间、孵化温度以及陈化时间，可实现控制菌体细胞壁上氧化锌晶体的形成，研究发现在0.35MZnCl2底物浓度、80°C水浴孵化温度、25min孵化时间以及恒温陈化时间为9h时得到的氧化锌晶体粒径在50nm左右，且晶体形状均匀。
[0042]实施例2
利用植物乳杆菌(购于中国工业微生物菌种保藏管理中心)制备纳米氧化锌步骤如下:S1.植物乳杆菌的发酵培养。甘油菌种活化培养16~24h后，接入发酵培养基，接种量为3%~5%V/V，培养14h后加入等量的新鲜培养基继续培养12h，细胞数达109CFU/ml。
[0043]S2.边搅拌边向发酵液中缓慢加入等量的0.35MZnCl2溶液。
[0044]S3.调节混合液pH值至6.0后置于80°C水浴中加热25min进行孵化。
[0045]S4.孵化后放入37°C恒温箱陈化9h。
[0046]S5.陈化后离心收集菌体和纳米氧化锌沉淀物。
[0047]S6.离心产物于550°C煅烧lh，有机物完全灰化，得单一的纳米氧化锌。
[0048]对样品进行透射电镜分析，样品平均粒径约为80nm。纳米氧化锌透射电镜图见附图2所示。
[0049]实施例3
利用植物乳杆菌(购于中国工业微生物菌种保藏管理中心)制备纳米氧化锌步骤如下:
S1.植物乳杆菌的发酵培养。甘油菌种活化培养16~24h后，接入发酵培养基，接种量为3%~5%V/V，培养14h后加入等量的新鲜培养基继续培养12h，细胞数达109CFU/ml。
[0050]S2.边搅拌边向发酵液中缓慢加入等量的0.35MZnS04液。
[0051]S3.调节混合液pH值至6.0后置于80°C水浴中加热25min进行孵化。
[0052]S4.孵化后放入37°C恒温箱陈化9h。
[0053]S5.陈化后离心收集菌体和纳米氧化锌沉淀物。[0054]S6.离心产物90°C恒温干燥箱干燥24h，得到粉末样品。
[0055]实施例4
利用嗜酸乳杆菌(购于中国工业微生物菌种保藏管理中心)生物合成的纳米氧化锌产品制备方法包括如下步骤:
51.乳杆菌的发酵培养。种子培养基和发酵培养基选用MRS液体培养基，pH值为6.2~6.4，121 °C湿热灭菌20~30min，冷却至37°C备用。甘油菌种活化培养12~16h后，接入发酵培养基，接种量为3%~5% (V/V)，培养IOh后加入等体积量的新鲜培养基继续培养8h，细胞数达109CFU/ml，得到发酵液；
52.SI培养结束后边搅拌边向发酵液中缓慢加入等体积量的0.35MZnCl2溶液。
[0056]S3.调节混合液pH值至6.0后置于80°C水浴中加热25min进行孵化。
[0057]S4.孵化结束后放入37°C恒温箱陈化9h。
[0058]S5.陈化后离心收集菌体和纳米氧化锌沉淀物。
[0059]S6.离心产物80°C恒温干燥箱干燥24h，得到粉末样品。
[0060]实施例5
利用保加利亚乳杆菌制备纳米氧化锌步骤如下:
S1.保加利亚乳杆菌(购于广东省微生物菌种保藏中心)的发酵培养。甘油菌种活化培养16~24h后，接入发酵培养基，接种量为3%~5%V/V，培养14h后加入等量的新鲜培养基继续培养12h，细胞数达109CFU/ml。
[0061]S2.边搅拌边向发酵液中缓慢加入等量的0.35MZnCl2溶液。
[0062]S3.调节混合液pH值至6.0后置于80°C水浴中加热25min进行孵化。
[0063]S4.孵化后放入37°C恒温箱陈化9h。
[0064]S5.陈化后离心收集菌体和纳米氧化锌沉淀物。
[0065]S6.离心产物于550°C煅烧lh，有机物完全灰化，得单一的纳米氧化锌。
[0066]对样品进行透射电镜分析，样品平均粒径小于lOOnm。
[0067]实施例6
利用嗜热链球菌制备纳米氧化锌步骤如下:
S1.嗜热链球菌(购于广东省微生物菌种保藏中心)的发酵培养。甘油菌种活化培养16~24h后，接入发酵培养基，接种量为3%~5%V/V，培养14h后加入等量的新鲜培养基继续培养12h，细胞数达109CFU/ml。
[0068]S2.边搅拌边向发酵液中缓慢加入等量的0.35MZnCl2溶液。
[0069]S3.调节上述混合液pH值至6.0后置于80°C水浴中加热25min进行孵化。
[0070]S4.孵化后放入37°C恒温箱陈化9h。
[0071]S5.陈化后离心收集菌体和纳米氧化锌沉淀物。
[0072]S6.离心产物于550°C煅烧lh，有机物完全灰化，得单一的纳米氧化锌。
[0073]对样品进行透射电镜分析， 样品平均粒径小于lOOnm。
[0074]实施例7
利用粪肠球菌制备纳米氧化锌步骤如下:
S1.粪肠球菌(购于中国工业微生物菌种保藏管理中心)的发酵培养。甘油菌种活化培养16~24h后，接入发酵培养基，接种量为3%~5%V/V，培养14h后加入等量的新鲜培养基继续培养12h，细胞数达109CFU/ml。
[0075]S2.边搅拌边向发酵液中缓慢加入等量的0.35MZnCl2溶液。
[0076]S3.调节上述混合液pH值至6.0后置于80°C水浴中加热25min进行孵化。
[0077]S4.孵化后放入37°C恒温箱陈化9h。
[0078]S5.陈化后离心收集菌体和纳米氧化锌沉淀物。
[0079]S6.离心产物于550°C煅烧lh，有机物完全灰化，得单一的纳米氧化锌。
[0080]对样品进行透射电镜分析，样品平均粒径小于lOOnm。
[0081]实施例8
利用屎肠菌制备纳米氧化锌步骤如下:
S1.屎肠球菌(购于中国工业微生物菌种保藏管理中心)的发酵培养。甘油菌种活化培养16~24h后，接入发酵培养基，接种量为3%~5%V/V，培养14h后加入等量的新鲜培养基继续培养12h，细胞数达109CFU/ml。
[0082]S2.边搅拌边向发酵液中缓慢加入等量的0.35MZnCl2溶液。
[0083]S3.调节上述混合液pH值 至6.0后置于80°C水浴中加热25min进行孵化。
[0084]S4.孵化后放入37°C恒温箱陈化9h。
[0085]S5.陈化后离心收集菌体和纳米氧化锌沉淀物。
[0086]S6.离心产物于550°C煅烧lh，有机物完全灰化，得单一的纳米氧化锌。
[0087]对样品进行透射电镜分析，样品平均粒径小于lOOnm。
[0088]实施例9
利用双歧杆菌制备纳米氧化锌步骤如下:
S1.双歧杆菌(购于广东省微生物菌种保藏中心)的发酵培养。甘油菌种活化培养16~24h后，接入发酵培养基，接种量为3%~5%V/V，培养14h后加入等量的新鲜培养基继续培养12h，细胞数达109CFU/ml。
[0089]S2.边搅拌边向发酵液中缓慢加入等量的0.35MZnCl2溶液。
[0090]S3.调节混合液pH值至6.0后置于80°C水浴中加热25min进行孵化。
[0091 ] S4.孵化后放入37°C恒温箱陈化9h。
[0092]S5.陈化后离心收集菌体和纳米氧化锌沉淀物。
[0093]S6.离心产物于550°C煅烧lh，有机物完全灰化，得单一的纳米氧化锌。
[0094]对样品进行透射电镜分析，样品平均粒径小于lOOnm。
[0095]实施例10
利用普通市售的唾液乳杆菌制备纳米氧化锌步骤如下:
S1.唾液乳杆菌(购于中国工业微生物菌种保藏管理中心)的发酵培养。甘油菌种活化培养16~24h后，接入发酵培养基，接种量为3%~5%V/V，培养14h后加入等量的新鲜培养基继续培养12h，细胞数达109CFU/ml。
[0096]S2.边搅拌边向发酵液中缓慢加入等量的0.35MZnC12溶液。
[0097]S3.调节上述混合液pH值至6.0后置于80°C水浴中加热25min进行孵化。
[0098]S4.孵化后放入37°C恒温箱陈化9h。
[0099]S5.陈化后离心收集菌体和纳米氧化锌沉淀物。
[0100]S6.离心产物于550°C煅烧lh，有机物完全灰化，得单一的纳米氧化锌。[0101]对样品进行透射电镜分析，样品平均粒径小于lOOnm。
[0102]实施例11
本发明制备的实施例1中干燥后样品进行致病菌抑菌性能检测。
[0103]分别以大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌作为指示菌，实施例1中的样品与普通氧化锌产品(天津市福晨化学试剂厂生产)进行抑菌性能的检测试验对比，在含培养基试管中分别加入不同浓度的两种产品，37°C摇床300r/min培养24h后采用吸光光度法测61Onm处各试管的OD值。与空白组对照，24h后OD值无明显变化的试管其浓度为该产品的最小抑菌浓度。
[0104]表1为不同氧化锌样品对各致病菌的最小抑菌浓度表
【权利要求】
1.一种利用乳酸菌生物合成纳米氧化锌的方法，其特征在于，包括以下步骤: 51.发酵培养乳酸菌，得到发酵液； 52.在SI得到的发酵液中搅拌加入可溶性锌盐溶液底物，得到混 合液； 53.调节混合液pH值到6.0-7.0,将混合液置于60~90°C的水浴中孵化10~60分钟； 54.将S3孵化后的混合液恒温陈化8~24小时； 55.陈化后的混合液经离心收集纳米氧化锌和乳酸菌体的混合物； 56.将纳米氧化锌和乳酸菌体的混合物干燥后得到纳米氧化锌和乳酸菌体，将纳米氧化锌和乳酸菌体的混合物煅烧后即得到单一的纳米氧化锌产品； 其中，SI所述的乳酸菌为唾液乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖 乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌或双歧杆菌中的一种或几种； S2所述发酵液和可溶性锌盐溶液底物等体积量。
2.根据权利要求1所述利用乳酸菌生物合成纳米氧化锌的方法，其特征在于，所述乳酸菌为唾液乳杆菌L3，所 述唾液乳杆菌L3菌株于2013年04月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号是CCTCC M 2013126。
3.根据权利要求1所述利用乳酸菌生物合成纳米氧化锌的方法，其特征在于，S2所述可溶性锌盐溶液浓度为0.1~1.0M。
4.根据权利要求1所述利用乳酸菌生物合成纳米氧化锌的方法，其特征在于，S2所述可溶性锌盐为氯化锌或硫酸锌。
5.根据权利要求1所述利用乳酸菌生物合成纳米氧化锌的方法，其特征在于，S3所述水浴的温度为80°C，加热时间为25min。
6.根据权利要求1所述利用乳酸菌生物合成纳米氧化锌的方法，其特征在于，S4所述陈化的温度为37°C，陈化时间为9小时。
7.根据权利要求1所述利用乳酸菌生物合成纳米氧化锌的方法，其特征在于，S6所述干燥条件为80~100°C恒温干燥箱干燥20~24h ；S6所述煅烧条件为于550°C煅烧lh。
8.权利要求1~7任一项所述方法制备得到的纳米氧化锌产品。
9.权利要求8所述纳米氧化锌产品作为禽类或猪饲料的添加剂应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，应用于制备断奶乳猪饲料添加剂。
【文档编号】C12R1/225GK103602707SQ201310147492
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年4月25日 优先权日:2013年4月25日
【发明者】胡文锋, 刘小阳, 庞旭, 吴俊松, 郑育鹏, 林晓慧 申请人:胡文锋, 苏州万生源生物科技有限公司, 生物源生物技术（深圳）有限公司