专利名称：制备乳酸菌组合物的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备至少^g(干重)乳酸菌组合物的方法，所述组合物以至 50%的抗坏血酸盐或抗坏血酸(w/w-干物质)作为抗氧化剂进行配制，其中通过添加不包含NH3 (氨)的碱使得在至少大部分发酵过程中pH被控制在3 < pH < 8。
背景技术：
乳酸菌涉及一类革兰氏阳性、不生成芽孢的细菌，其进行糖的乳酸发酵。例如，乳酸菌在商业上广泛地用于制备不同的食品，例如酸乳。此外，很多乳酸菌是益生菌——即，当以足够的量施用时给予宿主(例如人)健康益处的活微生物。乳酸菌产品在商业上常常作为干燥组合物-例如冻干组合物进行销售。干燥组合物可以例如是干燥球团或片剂(例如由磨碎的干燥球团制得)。用于人类或动物消费的乳酸菌(例如干燥的乳酸菌)往往以抗坏血酸或抗坏血酸盐(诸如例如抗坏血酸钠)作为抗氧化剂进行配制——抗坏血酸钠例如改善乳酸菌产品的贮存稳定性。抗坏血酸钠是抗坏血酸的盐(维生素C)，其具有通用的E-编号E301 (参见EU食品添加剂法规)。抗坏血酸钠和抗坏血酸的结构示于本文图1。文章-L. Kurtmann 等人，“Storage stability of freeze-dried
Lactobacillus acidophilus(La~5)in relation to water activity and presence of oxygen and ascorbate";Cryobiology(2009), doi:10. 1016/j. cryobiol. 2008.12.001-于 2008年12月公开在互联网上。L. Kurtmann等的文章描述当抗坏血酸钠存在时，在贮存期间在干燥的嗜酸乳杆菌组合物/样品的表面上观察到粉色/红色颜色(参见例如摘要)。这样的粉色/红色颜色是不希望有的一例如很多消费者不喜欢这样的粉色/红色颜色，因为它可能给干燥的乳酸菌产品带来不健康的“外表”。在发酵过程中，乳酸菌产生乳酸——因此，为了在生产过程中不获得过低的PH，在发酵过程中通过添加碱来控制pH。通常，控制pH使得在发酵过程的至少大部分具有3 < pH < 8，因为乳酸菌通常在 PH低于3不适当地生长。在L. Kurtmann等的文章中，使用了来自Chr. Hansen A/S的嗜酸乳杆菌(La-5 )。 这篇文章泛泛地陈述在发酵过程中PH被控制(参见材料与方法)。没有提及如何进行PH 控制。使用NH3作为碱对于在工业上进行乳酸菌产品的商业相关生产颇为正常——事实上，这也许被认为是“标准”。上文讨论的L. Kurtmann的文章第179页右栏指出来自细菌细胞或来自发酵残余物的氨基可能与不希望有的粉色/红色颜色的产生有关——文章称“当抗坏血酸被氧化称脱氢抗坏血酸并与形成色素的氨基反应时形成红色化合物”。如下进一步论述——事实上，可以说L. Kurtmarm的文章这一披露的理论偏离了本发明的教导(即，不使用包含NH3的碱)。EP-A-1038951 (Nestle[CH])披露了一种用于培养细菌的培养基，所述培养基包含作为抗氧化剂的抗坏血酸，并包含如Na2C03、KH2PO4的缓冲剂(参见第3页、权利要求3和 4)。描述，例如，抗坏血酸简单地作为发酵培养基中适宜的抗氧化剂的例子被提供。换言之，EP-A-1038951没有直接并毫无疑义地披露制备细菌的方法，其中抗坏血酸被添加到收集的细菌浓缩物——即如下所论述，EP-A-1038951没有明确地披露如本文中所述的本发明第一方面(权利要求1)的步骤(iii)。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种制备以抗坏血酸盐或抗坏血酸作为抗氧化剂配制的乳酸菌组合物(例如干燥的组合物)的新方法，其中所述组合物在其贮存过程中不产生显著的粉色/红色颜色。本发明人发现不希望有的粉色/红色颜色产生与以抗坏血酸钠配制的不同乳酸菌培养物相关——即，不仅是L. Kurtmann的文章中分析的嗜酸乳杆菌(La- 5 )组合物/样品。如本文实施例所示——所述粉色/红色颜色也存在于其他的商业相关培养物中， 例如鼠李糖乳杆菌(LGG )、嗜热链球菌(TH-4 )和动物双歧杆菌(BB-12 )培养物。通过对此进一步研究，本发明人发现NH3已被用作用于所分析的 La-5 、LGG 、TH-4 和BB-12 组合物的发酵pH控制的碱。进一步对此工作——本发明人发现通过使用NaOH而不是NH3作为碱——意外地可以产生以抗坏血酸钠配制的干燥的La-5 、LGG 、TH-4 和BB-12 组合物，其中所述组合物在其贮存期间不产生显著的粉色/红色颜色——对于进一步的细节，参见本文实施例。因此，本发明的实质可视为不使用包括NH3(氨)的碱。不囿于理论，认为与使用NH3相关的粉色/红色颜色问题可以由下面的理论解释。氨(NH3)与铵(NH4+)平衡。平衡的pKa为9. 25，意味着在pH < 9. 25，大部分作为铵(NH4+)存在，即在本发明第一方面的步骤(i)中培养物所调节到的pH下带正电。抗坏血酸中两个-OH基的pKa分别为4. 17和11. 6。这意味着pKa为4. 17的-OH 被去质子化，并且在所述抗坏血酸盐分子中会存在负电荷(多电子的)位点。抗坏血酸钠和抗坏血酸的结构示于本文图1。显然，这在大于4的pH最显著——然而，由于平衡效应，它将——如技术人员所知晓的，对于大于3的pH也是相关的。不探究过多的细节——理论的实质在于带正电的NH3(即NH4+) “攻击”所述抗坏血酸盐分子中带负电(多电子的)位点，这引发一系列反应，最后产生这样的化合物，其在贮存期间给出/产生所述不希望有的粉色/红色颜色。对于技术人员显然的——NaOH不具有与NH4+相似的带正电的反应基，这是——根据理论——当使用NaOH作为碱时看不到粉色/红色颜色的根本原因。上文讨论的L. Kurtmann的文章第179页右栏指出来自细菌细胞或来自发酵残余物的氨基可能与不希望有的粉色/红色颜色的产生有关——文章称“当抗坏血酸被氧化为脱氢抗坏血酸并与形成色素的氨基反应时形成红色化合物”。事实上，可以说L. Kurtmann的文章这一披露的理论偏离了本发明的教导(即，不使用包含NH3的碱)。简而言之，可以说L. Kurtmann理论是基于其他的现有技术指示，即可能是氨基与不希望有的粉色/红色颜色的产生有关。总的说来，现有技术中基于氨基的理论可以总结为现有技术引用氨基正在攻击脱氢抗坏血酸(DHA)的羰基碳——这里重要的是注意到羰基碳具有部分的正电荷(即σ +电荷)从而来自所述氨基的单独的电子对可以攻击部分带正电的碳。如上讨论——氨的pKa为9. 25，意味着在pH < 9. 25，大部分作为铵(NH4+)存在， 即在本发明第一方面的步骤(i)中培养物所调节到的PH下带正电。对于技术人员明显的——阳性的氨无法攻击DHA的部分带正电的羰基碳，意味着通过使用L. Kurtmann的文章中描述的理论的“机理”，氨不能参与不希望有的红色/粉色颜色的形成。换言之，可以说L. Kurtmann的文章中描述的氨基相关理论/机制偏离了本发明的教导，因为可以由该L. Kurtmann理论客观地导出/理解氨(即在本文中相关pH的NH4+)不应是“危险”的(即NH4+不应与不希望有的红色/粉色颜色的形成有关)。如技术人员所知晓的——可以常规地识别出NaOH之外的其他不包括NH3 (氨)的碱诸如例如KOH、Na2CO3.此外，对于技术人员明显的，上述理论不仅与抗坏血酸钠相关，而且通常与任何相关的抗坏血酸盐或抗坏血酸相关。如上所论述的，这样的粉色/红色颜色是不希望，因为例如很多消费者不喜欢这样的粉色/红色颜色，因为它可能给乳酸菌产品带来不健康的“外表”。因此，本发明对于乳酸菌组合物在商业上的相关生产是高度相关的，所述组合物通常以工业相关大规模进行生产。因此，本发明的第一方面涉及一种制备至少^ig(干重)的乳酸菌组合物的方法， 所述组合物以至50%的抗坏血酸盐或抗坏血酸(w/w-干物质)作为抗氧化剂进行配制，其中所述方法包括以下步骤(i)在适宜条件下在包含至少100L发酵培养基的发酵罐(生物反应器)中发酵所述乳酸菌，其中通过添加不包括NH3 (氨)的碱使得发酵过程的至少大部分期间pH被控制在3彡pH彡8 ；(ii)收集所述乳酸菌以获得乳酸菌浓缩物；(iii)向所述乳酸菌浓缩物添加抗坏血酸盐或抗坏血酸；以及(iv)以适宜的方式处理步骤(iii)的所述含有抗坏血酸盐或抗坏血酸的浓缩物，以获得以至50%的抗坏血酸盐或抗坏血酸(w/w-干物质)作为抗氧化剂配制的乳酸菌组合物。如技术人员理解的，不除去在收集步骤(ii)中全部的加入的碱。因此，相关量的所述添加的碱存在于所述细菌浓缩物中，因此例如当在步骤(iii)中将抗坏血酸钠添加到浓缩物中时，所述添加的碱也是存在的。如上所论述的，本发明的实质可视为不使用包括NH3(氨)的碱——即步骤(i)中 “添加不包括nh3(氨)的碱”。第一方面的方法的所有其它步骤可以基本上视为根据现有技术所作的常规步骤。常规步骤——诸如例如步骤(i)的在适宜条件下发酵——可以不在本文中进一步详细论述，因为技术人员常规地知晓如何进行这样的现有技术常规步骤。
图1 抗坏血酸钠和抗坏血酸的结构。图2 图2中所示的图片显示在发酵过程中NH3用于pH调节的生产中产生的 BB-12 批次和发酵过程中NaOH用于pH调节的Pilot Plant中产生的两个批次颜色的差
已图3 :图3中的图片显示对于La-5 与图2中相同的内容。
具体实施例方式乳酸菌如上论述的，术语“乳酸菌”涉及一类革兰氏阳性、不生成芽孢的细菌，其进行糖的乳酸发酵。优选地，所述乳酸菌是选自以下组的乳酸菌属于乳酸杆菌属的乳酸菌，诸如瑞士乳杆菌(LactcAacillus helveticus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbruekii subsp. bulgaricus)、发酵乳杆菌 (Lactobacillus fermentum) >(H^ILff lif (Lactobacillus salivarius) IE^IIILff lif (Lactobacillus rhamnosus)；属于乳球菌属的乳酸菌，诸如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；属于链球菌属的乳酸菌，诸如嗜热链球菌(Sti^ptococcus thermophilus)；属于明串珠菌属的乳酸菌，诸如乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)；属于双歧杆菌属的乳酸菌，诸如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、动物双歧杆菌 (Bifidobacterium animal is)或短小双歧杆菌(Bifidobacterium breve)；属于丙酸杆菌属的乳酸菌；属于肠球菌属的乳酸菌，诸如屎肠球菌(Enterococcus faecum)；和属于片球菌属的乳酸菌；.一些文献理论上论述了双歧杆菌属是否是“真正的”乳酸菌。在本文中，双歧杆菌属是乳酸菌。在以上乳酸菌组中，优选至少一种乳酸菌选自属于乳酸杆菌属的乳酸菌；属于链球菌属的乳酸菌；属于双歧杆菌属的乳酸菌；和属于乳球菌属的乳酸菌。
更优选地，所述乳酸菌是选自以下组的乳酸菌嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌和动物双歧杆菌。最优选地，所述乳酸菌是选自以下组的乳酸菌保藏登录号为DSM 13241的嗜酸乳杆菌；保藏登录号为DSM 15954的动物双歧杆菌菌株；和保藏登录号为DSM 15957的嗜热链球菌菌株。所述DSM 13241菌株在本文中可以命名为La-5 ,所述DSM159M菌株在本文中可以命名为BB-12 ,而所述DSM 15957菌株在本文中可以命名为TH-4 。抗坏血酸或抗坏血酸盐如已知的——抗坏血酸盐是抗坏血酸的盐本文可优选使用抗坏血酸钠作为适宜的抗坏血酸盐。其它适宜的抗坏血酸的盐(抗坏血酸盐)的实例包括抗坏血酸钙、抗坏血酸镁或 2-磷酸抗坏血酸三钠。使用抗坏血酸也可以是相关的——然而由于其酸性效果，需要将这考虑在内用于相关的PH调节。乳酸菌组合物所述乳酸菌组合物可以包含一种单一菌株(例如嗜酸乳杆菌(La-5 ))或者它可以包含不同菌株的混合物。它还可以包含非乳酸菌诸如例如酵母。所述组合物的重量为优选至少^g(干重)、更优选至少Mkg(干重)、并最优选至少50kg (干重)。如技术人员所理解的——较高重量的所述组合物与较大的大规模生产相关，这由于显而易见的原因可以是有利的。商业上，多次使用冻干。因此，如果干燥用于第一方面的步骤(iv)，可以是冻干来获得冻干的乳酸菌组合物。如上论述的，所述乳酸菌以至50%的抗坏血酸盐或抗坏血酸(w/w-干物质) 进行配制。技术人员理解术语“w/w-干物质”意为基于所述组合物的干物质的重量。例如，如果所述乳酸菌组合物是冷冻组合物——例如10%抗坏血酸盐或抗坏血酸(w/V-干物质)应理解为干燥例如所述组合物的样品，然后测得组合物所述的干物质的 10 %为抗坏血酸盐或抗坏血酸。很多次，所述乳酸菌组合物以2%至M %的抗坏血酸盐或抗坏血酸(w/w-干物质) 进行配制，或者其以5%至15%的抗坏血酸盐或抗坏血酸(w/w-干物质)进行配制。对于技术人员明显的，在第一方面的步骤(iii)加入的例如抗坏血酸钠的量将决定在例如步骤(iv)的干燥后所述乳酸菌组合物中例如抗坏血酸钠的量(w/V-干物质)。如对于技术人员明显的，可以向第一方面的步骤(iii)中的所述浓缩物添加其它相关化合物。例如，如果冻干用于步骤(iv)，则存在步骤(iii)中添加的所谓的冷冻保护剂。冷冻保护剂是用于防止生物学组织免于冻害(由于结冰引起的损害)的物质，适宜的冷冻保护剂的实例为例如蔗糖、麦芽糖糊精、海藻糖或甘油。
发酵——第一方面的步骤(i)根据人们使得所述大规模生产究竟有多大——发酵罐(生物反应器)可以包含至少500L发酵培养基或至少10000L发酵培养基。如上论述的，通过添加不包括NH3 (氨)的碱使得在发酵过程的至少大部分pH被控制在3彡pH彡8。控制pH使得在发酵过程的至少大部分具有3 < pH < 8，因为乳酸菌通常在pH低于3不适当地生长。根据乳酸菌的具体类型——可以控制pH为4彡pH彡7。一般而言，技术人员知晓如何通过适当添加适量的碱来控制pH。如对于技术人员明显的，在本文中——步骤(i)中的术语“大部分”应理解为数次相对短的时间PH例如变为低于3——例如在不是连续地添加碱的情况下恰恰在加入过量的碱之前。不包括NH2(M)的碱如上论述的——在本文实施例中，使用NaOH作为不包括NH3(氨)适宜的碱的良好实例。如技术人员已知的——适宜的实例可以是以下碱组成的碱的组中的至少一种碱 NaOH, KOH、Na2C03> Na2S 和 Na20。在以上列表中，NaOH或KOH通常是最优选的。第一方面的步骤(ii)至(iv)如上论述的，第一方面的方法的所有步骤(ii)至(iv)可以基本上视为根据现有技术所作的常规步骤。例如，如技术人员已知的，收集所述乳酸菌以获得乳酸菌浓缩物(步骤(ii))可以通过离心进行。收集也可以通过超滤进行。例如，如技术人员已知的，可以通过例如在将其添加到所述浓缩物之前溶解干燥的抗坏血酸钠来将例如抗坏血酸钠添加到所述乳酸菌浓缩物(步骤(iii))。或者，可以“直接”将干燥的抗坏血酸钠添加到所述浓缩物中。关于步骤(iv)具体的处理方法当然将取决于应用。例如，如果需要干燥的乳酸菌组合物，那么步骤(iv)中的处理为干燥。如果需要冷冻的乳酸菌组合物，那么步骤(iv)中的处理为冷冻。或者，如果需要液体乳酸菌组合物，那么事实上不需要在步骤(iii)后进行任何进一步的处理。实施例实施例1 颜饩测定如本文中论述的L. Kurtmann的文章中描述的方法进行粉色/红色颜色测定。如该文章第2页所阐释的，通过以下方式进行颜色测定使用采用L*、a*和b*坐标的CIELAB色系测量干燥培养物的表面色，并通过三原色比色计(Minolta Chroma Meter CR-300, Osaka, Japan)进行测量。在该研究中，颜色变化通过b*值和f值来表示，b*值测量黄色(+)或蓝色(_)，其中b*值增加反映颜色向黄色和棕色的变化，而a*值测量红色(+)或绿色(_)。值测定为在所述干燥细菌样品每三个测量的平均值，其中每次测量在表面上10个不同位置进行。实施例2 以NaOH替换NH3用于发酵过程中的pH调节菌株——商业上可获自Chr. Hansen A/S 嗜酸乳杆菌(La-5 );鼠李糖乳杆菌(LGG )动物双歧杆菌(BB-12 )。嗜热链球菌(TH-4 )方法依照本文第一方面的方法中试生产制备所有三种菌株。对于每一菌株，在一个生产中使用NaOH来调控发酵过程中的pH(第一方面的步骤⑴)，而作为对照/参照的是使用NH3来控制pH的另一生产。其它的一切——例如步骤 (iii)中添加的抗坏血酸钠的量在所述生产中100%相同。所有的产生的乳酸菌组合物在干燥产品中包含约10%的抗坏血酸钠(w/w-干物质)作为抗氧化剂。冻干(步骤(iv))后——对贮存于30°C /30%相对湿度(RH)分别以NaOH和NH3 制备的冻干的乳酸菌组合物的颜色变化进行跟踪。以Minolta色度计测量所有产品的颜色(参见实施例1)并照相。MM图2中所示的图片显示在发酵过程中NH3用于pH调节的生产中产生的BB - 12 批次和发酵过程中NaOH用于pH调节的Pilot Plant中产生的两个批次颜色的差异。图3中的图片显示对于La-5 的同样内容。由所述图可以看到，将NH3改变成NaOH，颜色大大改善(较少的红色/粉色颜色)。对于LGG 和TH-4 发现了相似的明确结果。Mrk结果清楚地显示通过使用NaOH而不是NH3作为碱——可以产生以抗坏血酸钠配制的干燥的La-5 、LGG 、BB-12 和TH-4 组合物，其中所述组合物在其贮存期间不产生显著的粉色/红色颜色。参考文献1. L. Kurtmann et al. , "Storage stability of freeze—dried Lactobacillus acidophilus(La_5)in relation to water activity and presence of oxygen and ascorbate” ；Cryobiology(2009)，doi:10.1016/j. cryobiol. 2008. 12. 001-于 2008 年 12
月发表于互联网上。
权利要求
1.一种制备至少^g(干重)的乳酸菌组合物的方法，所述组合物以至50%的抗坏血酸盐或抗坏血酸(W/V-干物质)作为抗氧化剂进行配制，其中所述方法包括以下步骤(i)在适宜条件下在包含至少100L发酵培养基的发酵罐(生物反应器)中发酵所述 Mff，1中诵1 寸添加不句,括NH, ( M )的碱#得发酵过蓝的至Φ大部分其月间dH M^ffeH^h 3彡pH彡8 ；( )收集所述乳酸菌以获得乳酸菌浓缩物；(iii)向所述乳酸菌浓缩物添加抗坏血酸盐或抗坏血酸；以及(iv)以适宜的方式处理步骤(iii)的含有抗坏血酸盐或抗坏血酸的浓缩物，以获得以至50%的抗坏血酸盐或抗坏血酸(w/w-干物质)作为抗氧化剂配制的乳酸菌组合物。
2.权利要求1的方法，其中在权利要求1的步骤(iii)中添加抗坏血酸钠。
3.权利要求1或2的方法，其中权利要求1的步骤(iv)中的处理为干燥以获得干燥的乳酸菌组合物。
4.权利要求1或2的方法，其中权利要求1的步骤(iv)中的处理为冷冻以获得冷冻的乳酸菌组合物。
5.前述权利要求任一项的方法，其中所述乳酸菌是选自以下组的乳酸菌属于乳酸杆菌属的乳酸菌，诸如瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbruekii subsp. bulgaricus)、发酵乳杆菌 (Lactobacillus fermentum) >(H^ILff lif (Lactobacillus salivarius) IE^IIILff lif (Lactobacillus rhamnosus)；属于乳球菌属的乳酸菌，诸如乳酸乳球菌(lactococcus lactis)； 属于链球菌属的乳酸菌，诸如嗜热链球菌(Sti^ptococcus thermophilus)； 属于明串珠菌属的乳酸菌，诸如乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)； 属于双歧杆菌属的乳酸菌，诸如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、动物双歧杆菌(bifidobacterium animal is)或短小双歧杆菌(Bifidobacterium breve)； 属于丙酸杆菌属的乳酸菌；属于肠球菌属的乳酸菌，诸如屎肠球菌(Enterococcus faecum)；和属于片球菌属的乳酸菌。
6.权利要求5的方法，其中所述乳酸菌是选自以下组的乳酸菌 属于乳酸杆菌属的乳酸菌；属于链球菌属的乳酸菌； 属于双歧杆菌属的乳酸菌；和属于乳球菌属的乳酸菌。
7.权利要求6的方法，其中所述乳酸菌是选自以下组的乳酸菌嗜酸乳杆菌(LactcAacillus acidophilus)、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌和动物双歧杆菌。
8.权利要求3的方法，其中步骤(iv)的干燥是冻干以获得冻干的乳酸菌组合物。
9.前述权利要求任一项的方法，其中所述乳酸菌组合物以5%至15%的抗坏血酸盐或抗坏血酸(w/w-干物质)进行配制。
10.权利要求8的方法，其中在权利要求1的步骤(iii)中还添加冷冻保护剂。
11.前述权利要求任一项的方法，其中权利要求1的步骤(i)中的发酵罐(生物反应器)包含至少500L发酵培养基。
12.前述权利要求任一项的方法，其中权利要求1的方法为一种制备至少^g(干重) 的干燥乳酸菌组合物的方法，所述组合物以至50%的抗坏血酸盐或抗坏血酸(w/w-干物质)作为抗氧化剂进行配制。
13.前述权利要求任一项的方法，其中所述碱为选自以下碱的至少一种碱NaOH、Κ0Η、 Na2C03、Na2S和Na2O,优选地其中所述碱是NaOH或Κ0Η。
14.权利要求14的方法，其中所述碱是NaOH。
15.前述权利要求任一项的方法，其中控制权利要求1的步骤(i)中的PH使得 4 ^ pH ^ 7ο
全文摘要
一种制备至少2kg(干重)乳酸菌组合物的方法，所述组合物以1％至50％的抗坏血酸盐或抗坏血酸(w/w-干物质)作为抗氧化剂进行配制，其中通过添加不包括NH3(氨)的碱使得在至少大部分发酵过程中pH被控制在3≤pH≤8。
文档编号C12R1/225GK102325873SQ201080008903
公开日2012年1月18日 申请日期2010年2月18日 优先权日2009年2月23日
发明者比吉特·伊德, 苏珊娜·亚伯拉罕森 申请人:科·汉森有限公司