一种新的多肽制备方法

专利名称：一种新的多肽制备方法
技术领域：
本发明涉及新的分离蛋白，具体涉及由哺乳动物肝脏肝内胆汁管或由哺乳动物骨髓分离的纯净蛋白。更具体地讲，本发明涉及一种称之为probursin的哺乳动物蛋白，该蛋白可用化学方法合成或重组复制。本发明还涉及含有probursin的治疗组合物及使用该组合物的方法。
脊椎动物免疫系统的B淋巴细胞或B细胞对引入动物体的外源性抗原呈现抗体反应。就鸟类而言，前体B细胞在称作Fabricius囊的器官中发生变异。就哺乳动物而言，还没有发现与Fabricius囊具有同等功能的器官，据认为有相对于B细胞的造血前体存在，并且可以在骨髓中变异为成熟B细胞。
直到最近，将B细胞前体变异为B细胞的激素诱导物还属未知。但是，由本发明者之一及其他人所进行的早期研究表明在鸡的Fabricius囊提取物中有特异性B细胞变异诱导物存在。在本文引为对比文献的下列文章中报导了这一早期工作Brand，etal，Science，193319-321(1976年7月23日);Brand，etal，Nature，269;597-598(1977年10月13日);Goldstein，etal，ColdSpringHarborSymposiaonQuanti-tativeBiology，XLI5-8(1977);Gold-stein，“增殖和变异的分子控制”(“MolecularControlofProliferationandDifferen-tiation”)P.197-202，AcacdemicPress(1977)。
最近，本发明者和其他人签定了一种用作B细胞变异特异性诱导物的称之为bursin三肽激素，其氨基酸序列为Lys-His-Gly-NH2。也称之为bursopoietin的这一多肽对鸟类和哺乳动物均有活性，并在本文引为对比文献的美国专利4，584，284中作了介绍。
在本领域中已公开了其他内分泌多肽。生长激素释放抑制因子是由下丘脑和胰岛细胞产生的环状十四肽。生长激素释放抑制因子抑制下列激素的释放，这些激素包括生长素，促甲状腺激素，促肾上腺皮质激素，胰岛素，胰高血糖素，促胃酸激素，肠促胰液肽，血管紧张肽原酶。另一个这类调节肽是tuftsin，是由循环免疫球蛋白中产生的碱性四肽，该四肽刺激在多形核白细胞和巨噬细胞中的吞噬作用。〔参见V.A.Najjaretal，Nature228672(1970);Y.Stabinskyetal，Mol.Cell.Biochem.，3071(1980);A.Constantopoulosetal，Cytobios.，697(1972)〕。
至今还未弄清这些激素(包括B细胞变异因子bursin)相互之间的关系。现已发现在使B细胞变异并对其他组织产生影响的各种激素作用之间的关系极有可能成为治疗人体和动物免疫疾病和肝脏机能障碍的一种新方法。
因此，本发明的目的之一是提供一种从哺乳动物骨髓或肝脏获得的纯净14氨基酸多肽。该多肽，即probursln也可按标准化学合成技术制得。另外，通过重组技术也可制得该多肽。
Probursin尤其具有特异性诱发B细胞前体骨髓细胞变异的能力。因此，对于治疗人体和动物免疫系统B细胞缺陷及各种肝脏疾病而言，该多肽是十分有用的。另外，Probursin具有抑制生长激素从脑垂体释放的功能。生长激素释放加速某些恶性肿瘤的生长。因此，Probursin也可用于治疗某些癌症，对肿瘤产生特异性抑制。
本发明的目之二是提供一种含有Probursin的治疗组合物。目的之三包括利用这些治疗组合物治疗下述疾病的方法，这些疾病包括由于B细胞变异因子不足或缺乏而引起的B细胞变异不足，不能充分控制由生长激素释放抑制因子调节的那些激素，和/或提高免疫系统在循环中吞噬外源性粒子的能力。采用Probutsin的其他治疗方法包括依上所述治疗癌症。
本发明的目的之四是提供用于合成或重组制备Probursin的新的中间体，包括新的多肽树酯中间体，新的载体和新的转移宿主细胞。
根据本文的下列优选实施例的详细描述，可以十分清楚地看到本发明的其他目的和优点。


图1图解说明由牛肝脏获得的纯净Probursin组份的光密度。
图2说明Probursin的硅胶薄层层析。
图3图解说明各种滴定度的抗-bursin抗体(圆点)和兔血清(方块)的光密度。
图3B图解说明KLH-对照共轭物(方块)，KLH-bursin(三角)和游离Probursin(圆环)光密度VS.吸收浓度。
图4图解说明每一降解周期PTH氨基酸的得量。
图5A图解说明经Probursin，bursin，猪胰岛素(A)，马肌红蛋白(B)和牛生长激素(C)孵育后，Daudi细胞中细胞内环状GMP水平;
图5B图解说明如上所述经Probursin，bursin，(A)，(B)，(C)孵育后，MOPC-315细胞中细胞内环状GMP水平、依此作为对照。
本发明提供了一种称之为Probursin的新的哺乳动物分离多肽，其特征在于相同或基本相同的氨基酸序列(1)(5)(10)(14)Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Arg-Arg在该14氨基酸Probursin序列中的前5个氨基酸残基与生长激素释放抑制因子的活性部位相对应。Probursin中氨基酸残基5至8与人体多肽uftsin的活性部位相对应。另外，Probur-sin中氨基酸残基9至11与前述多肽bursin相对应。存在于Probursin序列中的这些重叠生长激素释放抑制因子，fuft-sin和bursin序列与人类多肽生长激素释放抑制因子，tuftsin和bursin的活性部位序列相同。因此，尽管Probursin多肽最初是由胎牛肝脏分离而得的，但是，据认为其序列基本上与其他哺乳动物，尤其是与人类相同。
就其广义而言，本发明提供了基本上无天然蛋白物质的任何形式的哺乳动物Probursin或其类似物，即，或者从哺乳动物肝脏或者从骨髓分离，或者从合成或重组而得。一般认为，下列物质将作为Probursin同系物贯穿于本说明书Probursin的变异物，包括各哺乳动物物种之间和某一物种各成员之间在所述序列中自然出现的等位基因改变，以及在所述序列中人为引入的变化(例如，采用诱变或化学技术)，或者通过各种重组宿主引起的改变(如糖基化改变)，或者通过与其他外源分子连接引起的改变(如放射性标记等)。这些同系物属于本发明的范畴。
所述哺乳动物Probursin最好是人的Probursin。最初，采用直接抗bursin的抗体监视纯化，进而从胎牛肝脏中分离Probursin。下文实施例1介绍了分离Probursin的方法。最好从肝脏中分离哺乳动物Probursin，但是，按照类似于下文实施例1介绍的从牛肝脏分离Probursin的方法，也可从骨髓中分离Probursin。尽管如上所述，Probursin多肽序列的特征在于相同或基本相同，但从哺乳动物源分离时，也可得到序列等位基因变异体，以及含有其他氨基酸或天然物质的序列变异体。
另外，通过化学合成可以得到该14氨基酸序列的Probur-sin，即，得到一新的合成多肽。本发明的优选实施例是分子式如下的合成多肽和其药物上可以接受的酸成盐，其分子式为Phe-Phe-Trp-Lys-ThrLys-Pro-ArgLys-His-Gly-Gly-Arg-Arg。
为制得多肽Probursin的酸成盐，可用适量的酸处理该游离多肽。能够与本发明多肽形成盐的酸包括(但不限于)无机酸例如，盐酸，氢溴酸，高氯酸，硝酸，硫氰酸，硫酸，碳酸，磷酸等等。可用于该目的的其他酸是有机酸，例如，甲酸，乙酸，丙酸，乙醇酸，乳酸，丙酮酸，草酸，丙二酸，琥珀酸，马来酸，富马酸，氨酸，肉桂酸，萘磺酸，磺酸，等等。
通过合成制得本发明所述多肽可按Merrifield在“J.A.C.S.，852149-2154(1963)”中介绍的固相合成法进行。该技术是用于制备多肽的众所周知的普通方法。另外，Bodanszky等在“PeptideSynthesis”第二版，JohnWileyandSons，1976中介绍了其他多肽合成技术。该固相合成法包括被护氨基酸逐步加成，成为增长肽链，后者由共价键与固体树脂颗粒连接。通过这一方法，经过滤除去试剂和付产物，因此，不必纯化中间体。这一方法的一般原理是通过共价键使链中的第一氨基酸与固体聚合物连接，然后依次逐步加入被护氨基酸，一次一个或一次一段，直到组成所希望的序列为止。最后，从固体树脂载体中除去被护多肽，并除去保护基。
本发明还提供了用于制备本发明多肽的新的多肽-树脂中间体。该中间体的分子式与下述分子式相同或类似R1-Phe-Phe-(R2)Trp-(R3)Lys(R4)Thr-(R5)Lys-Pro-(R6)Arg-(R7)Lys-(R8)His-Gly-Gly-(R9)Arg-(R10)Arg-树脂，其中，R1至R10是在所标明氨基酸适宜位置上的适宜保护基团，树酯是起反应载体作用的适宜固相聚合物。根据上述引用参考文献公开的内容，多肽合成领域普通技术人员能够选择适宜的氨基保护基，羟基保护基，吲哚保护基，咪唑保护基和树酯。就制备与本发明多肽不同的多肽而言，本领域普通技术人员也可制备类似的多肽-树酯中间体。
可以将氨基酸连接在任何适宜的聚合物上。该树酯为须含有一个第一被护氨基酸可通过共价键牢固地与其相连的官能团。各种聚合物或共聚物均可用于这一目的，例如，纤维素，聚乙烯醇，聚甲基丙烯酸甲酯，聚苯乙烯，聚苯乙烯二乙烯基苯。可用于这种合成及其缩略的适宜保护基参见前述教科书，另外还可参见《J.F.W.Mc Omie，“Protective Groups in Org-anic Chemistry”，Plenum Press New York 1973》，这两本书均引为本文的对比文献。本文所采用的普通保护基包括叔丁氧基羰基(BOC)，苄基(BZL)，叔戊氧基羰基(AOC)，甲苯磺酰基(TOS)，邻溴苯基甲氧基羰基(BrZ)，2，6-二氯苄基(Cl2BZL)，苯基甲氧基羰基(Z或CBZ)。
制备这一多肽的一般方法包括先将精氨酸(在其α-氨基和胍基上进行保护)连接到树酯上。连接完成后，将树酯过滤，洗涤，并除去精氨酸在α-氨基上的保护基。该保护基最好是叔丁氧基羰基。当然，必须在不使精氨酸与树酯之间的连接键断裂的情况下除去保护基。然后将在其α-氨基和胍基保护的精氨酸偶联到形成的多肽树酯上。通过在第二精氨酸的游离羧基与连接在树酯上的第一精氨酸氨基之间形成酰胺键来实现这一偶联。依次用氨基酸重复上述偶联，直到将所有的氨基酸连接到树酯上为止。最后，将被护多肽与树酯分离，除去保护基，展现出所期望的多肽。从树酯中分离多肽以及除去保护基所采用的断裂技术是根据所选择的树酯和保护基而制定的，并且对于熟悉多肽合成工艺的人来说是已知的。
采用标准的溶液多肽合成法也可以合成该多肽，所述方法包括采用化学或酶学方法形成酰胺键逐步或分段偶联氨基酸或多肽片断。这些溶液合成法是本领域众所周知的。
采用惯用重组技术也可生产该多肽。用于重组生产多肽的惯用技术参见Maniatisetal，“MolecularCloning，aLaboratoryManualColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NewYork(1982)”，以及本领域技术人员可以查得到的其他已知参考文献。因此，所有编码Probursin的DNA序列均属于本发明的部分。由于含有编码相同氨基酸的其他密码子，修饰或标记过的碱基，这些DNA序列可以是不同的，或者该DNA序列可以编码Probursin的同系物。这些序列可以形成下述DNA分子的一部分，即，在运转时与DNA序列一道含有适宜的表达控制序列，并且在转入宿主细胞时能直接进行表达。将这些DNA分子或载体称之为细菌酵母，真菌，昆虫或哺乳动物源的载体。本领域普通技术人员完全有能力完成Probursin的DNA序列与已知载体成份的组装。同样，本领域普通技术人员无须过多实验即可用惯用技术为本发明所述含Probursin的载体选择微生物或哺乳动物宿主细胞，并将前者转入后者。
也可以采用用于生产Probursin的化学合成及重组技术修饰前述Probursin的14氨基酸序列。这种修饰包括在上述序列的14氨基酸中删除或置换其中1个或多个氨基酸，或者在上述序列中插入或加入其他氨基酸或化学基团，借以提高所得多肽的生物或药理活性，或者使这些活性更有方向性。例如，可以将各种化学基团连接在该多肽的一个或多个氨基酸上，以提供众多的有益特征例如，对酶降解的耐受性，增加半衰期等。Probur-sin的这些修饰形式也属于本发明的范畴。
由于Probursin混合了三种已知调节多肽的重迭活性部位，因此，可以认为Probursin具有与生长激素释放抑制因子，fuftsin和bursin相同或类似的生物活性。由于Probur-sin能够诱导机体免疫应答所涉及的B细胞变异及成熟，因此它可以用来治疗人体或动物的疾病。鉴于这些特点，该多肽具有多种治疗用途。该多肽不仅可用于研究，而且还可用来治疗人类和动物有关成熟B细胞不足或缺乏引起的疾病。
据认为，Probursin及其片段和同系物具有履行某些已知肝脏功能的能力(例如，刺激Kupffer细胞的吞噬作用并且抑制肝细胞的病理增殖作用)。因此，Probursin及其片段和同系物可以用来治疗各种肝脏机能障碍，例如，肝硬化。
另外，据认为可将本发明多肽用于改善机体的综合免疫作用，即，用于增加或改善体液免疫治疗刺激作用。一般认为本发明Probursin多肽，同系物以及含有上述物质的治疗组合物可用于体液免疫为关键因素的任何领域，尤其是用于免疫缺陷。因此，由于B细胞缺乏引起抗体产生不足时，可采用本发明多肽刺激细胞产生来纠正这一情况。因此，Probursin可用来治疗患有已知免疫缺陷的患者，例如，对疫苗无反应的患者，如，对肝炎疫苗不产生抗体的患者和对肺炎球菌疫苗无反应的早期患者。
例如，应该采用Probursin治疗的典型情况是X-结合的婴儿血(内)丙种蛋白过少症(X-linkedinfantilehypo-gammaglobulinemia)。几乎在所有男性儿童中都会出现这种缺陷。据认为这是由于出现这一情况的儿童骨髓及周围血液中前体B细胞不能成熟为分泌抗体的B细胞。因此，出现这一情况的患者会患慢性的或复发细菌感染。
涉及免疫球蛋白产生缺乏或低下的其他免疫缺陷症，根据免疫缺陷引起这一问题的部位，也可采用本发明多肽治疗。如果在前B细胞熟化为分泌抗体的成熟B细胞的过程中出现这一缺陷，本发明多肽是有用的。诊断出须用Probursin治疗疾病的缺陷点，完全属于治疗免疫缺陷领域中具有普通技术的临床医生的范畴。例如，参见“BasicandClinicalImmunology”，StitesStobo，Fudenberg，andWells，editors4thEd(1982)，LangeMedicalPublica-tions，LosAltos，California(Chapter25)。
另外，现已发现Probursin抑制生长激素的释放(见实施例6)。已知抑制生长激素与抑制某些恶性肿瘤生长有关〔见R.S.Hilletal，Diabetes34115(1985)andM.J.BerridgeetalBiochem.J.，212473(1983)〕。因此，Probursin和/或其同系物或其修饰变种可用于治疗某些癌症，其中，通过调节生长激素抑制肿瘤生长。
当与放射活性或其他可检测标记结合使用时，Probursin和其同系物也可用作诊断试剂。另外，按照标准技术，例如，Kohler-Milsteim杂交方法，将Probursin及其同系物用于抗原物质，借以产生多克隆或单克隆抗体。
因此，本发明包括对于需要进行免疫调节的患者进行免疫系统调节的方法，该方法包括给所述患者服用有效量的本发明化合物之一。
本发明还提供了一种治疗由于患者相对或绝对肝功能缺陷而引起疾病的方法，该方法包括给所述患者服用治疗有效量的Probursin或其同系物。
本发明还提供了一种诱导B细胞变异并成熟的方法，该方法包括患者服用诱导治疗有效量的Probursin或其同系物。
本发明还提供了一种通过抑制肿瘤生长治疗癌症的方法，即，给患者服用抑制生长激素治疗有效量的Probursin或其同系物。
本文所采用的术语“治疗有效量”意指治疗上述免疫系统或肝脏各种疾病或缺陷有效的量。
本发明还提供了实施上述治疗方法的药用组合物。就采用药用组合物而言，本发明多肽的有效剂量范围是约1ug/kg至10mg/Kg。Probursin在约100ug/kg出现最大活性。在免疫缺陷治疗领域中普通技术人员根据本文结果无须大量试验即可以很容易推断并选择适于临床应用的本发明多肽的适宜剂量。例如，经治医生根据以下传统的临床参数可以确定剂量年龄，体重，性别，患者的整体生理状况。
本发明多肽并不限定于某一特定的给药模式。但是，由于胃酶可以使氨基酸序列降解，因此，最好采用胃肠道外涂药的方式。尽管皮下是最理想的胃肠道外给药方式，但本发明多肽也可以采用下述方式给药经皮，肌肉，鼻内，腹膜内，静脉，向颊或通过栓剂给药。
为制备本发明所述药用组合物，按照惯用的制药混合技术，可以将Probursin作为活性成份与药物载体和/或赋形剂混合。根据给药所要求的制剂形式(其中包括混悬液，酏剂，溶液)，可采用各种形式的载体。就胃肠道外给药产品而言，该载体通常包括无菌水或生理盐水溶液。为了给药品增加有益特性，例如，增加溶解度或便于保存，还可加入其他成份。采用适宜的液体载体(如悬浮剂等)还可制得注射用混悬液。胃肠道外给药制剂领域中普通工作人员很容易掌握制备这类组合物的方法。
下列实施例说明了从胎肝中分离牛Probursin的方法，提供合成Probursin的方法和测定该多肽活性的方法。这些实施例并不限制本发明。
实施例1粗提Bursin和Probursin用含有1mM聚甲基磺酸(PMSF)，1mM乙二胺三乙酸(EDTA)，1.0mMβ-巯基乙醇的碳酸氢铵缓冲液(25%W/V，50mM，PH8.0)提取胎牛肝脏(500g)。在捣碎器中，于4℃，将组织均浆3分钟，在9000rpm离心(4℃)45分钟。上清液经沙布过滤，澄清液于-60℃保存。将25ml等份液冻干，并悬浮于10ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
将该溶液离心，分成2.5ml等份，加到PD-10〔Pharmacia〕层析枉上，将含有低分子量的组份冻干，并溶解在1ml碳酸氢铵缓冲液(50mM，PH8.0)中，该溶液用于下文实施例2所述的酶连接免疫吸收剂测定(ELISA)。
通过下列步骤从胎牛肝脏进一步纯化Probursin(A)在SephadexG-75分子筛柱〔Pharmacia〕上进行胶体过滤。接着(B)上CMSephadex离子交换柱〔Phar-macia〕然后(C)进行薄层层析纯化，在此期间，除去具有免疫反应的组份-Bursin。(D)所得组份在SephadexG-75上再次过滤。(E)将所得滤液在Mono-Q柱〔Pharma-cia〕上进行离子交换快速蛋白液相层析。(F)最后一步纯化为反相FPLC。下列表1列出了各纯化步骤的收率和次序。
还测定了各步纯化组份在254nm处的光密度。图1示出了步骤A.B.E和F中的各组份。图2示出了由薄层层析步骤(C)所得的胶体。
实施例2ELISAA.兔抗血清就兔免疫而言，按照Tamura等在Cell，34587(1983)中介绍的方法，通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(ECDI)将Probursin偶联于钥孔 血兰蛋白(KLH)。简言之，将5mg bursin溶解在400ul用盐酸酸化至PH3.0的水中，然后在冰浴中冷却。加入20ul体积的10mgECDI，在冰浴中将所得混合物保温15分钟。将溶有15mgKLH的0.5ml，PH3.0酸化水加到该混合物中。将0.5ml饱和碳酸铵溶液加到该溶液中，加入少量无水碳酸铵以保持该溶液饱和。在冰浴中搅拌下将该混合物保温3小时，然后用水透析3次，每次2升水，时间为40-48小时，继之PBS过夜。用PBS将结合物稀释至1mg/mlbursin。
将200ul体积的200ugKLH-bursin与400ul全Freund佐剂相混合。给5只免子中每只的皮下多点注射500ul上述混悬液以使之免疫。以4-6周为间隔，给免子注射含不完全Freund佐剂的类似悬浮液。
B.ELISA程序以下列ELISA程序检验各抗血清的活性。按照Voller等在Bull.WHO，5355(1976)中介绍的方法进行测定。简言之，用100ul/井浓度为10ug/ml的由四体Probursin与0.1M磷酸盐缓冲液(PH7.2)制得的溶液涂敷聚乙烯氯微滴定板(FisherScientiflc，Springfield，NJ)，并使之过夜。洗涤上述板，并在室温下，用150ul/井浓度为0.5%小牛血清清蛋白PBS液(PH7.2)再涂敷1小时。洗涤该板，于37℃干燥6-24小时，并密封于干燥包装袋中，于4℃下保存。
在含0.05%吐温-20的PBS中稀释待测定的抗血清。在每个井中加入100ul稀释后的血清，一式三份。将正常的免或鼠血清用作阴性对照。在室温下保温60分钟后，用PBS吐温-20将该板洗涤3次。将结合在亲和-纯化山羊抗-兔IgG(重和轻链)上的100ul碱性磷酸酶在PBS吐温-20中以1∶2000的比例稀释，并将该稀释液加到每一支井中。将该板在室温下保温60分钟，洗涤该板，将100ul浓度为1mg/ml对硝基苯基磷酸酯与二乙醇胺缓冲液制得的溶液加到每一支井中。于室温下保温30分钟后，在每井中加入50ul5N的氢化钠使该反应终止，在410mm处读数光密度。
C.结果5只兔子中有2只在5个月后产生对Probursin的抗体，滴定度约为1∶800(图3A)。通过KLH-bursin以及游离Probursin(但不用KLH-对照结合物)封锁抗-bursin抗血清键合(图3A)。
实施例3自动N-末端蛋白编序采用气相编序法对完整Probursin及胰蛋白酶和溴化氰片段Probursin进行自动序列分析，所使用的仪器是470A型AppliedBiosystems气相编序器，用Polybrene作为载体，并采用标准的单一偶联单一断裂程序。用1084BHew-lettPackard高压液相色谱鉴定所得的由苯基海硫因酸衍生的氨基酸。图4示出了收率。
实施例4制备本发明的合成多肽按照用于BOC-氨基酸衍生物的标准程序，在ABI430多肽合成仪上，采用固相合成本发明所述多肽。用0.5mmolsBOC-(Tos)Arg-PAM树酯开始该合成。完整的多肽树酯重量为1.87g。用20mlHF及2g对甲苯酚在0℃将树酯处理1小时。减压下除去HF，并将乙酸乙酯加入残余物中。将该混合物过滤，用乙酸乙酯洗涤。在该固体中加入三氟乙酸，将该混合物过滤。将滤液蒸发至小体积，然后加入醚。滤出沉淀，用醚充分洗涤，得到1.04g白色固体。将440mg该产物加到50ml1M的PH为9.0的碳酸氢铵中，以使Trp去甲酰化。用氮气冲洗，以除去溶液中的氧气，然后在密闭烧瓶中放置16小时。最后用水稀释该溶液，冻干。
在Partisil-ODSM-20柱上，用20%乙腈/0.1%TFA洗脱，即通过制备HPLC纯化该多肽。加入稀TFA使PH约为3，进而使多肽溶解，并分5次注入。合并含主峰的各主要组份，通过旋转蒸发除去有机溶剂，将残留物冻干。使之通过AmberliteIR-68阴离子交换树酯，进而使产物转化为乙酸盐，经冻干的产物具有如下序列，重量为102mg，其序列为Phe-Phe-Try-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Ghy-Arg-Arg。
TLC(硅胶60)Rf0.10 n-BuOH∶HOAc∶H2O∶Pyr4∶2∶3∶1Rf0.04 EtOAc∶Pyr∶HOAc∶H2O5∶5∶1∶3氨基酸分析Thr-0.88，Pro-1.04，Gly-2.01，Phe-2.00，His-1.02，Lys-2.91，Trp-0.81，Arg-3.14;73%肽。
实施例5生物活性-环GMP分析按照T.Audhya等在“Arch.Biochem Bio-phys.，234167-177(1984)”中介绍采集方法，新鲜接种Daudi细胞，并使其繁殖生长2天。该细胞用PBS洗涤3次，并使之以1.0×107细胞/ml的浓度再悬浮于RPMI1640中，使之在37℃平衡30分钟，然后加入受试化合物(25ul)bursin和Probursin，以及对照用多肽-猪胰岛素(A)，马肌红蛋白(B)，牛生长激素(C)。在振荡水浴中保温4-5分钟，然后加入1ml冰冷却TCA(10%)使反应终止。
将在TCA中的细胞均浆，并通过超声波粉碎使之释放出环核苷酸。在4℃，以3000×g使该混悬液离心20分钟。为侧定蛋白成份，将所得沉淀溶解在0.1N的NaOH中。用5ml水饱和二乙醚提取4次，借以从上清液中除去TCA。在最后一次提取后，在50℃水浴中加热10分钟除去残留的迹量醚。经冷冻干燥后，在50MM的乙酸盐缓冲液(PH6.2)中重新制备样品，用于环GMP的放射免疫测定。
确定bursin，probursin和对照物从0至100微克/ml的剂量-反应曲线。图5示出了在Daudi细胞(图5A)和在MOPC-315细胞(图5B)中活性bursin和Proour-sin，及无活性化合物的典型剂量-反应曲线。测定了每个受试多肽的临界活性，即为与对照物相比，使细胞内环GMP水平标准差大于2的受试多肽的最低浓度(1ug/ml)。对照物细胞内环GMP值小于0.1微微摩尔/ml(平均值±标准差)。如果环GMP水平比平行阴性对照物高1.52倍(2标准差)，则认为该试验结果为阳性。
实施例6生物活性-生长激素抑制进行这一测定的目的是研究Probursin与生长激素释放因子(GRF)结合的影响，这一结合影响在SV40转化仓鼠β细胞(HIT)中3H肌醇磷酸酯(IP)的释放和生长激素(GH)积累。按照上述M.J.Berridge等所介绍的方法进行该试验。
简言之，将市场上购得的HIT细胞在含5%胎牛血清(FCS)的代谢RPMI介质中于37℃，保温1小时。将下文表中所标明的不同浓度的GRF加到细胞培养物中，于37℃保温15分钟。然后将该细胞在800rpm离心，收集上清液。仍按Berri-dge等所介绍的方法，通过放射免疫测定法(RIA)测定上清液中的GH和IP水平。这些测定即为GRF对照。
重复相同的方法，但不加GRF，并在下文中作为对照物。
同样，为了弄清Probursin对GRF的影响，重复上述方法，所不同的是按下表表明的适宜浓度将GRF和Probursin一道加到细胞中，然后孵育15分钟，并离心。按上述RIA法测定上清液，所测得的IP和GH浓度列于下表中。
下表列出的数据说明Probursin对生长激素释放因子呈现明显的抑制作用，其结果与上述Hill等介绍的生长激素释放抑制因子的作用类似。
表[IP](cpm)[GH](ng/ml)对照15±414±2GRF(0.1nM)489±19162±4GRF(0.1nM)+Probursin(.1μM)239±1335±4GRF(1nM)2810±290648±26GRF(1nM)+Probursin(0.1μM)1911±310480±31GRF(1nM)+Probursin(1.0μM)444±2277±6GRF(10nM)8962±8211162±84GRF(10nM)+Probursin(10.0μM)382±1629±3本文所引用的某些优选实施例对本发明作了描述，但是本领域普通技术人员可对本发明作出各种各样的改变和改进，这些改变和改进均应包括在下文的权利要求书中。

权利要求
1.一种多肽，其特征在于包括与下式氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列，其同系物和其药物上可以接受的酸成盐，该氨基酸序列为Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Arg-Arg。
2.通过固相或溶液相化学合成法制备权利要求1所述的多肽。
3.从哺乳动物细胞中纯化权利要求1所述的多肽，所述哺乳动物细胞选自人类肝细胞或人类骨髓细胞。
4.按重组技术制备权利要求1所述多肽。
5.权利要求1所述多肽，其特征在于该多肽在Daudi或MOPC-315细胞中诱发细胞内cGMP升高的临界活性浓度约为1μg/ml。
6.一种多肽和其药物上可以接受的酸成盐，其氨基酸序列为Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Arg-Arg。
7.一种DNA分子，该DNA分子包括编码一种多肽的序列和运转上与之相联系的适宜表达控制序列，所述多肽包括与下式相同或基本相同的氨基酸序列，即为Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Arg-Arg。
8.一种药用组合物，该组合物包括在药物上可以接受剂型中的权利要求1所述治疗有效量多肽。
9.权利要求1所述多肽或其盐用于制备适用于调节患者免疫系统的药用组合物。
10.权利要求1所述多肽或其盐用于制备药用组合物，该组合物适用于以足以抑制肿瘤生长的量抑制生长激素释放。
11.一种下式所示的多肽-树脂中间体，即为R1-Phe-Phe-(R2)Trp-(R3)Lys-(R4)Thr-(R5)Lys-Pro-(R6)Arg-(R7)Lys-(R8)His-Gly-Gly-(R9)Arg-(R10)Arg-树酯，式中R1至R10各自分别选自适宜的保护基团，并且，树酯是适宜的固相聚合物。
12.一种诊断试剂，包括权利要求1所述多肽或对所述多肽的抗体。
全文摘要
一种以纯净形式分离的，或者以合成方法或重组技术产生的多功能哺乳动物多肽-Probursin，该多肽可用于治疗免疫疾病及抑制肿瘤。
文档编号A61P31/04GK1037902SQ8910202
公开日1989年12月13日 申请日期1989年2月24日 优先权日1988年2月24日
发明者塔彭·奥德雅, 吉迪安·戈尔茨坦, 乔治·希夫纳 申请人:免疫生物学研究所有限公司