专利名称：青藤碱在制备治疗慢性肾炎药剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物的新用途，具体的说是青藤碱在制备治疗慢性肾炎药物当中的应用，特别是盐酸青藤碱在制备治疗慢性肾炎药剂当中的应用。
青藤碱(sinomenine)是从防已科植物青藤Sinomenium acutum(Thunb.)R.et Wils.的茎和根中提取的生物碱之一，是一种已知的药用物质。现代药理学研究表明，青藤碱具有多种药理作用。概括起来讲，目前已经知道的青藤碱的主要药理作用如下镇痛、抗炎、降压、抑制中枢、抗心律失常等作用[张士善，等，清风藤碱甲的药理作用I.镇痛、消炎作用及急性毒性实验，药学学报1960，8177；凌秀珍，等，药学学报1962，9(7)393；赵德化，等，药学学报，1985，20(11)856；张明发，陕西新医药，1981，10(10)57]；对机体非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫均有抑制作用，尤其是对T淋巴细胞的功能有较强的抑制作用[彭慧敏，等，青藤碱的免疫抑制作用，中国药理学报1988，9(4)377-380]；青藤碱又是一种组织胺释放剂(冯经义，等，青藤碱的药理作用VII.对胃肠活动的影响及其机制，药学学报1965；12492)；临床上用于治疗类风湿关节炎疗效显著(张欣，等，陕西中医，1980，513；湖南省淑浦县中医院科研组，赤脚医生杂志，1975，12612)；有人还对青藤碱治疗类风湿性关节炎的作用机制进行了研究[李嗣英，等，青藤碱对小鼠免疫功能的影响，中草药，1992，23(2)81-83]。到目前为止，还没有有关青藤碱治疗慢性肾炎的报道。
目前，西医在对肾小球疾病的治疗上多应用肾上腺皮质激素、细胞毒类药等药物，并采用抗生素、血管扩张剂、利尿剂等对症处理。虽可缓解征状，延缓病变进展。但对于慢性病患者来说，此类药可削弱正常免疫功能、降低机体抵抗力、并可引起许多并发症，导致病症反复发作，病情持续迁延，疗效难以巩固。目前用于治疗慢性肾炎的中成药制剂很少，仅有雷公藤、昆明山海棠片剂、冲剂等少数品种，而且长期服用屡见不良反应。
鉴于这种情况，本发明人经过大量的实验研究和临床观察，发现青藤碱在治疗慢性肾炎方面具有很好的疗效，并将其制成药剂。
本发明的目是提供青藤碱的一种新用途，具体说是青藤碱在制备治疗慢性肾炎的药物中的应用。
经过我们的实验研究表明，青藤碱，特别是盐酸青藤碱，具有良好的抗炎作用，且具有对体液免疫抑制强而对细胞免疫抑制弱的独特机理，阻断免疫复合物的形成，在治疗慢性肾炎上有较好疗效。
本发明所述的慢性肾炎包括了临床上常见的各种类型的慢性肾炎，例如肾小球肾炎。
青藤碱作为一种治疗药物，已经有产品出售，例如，湖南黔阳地区制药厂生产的青藤碱(sinomenine，SIN)，武汉市中联制药厂生产的盐酸青藤碱粉剂，等。
因此，青藤碱作为治疗慢性肾炎的治疗药物，按照常规的制剂方法，可以制备成适合于临床上使用的任何药物剂型，例如，片剂、丸剂、胶囊剂、冲剂、口服液、乳剂、混悬剂、注射剂、栓剂、膏剂，等。
除了本发明所说的青藤碱之外，青藤碱的药物学上可接受的盐，例如盐酸青藤碱，同样具有治疗慢性肾炎的作用，因此，青藤碱及其药物上可接受的盐用于制备治疗慢性肾炎的药物，均属于本发明的保护范围。
青藤碱及其药物学上可接受的盐在用于制备治疗慢性肾炎的药物时，可以添加药物学上常用的赋性剂，如，粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、增溶剂、防腐剂、调味剂、溶剂、乳化剂，等。
青藤碱及其药物学上可接受的盐在用于制备治疗慢性肾炎的药物时，也可以和其他相容的治疗药物一起制成药剂。
实施例1盐酸青藤碱粉剂25000mg，购自武汉市中联制药厂，药用淀粉250g，酒精适量造粒，干燥，进压片机压片，制成1000片，每片片重为275mg，含盐酸青藤碱25mg。
实施例2青藤碱20000mg，淀粉180g，二者充分混合，装胶囊，制成2000粒胶囊，每粒0.1g重，含盐酸青藤碱10mg。
本发明公开了青藤碱及其药物学上可接受的盐在制备治疗慢性肾炎的药物中的应用。根据常规的制剂技术，可以将青藤碱、盐酸青藤碱等制成各种药剂，用于治疗慢性肾炎。
实验例1盐酸青藤碱片治疗肾小球肾炎的药效学研究为了了解盐酸青藤碱对慢性肾炎的作用，我们采用C-BSA复制模性肾小球肾炎动物模型，对盐酸青藤碱片的治疗作用进行了研究，并对利尿作用进行了观察，现将实验结果报告如下材 料盐酸青藤碱片由白云山正清制药股份有限公司提供，批号950908，实验时用蒸馏水配制成24毫克/毫升、12毫克/毫升、6毫克/毫升作高、中、低剂量。每日按2.5毫升/公斤体重给药。
雷公藤多甙片由江苏泰州制药厂生产，批号950814，10毫克/片，实验时用蒸馏水配制成6毫克/毫升，每日按2.5毫升/公斤体重给药。
氢氯噻嗪片由湖南制药厂生产，批号950315，实验时用生理盐水配成悬液。
BSA由北京奶牛研究所提供，批号950701。
碳化二亚胺盐酸盐由中科院上海生化所东风生化技术公司提供，批号950612C。
β2-MG测定药盒由中国原子能研究所提供。
生化检测所用试剂为北京中生公司生产。
日本大耳白家兔，体重2kg左右，购自湖南中医学院动物室。
SD系大鼠由本院动物室提供。
方法一、对兔C-BSA肾炎的影响(一)阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)的制备[1][2]将天然牛血清白蛋白用化学方法使之阳离子化，经等电聚焦电泳测定具等电点PI为8.5，透析冷冻干燥，-20℃冰箱保存备用。
(二)兔肾炎模型的制备将大肠杆菌内毒素和阳离子化牛血清白蛋白混合，使最终浓度为每毫升溶液中含1μg大肠杆菌内毒素和1mg牛血清白蛋白，每只兔耳静脉注射2ml进行预先免疫，7天后开始免疫造型，每只每日耳静脉注入C-BSA25mg(溶于生理盐水2ml溶液中)，共8周。正常对照组每日注射生理盐水2ml。
(三)实验分组与给药注入C-BSA2周后，凡尿蛋白“++”及以上者，进行实验编组分别为模型对照组；盐酸青藤碱片高剂量组；盐酸青藤碱片中剂量组；盐酸青藤碱片低剂量组；雷公藤多甙片组。盐酸青藤碱片高、中、低剂量分别为每日60mg、30mg、15mg/kg，雷公藤多甙片每日15mg/kg，正常对照组及模型对照组给予盐酸青藤碱片辅料，体积均为2.5ml/kg，给药途径为灌胃，整个疗程为6周。
(四)主要观察项目1.尿蛋白定性，每周一次，采用试纸法测定。24小时定量，每2周一次，采用苦味酸法。
2.血清学检查给药前及给药第3周、第6周时分别取血测尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、总胆固醇(Cho)、总蛋白(SP)、白蛋白(A)用美国Encor-II全自动生化分析仪测定，循环免疫复合物(CIC)测定按PEG沉淀法，上海721型光电比色计比色。用放射免疫方法测血及尿中β2-MG含量。
3.病理学检查实验结束后取家兔肾脏标本经常规石蜡包埋，HE染色，在光镜下观察①肾小球直径(长径与横径之和的平均数)，求均值。
②肾小球内细胞数，求其均值。每只兔测5个最大肾小球。
③形态观察。
二、利尿试验(代谢笼法)1.对正常大鼠尿量的影响取禁食(不禁水)18h的大鼠48只，雌雄各半，体重180-240g，按性别体重分层随机分为6组，分别灌服用生理盐水配制的药物悬液氢氯噻嗪5mg/kg，盐酸青藤碱20、40、80mg/kg，雷公藤多甙20mg/kg。体积均为10ml/kg。对照组灌服等体积生理盐水。轻压大鼠下腹部使膀胱排空，立即放入自制的代谢笼内，用滤纸收集排出的尿液。给药后5h，同上法排尽动物膀胱中余尿。将含尿滤纸称重，减去已知滤纸即为动物排尿量。
2.对水负荷大鼠尿量的影响禁食(不禁水)18h的大鼠48只，雌雄各半，190-240g/只。分组、给药途径及剂量同上。每只动物灌胃给药前腹腔注射生理盐水3ml/100g体重作为水负荷，实验其他过程同上，比较各组尿量。
结果一、对兔C-BSA肾炎模型的影响(一)对尿蛋白含量的影响实验动物在模型制备前尿蛋白定性均为阴性。致病免疫后2周造模动物出现明显蛋白尿，定性为++-+++，定量高达102-110mg/dl，各组尿蛋白均多于正常对照组(P＜0.01)，表明兔肾炎模型的建立成功，造模后，模型组动物尿蛋白持续维持在较高水平无明显变化。盐酸青藤碱片组给药3周后与同期模型组比较有降低尿蛋白的作用，并维持到第6周实验结束。随着剂量的增大，其作用渐增强。15mg/kg雷公藤多甙也于给药3周后出现降低尿蛋白的作用(表1、表2)。
表1 盐酸青藤碱片对肾炎兔尿蛋白定性(量化)的影响给药后不同时间(周)尿蛋白各级反应分数组别及剂量 注C-BSA后(mg/kg)1 2 3 4 5 6正常组 1.05±0.19 1.05±0.19 1.05±0.16 1.06±0.17 1.13±0.23 1.19±0.26 1.12±0.23(10) (10) (10) (10)(9)(8) (8)模型组 3.30±0.48*** 3.40±0.52*** 3.40±0.84*** 3.60±0.70*** 3.50±0.71*** 3.33±0.50*** 3.32±0.51***(10) (10) (10) (10)(10) (9) (9)盐酸青藤碱片组(60) 3.40±0.52*** 3.11±0.32*2.80±0.79*2.50±0.52## 2.44±0.53### 1.81±0.59### 1.43±0.49###(10) (10) (10) (10)(10) (9) (8)盐酸青藤碱片组(30) 3.11±0.32*** 3.10±0.32*2.90±0.70*2.88±0.78#2.63±0.74## 2.00±0.71### 1.75±0.70###(10) (10) (10) (10)(10) (9) (8)盐酸青藤碱片组(15) 3.11±0.31*** 3.10±0.30*3.10±0.87*3.00±0.87#3.01±0.76#2.50±0.53## 2.25±0.85###(10) (10) (10) (10)(10) (9) (8)雷公藤多甙片组(15) 3.31±0.48*** 3.20±0.42*2.70±0.85*2.56±0.53## 2.67±0.71## 2.06±0.86### 1.88±0.79###(10) (10) (10) (10)(10) (9) (8)与正常组比较 *P＞0.05 **P＜0.05 ***P＜0.01与模型组比较 #P＞0.05 ##P＜0.05 ###P＜0.01注-(1分)±(1.5分)+(2分)++(3分)+++(4分)括号内数字为样本数表2 盐酸青藤碱对肾炎兔24 h尿蛋白含量的影响给药后不同时间(周)尿蛋白含量(mg/dlx±SD)组别及剂量注C-BSA后(mg/kg) 2 4 6正常组8.35±4.804.61±2.866.74±2.068.88±2.70(10) (10) (9)(8)模型组 110.80±21.95*** 129.00±50.62*** 127.10±42.82*** 120.89±34.44***(10) (10) (10) (9)盐酸青藤碱片组(60) 102.14±16.43*** 89.60±23.48# 81.11±22.08##44.00±12.59###(10) (10) (10) (8)盐酸青藤碱片组(30) 103.05±21.87*** 84.10±32.56# 85.88±30.81##51.25±17.93###(10) (10) (10) (8)盐酸青藤碱片组(15) 103.19±20.09*** 82.30±14.21# 89.37±29.93# 63.63±15.82###(10) (10) (10) (8)雷公藤多甙片组(15) 108.70±18.40*** 77.80±34.55# 83.88±32.38##53.87±13.51###(10) (10) (10) (8)与正常组比较 *P＞0.05 **P＜0.05 ***P＜0.01与模型组比较 #P＞0.05 ##P＜0.05 ###P＜0.01括号内数字为样本数
(二)对血清肌酐与尿素氮的影响注C-BSA后各组动物血Cr与BUN均明显升高，给药后模型组动物血Cr与BUN仍维持在较高水平直至实验结束。给药3周后盐酸青藤碱片均不同程度的降低血Cr与BUN，其中，30mg/kg盐酸青藤碱片给药6周后降低BUN作用与模型组比较有显著性差异。60mg/kg盐酸青藤碱片在给药3周后，对降低血Cr、BUN与模型组比较均有显著性差异。15mg/kg雷公藤多甙片也有降低血Cr与BUN的作用，(表3、表4)表3盐酸青藤碱片对血清肌酐的影响组别及剂量 注C-BSA后 给药后不同时间(周)Cr含量(umoi/Lx±SD)(mg/kg)3 6正常组 78.87±15.08 89.93±12.03 88.11±20.49(10) (10)(8)模型组112.28±21.02**141.51±31.77**123.89±32.28**(10) (10)(9)盐酸青藤碱片组60 109.19±20.08**110.45±13.43## 91.79±20.43##(10) (10)(8)盐酸青藤碱片组30 110.03±24.48**128.39±21.04# 99.05±11.51#(10) (10)(8)盐酸青藤碱片组15 111.13±18.11**132.76±26.51# 108.31±29.03#(10) (10)(8)雷公藤多甙片组15 109.56±22.64**114.22±11.96## 95.66±10.93##(10) (10)(8)与正常组比较 *P＞0.05 **P＜0.05 与模型组比较 #P＞0.05 ##P＜0.05括号内数字为样本数表4 盐酸青藤碱片对血BUN的影响给药后不同时间(周)BUN含量(mmoi/LX±SD)组别及剂量 注C-BSA后(mg/kg) 36正常组 8.51±2.66 7.93+3.437.06±1.26(10) (10) (8)模型组16.25±2.16**14.29±3.68**14.09±3.65**(10) (10) (9)盐酸青藤碱片组60 16.43±3.33**11.14±2.83## 8.13±2.11##(10) (10) (8)盐酸青藤碱片组30 16.03±2.67**13.64±3.54# 8.93±2.19##(10) (10) (8)盐酸青藤碱片组15 16.06±2.45**13.90±3.09# 10.89±3.72#(10) (10) (8)雷公藤多甙片组15 15.99±3.23**12.17±3.31# 8.43±2.64##(10) (10) (8)与正常组比较 *P＞0.05 **P＜0.05与模型组比较 #P＞0.05 ##P＜0.05括号内数字为样本数(三)对血浆总蛋白(SP)、白蛋白(A)、白/球(A/G)比值的影响注C-BSA后模型组动物由于大量蛋白从尿中丢失，故血浆总蛋白(SP)、A均明显低于正常组。模型组虽后期血浆SP、A有所回升但仍较正常组明显偏低，且A/G比值也明显低于正常。盐酸青藤碱片各剂量组给药3周后使SP不同程度提高，给药6周后，60mg/kg剂量组较同期模型组有显著性差异。盐酸青藤碱片对血浆白蛋白与A/G比值无明显影响，15mg/kg雷公藤多甙能明显提高血浆白蛋白，对A/G比值无明显影响(表5、表6、表7)
表5 盐酸青藤碱片对血浆总蛋白的影响组别及剂量注C-BSA后 给药后不同时间(周)sp含量(g/lx±SD)(mg/kg)36正常组62.20±9.11 68.00±5.60 70.13±8.87(10)(10) (8)模型组45.00±9.18** 51.20±6.94**53.78±10.75**(10)(10) (9)盐酸青藤碱片组60 45.70±13.8** 57.60±6.70# 63.19±5.94##(10)(10) (8)盐酸青藤碱片组30 44.40±10.71** 56.78±8.21# 59.13±4.61#(10)(10) (8)盐酸青藤碱片组15 43.20±10.29** 56.77±4.89# 57.00±6.95#(10)(10) (8)雷公藤多甙片组15 42.40±10.37** 58.33±5.22# 66.25±8.03##(10)(10) (8)与正常组比较 *P＞0.05 **P＜0.05 与模型组比较 #P＞0.05 ##P＜0.05括号内数字为样本数表6盐 酸青藤碱片对血浆白蛋白的影响组别及剂量 注C-BSA后 给药后不同时间(周)A含量(g/lx±SD)(mg /kg)36正常组33.00±7.80 30.00±4.44 32.13±4.91(10) (10) (8)模型组21.70±5.83**20.70±4.27**22.89±5.71**(10) (10) (9)盐酸青藤碱片组60 21.81±8.30**22.30±4.79# 27.63±4.84#(10) (10) (8)盐酸青藤碱片组30 20.70±7.80**21.56±4.67# 25.38±3.50#(10) (10) (8)盐酸青藤碱片组15 19.30±8.27**21.67±4.98# 24.25±4.33#(10) (10) (8)雷公藤多甙片组15 19.60±6.50**23.22±1.39# 28.63±3.20##(10) (10) (8)与正常组比较 *P＞0.05 **P＜0.05 与模型组比较 #P＞0.05 ##P＜0.05括号内数字为样本数表7 盐酸青藤碱片对A/G比值的影响给药后不同时间(周)A/G比值(x±SD)组别及剂量注C-BSA后(mg/kg) 3 6正常组1.16±0.32 0.79±0.11 0.85±0.14(10) (10)(8)模型组0.94±0.28*0.68±0.10**0.73±0.09**(10) (10)(9)盐酸青藤碱片组60 0.91±0.33*0.67±0.22# 0.78±0.15#(10) (10)(8)盐酸青藤碱片组30 0.92±0.41*0.62±0.14# 0.76±0.12#(10) (10)(8)盐酸青藤碱片组15 0.87±0.57*0.65±0.22# 0.74±0.12#(10) (10)(8)雷公藤多甙片组15 0.89±0.31*0.68±0.12# 0.79±0.21#(10) (10)(8)与正常组比较 *P＞0.05 **P＜0.05与模型组比较 #P＞0.05括号内数字为样本数(四)盐酸青藤碱片对血清CIC、β2-MG的影响注C-BSA后的动物2周后血中CIC均明显增加，与正常组比较有显著性差异。模型组至实验结束血中CIC持续偏高，用药3周后，盐酸青藤碱片使血中CIC明显降低，其作用随剂量的增加而增强。第3周时30mg/kg与60mg/kg剂量组、用药6周时60mg/kg剂量组与同期模型组比较有显著性差异。15mg/kg雷公藤多甙片能明显降低兔C-BSA肾炎模型血中CIC含量(表8)
表8盐酸青藤碱片对血CIC的影响组别及剂量 注C-BSA后 给药后不同时间(周)血CIC测定的OD(×102)值(x±SD)(mg/kg) 3 6正常组 7.00±4.16 7.51±1.47 8.94±2.68(10) (10) (8)模型组18.70±9.17**17.21±2.36*** 16.06±3.87***(10) (10) (9)盐酸青藤碱片组60 18.20±3.01**13.19±2.21### 12.74±2.79##(10) (10) (8)盐酸青藤碱片组30 17.90±4.18**14.16±3.19## 14.89±2.49#(10) (10) (8)盐酸青藤碱片组15 18.20±3.33**14.59±3.51# 15.30±2.43#(10) (10) (8)雷公藤多甙片组15 18.10±4.56**13.66±3.69## 12.26±3.01##(10) (10) (8)与正常组比较 *P＞0.05 **P＜0.05 ***P＜0.01与模型组比较 #P＞0.05 ##P＜0.05 ###P＜0.01括号内数字为样本数注射C-BSA后，模型组和各药物组血及尿中的β2-MG含量明显高于正常对照组，模型组在整个实验过程中血及尿中的β2-MG始终维持在较高的水平。用药3周后，30、60mg/kg盐酸青藤碱片与15mg/kg雷公藤多甙片均使血β2-MG明显降低。各剂量盐酸青藤碱片及雷公藤多甙片均对尿中β2-MG无明显影响。给药6周后.盐酸青藤碱片各剂量组与雷公藤多甙片组的血β2-MG含量接近正常组水平。而15、30mg/kg盐酸青藤碱片、15mg/kg雷公藤多甙片使尿中β2-MG含量减少(表9)
表9盐酸青藤碱片对兔C-BSA肾炎模型β2-MG的影响x±SD注C-BSA后(ng/L)用药后(ng/kg)药物 剂量 3周 6周mg/kg 血 尿 血 尿 血尿正常对照 - 139±37 46±14 108±45 45±15 111±1633±10(10) (10) (10) (10)(8) (8)模型对照 - 189±37*** 68±15*** 279±77*** 94±59** 171±85** 71±20***(10) (10) (10) (10)(9) (9)盐酸青藤碱片 15 196±56*** 72±11*** 247±82*** 49±19*117±31* 52±13***(10)## (10)#(10)# (10)# (8)# (8)##盐酸青藤碱片 30 189±35*** 66±16***91±13*71±41*114±30* 45±13**(10)# (10)#(10)###(10)# (8)# (8)###盐酸青藤碱片 60 187±26*** 77±13*** 112±35*54±21*114±15* 52±18***(10)# (10)#(10)###(10)# (8)# (8)#雷公藤多甙片 15 185±45** 69±15***83±50*58±21*116±27* 39±11*(10)# (10)#(10)###(10)# (8)# (8)###与正常组比较 *P＞0.05 **P＜0.05 ***P＜0.01与模型组比较 #P＞0.05 ##P＜0.05 ###P＜0.01括号内数字为样本数
(五)肾组织病理检查光镜观察模型组动物，肾小球炎症现象明显，肾小球直径及肾小球内细胞数均明显增大(增多)，与正常对照组比较有显著性差异(P＜0.01)。各剂量盐酸青藤碱片组肾小球直径及肾小球内细胞数均明显小于模型组，并有显著性差异。雷公藤多甙片也能明显改善C-BSA肾炎模型的肾脏病理状态。(表10、表11)表10 盐酸青藤碱片对肾组织病理学的影响肾小球 肾间质 肾小管组别及剂量动物数 毛细管 Wbc 新月体 纤维化 炎细胞 萎缩 变性 管型(mg/kg)(只) 腔狭窄 浸润正常组 8 0/80/8 0/80/81/80/8 1/8 0/8- - - - ± -±-模型对照 9 9/99/9 0/90/99/90/9 9/9 9/9+～++ +～++ - - + -++ +～++盐酸青藤碱片组60 8 0/83/8 0/80/84/80/8 3/8 1/8- ±- - ±～+ -±～+ ±盐酸青藤碱片组30 8 0/82/8 0/80/82/80/8 1/8 1/8- ±- - ±～+ -±±盐酸青藤碱片组15 8 0/81/8 0/80/82/80/8 1/8 1/8- ±- - ± -±±雷公藤多甙片组15 8 0/80/8 0/80/81/80/8 1/8 0/8- - - - ± -±-
表11对肾小球直径及肾小球内细胞数的影响组别及剂量 动物数肾小球(mg/kg) (只) 直径(μm)x±SD 细胞数(个)x±SD正常组8 84.73±6.11 66.45±8.86模型对照 9124.17±12.19*** 96.01±11.51**盐酸青藤碱片组60 8 92.89±7.58### 80.35±11.54#盐酸青藤碱片组30 8101.79±11.64## 74.65±8.01##盐酸青藤碱片组15 8 97.95±9.79##68.00±8.69##雷公藤多甙片组15 8101.57±8.73##71.90±6.64##与正常组比较 *P＞0.05 **P＜0.05 ***P＜0.01与模型组比较 #P＞0.05 ##P＜0.05 ###P＜0.01二、对正常与水负荷大鼠尿量的影响与生理盐水比较，5mg/kg氢氯噻嗪能明显增加正常与水负荷大鼠的排尿量，较生理盐水组均有极显著性差异。随剂量的加大，盐酸青藤碱片能逐渐增加正常大鼠的排尿量，但均无统计学显著性差异。盐酸青藤碱片能增加水负荷大鼠的排尿量，并随剂量加大，其作用增强，80mg/kg时较生理盐水组有显著性差异。20mg/kg雷公藤多甙片对正常与水负荷大鼠尿量的影响与生理盐水组比较无明显差异(表12)
表12 盐酸青藤碱片对大鼠尿量的影响X±SD n＝8药物 剂量 5h尿量(g/100g体重)mg/kg 正常 水负荷正常对照 - 1.29±0.18 2.28±0.20氢氯噻嗪 5 2.38±0.15***3.93±0.49***盐酸青藤碱片 201.26±0.78 2.44±0.26盐酸青藤碱片 401.47±0.19 2.47±0.44盐酸青藤碱片 801.60±0.60 2.69±0.32**雷公藤多甙片 201.43±0.46 2.58±0.60与生理盐水组比较 **P＜0.05 ***P＜0.01
讨论慢性肾小球肾炎是临床常见的难治性疾病之一，目前真正有效的治疗药尚不多见。
盐酸青藤碱片临床用于治疗风湿与类风湿性关节炎已有十余年的历史，其疗效已得到了广大医生与患者的肯定。大量的实验研究证实盐酸青藤碱的治疗作用主要与其抗炎、免疫抑制或免疫调节作用有关，一般认为肾小球肾炎基本的发病机理是免疫介导的炎症反应。其主要病理改变为肾小球血管基底膜免疫复合物沉积，血管通透性改变，肾小球滤过率降低。临床以蛋白尿、血尿、管型尿、水肿及高血压或伴有血肌酐、尿素氮升高等肾功能减退为主要表现。为了寻找治疗慢性肾小球肾炎的有效药物，本研究用C-BSA复制家免膜性肾小球肾炎动物模型，观察了盐酸青藤碱片的治疗作用。
实验结果表明盐酸青藤碱片可明显减少由C-BSA诱发的肾炎动物循环免疫复合物(CIC)的形成，明显减轻实验动物的蛋白尿。尿蛋白的轻重反映肾小球基底膜的病变程度，说明本品有减轻免疫损伤和肾小球病变程度的作用。
尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)的代谢绝大部分由肾小球滤过后排出体外，当肾小球滤过功能受损时，血中BUN与Cr必将随之而升高。β2-MG是一种与免疫有关的低分子蛋白，正常时以极微量存在于体液中，易于从肾小球滤过并几乎全部在近端肾小管重吸收和分解代谢。若肾小球滤过障碍则血中Cr、BUN、β2-MG升高。尿中β2-MG升高表明肾小管重吸收功能受损。盐酸青藤碱片能有效地降低血BUN、Cr与血及尿中β2-MG含量，表明其具有改善肾小球滤过功能的作用。
肾小球直径及肾小球内细胞数可反映肾小球炎症的程度。前者反映肾小球的肿胀情况，后者表明细胞的增殖与浸润情况。实验证实盐酸青藤碱片对改善肾小球的炎症现象有一定作用。光镜下形态定量分析，盐酸青藤碱片治疗组肾小球平均直径和肾小球内细胞数均低于模型组。表明肾小球内炎症减轻，滤过膜的通透性得到改善。
盐酸青藤碱是从中药青风藤中提取的有效部位，“祛风湿、通经络、利小便”和“行水利尿”是青风藤的主要功效之一。对这一作用的认识，古籍早已有记载。本研究表明，盐酸青藤碱在增加动物尿量方面显示出了良好的作用趋势，对水负荷大鼠有一定利尿作用，使青风藤的行水利尿功效得到了实验证实。水肿是慢性肾炎的常见症状之一，盐酸青藤碱的这一作用将有益于慢性肾炎症状的改善。
以上结果表明盐酸青藤碱片具有减少免疫复合物的形成、改善肾小球血管通透性和滤过功能及减轻肾小球炎症反应的功效。故可用于慢性肾炎的治疗。一般认为，慢性肾炎是一种免疫介导的炎症反应，属自身免疫性疾病。由于抗原抗体复合物在肾小球基底膜沉积，并引发一系列特异性与非特异性炎症反应，造成了对肾小球的破坏，形成各种病理反应。盐酸青藤碱的抗炎作用人们已早有认识。具对免疫功能的影响，我们的实验研究(见附件)和不少的研究报道证实，[4][5][6]盐酸青藤碱对细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫均有抑制作用。盐酸青藤碱的抗炎与免疫作用可使慢性肾炎病变中肾小球的免疫性炎症得到控制和缓解，有助于滤过膜通透性和滤过功能改善，从而可以促进肾炎病变的消退。由此推测，盐酸青藤碱治疗慢性肾炎有效可能是与其抗炎与免疫抑制作用有关。
实验例2盐酸青藤碱片对免疫作用的实验研究实验材料1、药物盐酸青藤碱片，由湖南正清新药开发中心提供，批号941218；环磷酰胺片，上海天平制药厂提供，批号930501A；雷公藤多甙片，中国湖南株洲市制药三厂出品，批号950301；盐酸左旋咪唑片，上海延安制药厂出品，批号940201。
2、动物BALB/C纯系小鼠，体重18-22克，雌雄兼用，由上海B.K实验动物中心提供。(合格证号码0001750)。
方法与结果1、盐酸青藤碱对小鼠免疫器官重量的影响将体重18-22克的小鼠雌雄各半，随机分成六组，分别为盐酸青藤碱20、40、80毫克/公斤组，环磷酰胺30毫克/公斤组，雷公藤多甙40毫克/公斤组及蒸馏水对照组。动物按等体积20毫升/公斤灌胃给药，每天一次，连续给药10天。末次给药后24小时，处死动物，取胸腺、脾脏称重。
结果表明，盐酸青藤碱能明显减轻小鼠胸腺和脾脏的重量，对胸腺的影响较脾脏强，与对照组比较有显著性差异。(见表1)表1 盐酸青藤碱对小鼠免疫器官重量的影响(X±SD)组别 剂量 动物数 胸腺系数 脾脏系数(n) (mg/10g) (mg/10g)对照组--10 28.20±5.5952.23±7.59盐酸青藤碱组 2010 22.04±4.19※47.74±6.27盐酸青藤碱组 4010 17.37±5.44※※※41.63±10.43※盐酸青藤碱组 8010 20.72±7.46※45.32±10.71环磷酰胺组3011 10.20±4.87※※※32.26±12.42※※※雷公藤多甙组 4010 20.43±5.82※※47.84±5.22注※与对照组相比 ※P＜0.05 ※※P＜0.01 ※※※P＜0.0012、盐酸青藤碱对小鼠淋巴细胞转化功能的影响18～22g小鼠，雌雄各半分组及给药方法同前。按文献方法[2]，无菌条件下取脾脏制成脾细胞悬液。用Hank’s液洗细胞2次，用含10％小牛血清RPMI-1640将细胞调至所需浓度，加入到96孔板中培养，每孔100μl，每个样品设三个复孔，加入ConA10ug/ml，培养72h，培养结束前6h，加入3H-Tdk0.5μci/孔，用多头细胞收集器收集细胞，加入闪烁液，于Beckman液闪仪上测定样品的放射强度(cpm)。
结果表明，盐酸青藤碱对激活剂conA诱导转化细胞的3H-Tdk掺与均有抑制作用。(见表2)3、盐酸青藤碱对小鼠白细胞介素II(IL-2)的影响按文献方法[2]，上述淋转实验时，同时将脾脏进行IL-2依赖细胞株(CTLL2)培养，CTLL2细胞在条件培养基中于24孔板中传代。然后在96孔板中稀释标本，稀释度为1∶2，1∶4，1∶16，1∶32，1∶64，体积为0.1ml，每一稀释度3个复孔，将CTLL2细胞从24孔板中吸入离心管中，加RPMI-1640，2000×10分钟离心，重复三次洗涤细胞，用含10％小牛血清RPMI-1640调整细胞浓度为1×105/ml，将调整好浓度的CTLL2细胞加入到已稀释标本96孔板中，每孔0.1ml，轻轻混匀，放5％CO237℃培养箱中培养17hr，加入3H-Tdk0.5μci/孔，继续培养6hr，用多头细胞收集器收获细胞，加入闪烁液，于Beckman液闪仪上测cpm。以不同稀释度IL-2标本用cpm值作直线回归，即用Y＝a+b X公式计算IL-2活性单位。
结果表明，盐酸青藤碱能明显抑制IL-2的活性，与蒸馏水对照组相比有显著性差异。其抑制强度随药物浓度升高而增强，作用较30mg/kg环磷酰胺组更为明显，80mg/kg盐酸青藤碱抑制IL-2生成的作用较40mg/kg雷公藤多甙有显著性差异。(见表2)
表2 盐酸青藤碱对淋巴细胞转化率及IL-2的影响(X±SD)组别 剂量 动物数 淋转 IL-2(n)(刺激指数) (生长指数)对照组-- 10 3.22±0.69 15.72±3.17盐酸青藤碱组 20 10 2.19±0.93※6.04±2.14※※※盐酸青藤碱组 40 10 2.30±0.76※5.93±3.61※※※盐酸青藤碱组 80 10 3.00±1.29 4.16±1.78△△※※※环磷酰胺组30 11 1.52±0.45※※※9.19±2.18※※※雷公藤多甙组 40 10 1.74±0.37※※※8.16±2.97※※※注※与对照组相比 ※P＜0.05 ※※P＜0.01 ※※※P＜0.001·与环磷酰胺组相比 ·P＜0.05 ··P＜0.01 ···P＜0.001△与雷公藤多甙组相比 △P＜0.05 △△P＜0.014、盐酸青藤碱对迟发型超敏反应的影响18～22g小鼠，雌雄各半，随机分成六组，分别为盐酸青藤碱20、40、80mg/kg组，环磷酰胺30mg/kg组，雷公藤多甙40mg/kg组与蒸馏水对照组。连续灌胃10天，给药第5天各组小鼠用1％二硝基氯苯溶液10μl均匀涂于小鼠腹部脱行部位致敏，次日强化一次，致敏后5天，用1％二硝基氯苯溶液10μl均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击，24hr后，颈椎脱臼处死小鼠，剪下耳壳，在相同部位各打下一直径8mm的耳片，称重。以左右耳片重量之差作为判断反应的指标[3]。
结果表明，盐酸青藤碱对二硝茎氯苯诱发的耳廓迟发型超敏反应有明显的抑制作用。40、80mg/kg组与对照组比较有显著性差异。(见表3)表3 盐酸青藤碱对迟发型超敏反应的影响(X±SD)组别 剂量 动物数 淋转(n)(刺激指数)对照组-- 10 0.15±0.09盐酸青藤碱组 20 10 0.09±0.05盐酸青藤碱组 40 10 0.09±0.02※盐酸青藤碱组 80 10 0.08±0.03※环磷酰胺组30 11 0.07±0.04※雷公藤多甙组 40 10 0.08±0.03※注※与对照组相比 ※P＜0.05 ※※P＜0.01 ※※※P＜0.001
5、盐酸青藤碱对巨噬细胞吞噬功能的影响将18～20g小鼠随机分成七组，按表4所示剂量分别灌胃给药，连续10天，除蒸馏水对照组外，其余各组每2天一次按26mg/kg灌胃左旋咪唑溶液，每6天每鼠腹腔注射0.5％淀粉溶液0.5ml，每10天每鼠腹腔注射5％鸡红细胞悬液0.5ml，间隔12小时，颈椎脱臼处死小鼠，采用滴片法[4]，取腹腔液滴于载玻片上，37℃温育30分钟，用生理盐水冲去滴片上悬浮的未被吞噬的鸡红细胞及其它细胞，甲醇固定，Glemsa-Wright染液染色，油镜下观察，计算吞噬百分率和吞噬指数。
结果表明，盐酸青藤碱对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的百分率和吞噬指数均显著降低，与对照组比较有显著性差异，并随剂量的增大其吞噬百分率和吞噬指数降低。(见表4)表4 盐酸青藤碱对巨噬细胞吞噬功能的影响(X±SD)组别 剂量 动物数吞噬率 吞噬指数(gm/kg) (n) (％)对照组 -- 10 59.9±9.51 1.71±0.19左旋咪唑组 26 72.3±9.07※※2.01±0.25※※盐酸青藤碱+左旋咪唑组 20 10 52±14.58 1.49±0.33盐酸青藤碱+左旋咪唑组 40 10 49.2±11.06※1.41±0.39※盐酸青藤碱+左旋咪唑组 80 10 48.8±10.18※1.32±0.32※※环磷酰胺+左旋咪唑组30 10 44.1±12.15※※1.09±0.27※※雷公藤多甙+左旋咪唑组 40 10 47.6±12.38※1.38±0.36※注※与对照组相比 ※P＜0.05 ※※P＜0.01 ※※※P＜0.001
6、盐酸青藤碱对抗体溶血素产生的影响将18～22g小鼠，雌雄各半，随机分成五组，分别为盐酸青藤碱20、40、80mg/kg组，环磷酰胺30mg/kg组及蒸馏水对照组。连续灌胃给药10天，第3天每鼠腹腔注射5％鸡红细胞悬液0.2ml致敏后7天，摘取眼球取血，稀释血清加鸡红细胞悬液及稀释豚鼠血清，温育30分钟后离心，比色测定光密度。以光密度读数作为判定血清溶血素的指标，比较各组的差异[4]。
结果表明，盐酸青藤碱剂量为20.40mg/kg时均可明显降低小鼠抗体溶血素的水平。(见表5)表5盐酸青藤碱对小鼠溶血素产生的影响(X±SD)组别剂量 动物数O.D值(mg/kg) (n)对照组 -- 10 0.72±0.24盐酸青藤碱组 20 12 0.53±0.20※盐酸青藤碱组 40 90.52±0.13※盐酸青藤碱组 80 10 0.72±0.16环磷酰胺组 30 11 0.046±0.017※※※注※与对照组相比 ※P＜0.05 ※※P＜0.01 ※※※P＜0.001
小结结果表明，口服一定剂量的盐酸青藤碱能明显降低小鼠胸腺和脾脏的重量，对小鼠淋巴细胞转化率，IL-2，迟发型超敏反应，巨噬细胞的吞噬功能及抗体溶血素的产生均呈免疫抑制作用，提示盐酸青藤碱对非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫均有抑制作用。有文献报导[1，5]，盐酸青藤碱注射给药可明显抑制机体的免疫功能，本文口服给药所得的结果与文献报导的一致。
胸腺是重要的免疫器官，胸腺淋巴细胞是全身T细胞的来源，T细胞在机体细胞免疫中具有重要功能[6]。盐酸青藤碱使胸腺重量明显降低，对淋巴细胞转化率，IL-2的活性，迟发型超敏反应有明显的抑制作用，说明盐酸青藤碱对细胞免疫的抑制作用主要与抑制T淋巴细胞有关，而对巨噬细胞吞噬功能及抗体溶血素的形成呈现免疫抑制作用，说明对机体非特异性免疫、体液免疫亦有抑制作用。
参考文献1.彭慧敏等，中国药理学报，1988年7月；9(4)3772.湖南医科大学《免疫学实验指导》研究生用3.《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》中华人民共和国卫生部药政局，1993，权利要求
1.青藤碱及其药物学上可接受的盐在制备治疗慢性肾炎的药物中的应用。
2.根据权利要求1的用途，其中所述的慢性肾炎是肾小球肾炎。
3.根据权利要求1的用途，其中所述的青藤碱的药物学上可接受的盐是盐酸青藤碱。
4.青藤碱在制备治疗慢性肾炎的药物中的应用。
5.根据权利要求4的用途，其中所述的慢性肾炎是肾小球肾炎。
全文摘要
本发明是关于青藤碱及其药物学上可接受盐的新用途，具体说是青藤碱及其药物学上可接受的盐在制备治疗慢性肾炎的药物中的应用。
文档编号A61K31/485GK1142946SQ9610657
公开日1997年2月19日 申请日期1996年6月27日 优先权日1995年8月9日
发明者仇萍, 邱赛红 申请人:白云山正清制药股份有限公司