专利名称：含有全氟化碳的右旋糖酐白蛋白声学造影剂及其制作方法
技术领域：
本发明涉及一种声学造影剂，具体说是一种由药理学上可接受的糖类和人体白蛋白以及惰性气体组成的超声造影剂。这种造影剂可用于人体诊断目的，它不仅可用于心脏病学领域，也可用于其它能够采用这种造影剂进行超声显象的领域。本发明还提供了这种造影剂的制作方法。
已有报告，多种潜在的声学造影剂可用于对比超声心动图。虽然有许多报导某些造影剂可通过肺部到达左室，但目前临床上尚无一种声学造影剂在静脉注射后使心肌显影。欲在心肌对比超声显象这一新的领域中进一步发展，先决条件是发明一种标准化的声学造影剂，这种造影剂含有均匀一致的稳定的微小气体，静脉注射后能使心肌可靠显影。
经外周静脉注射微泡造影剂而达到心肌视觉可见的显象，在目前尚无可能。这是因为微泡内的氧气和氮气可快速在血液中弥散并在血液中溶解。为了使声学造影剂在静脉注射后非损伤性测定心肌血流灌注，必须首先通过肺循环而使左室腔显影。
本发明的一个重要目的是提供这种通过肺循环而使左室腔显影的造影剂，这种造影剂可用于人体诊断目的，它不仅可用于心脏病学领域，也可用于其它能够采用这种造影剂进行超声显象的领域。
本发明的目的还在于提供一种由药理学上可接受的糖类和人体白蛋白的声振溶液组成的超声造影剂，这种造影剂是一种由低血液溶解度和弥散性的惰性气体所增强的造影剂。
本发明的目的还在于提供上述所说造影剂的制作方法。
下面对实现本发明的技术方案进行详细描述。
声振白蛋白已在人体用于研究冠脉血流和经皮血管成形术(PTCA)后立即估价前向血流储备。在无明显冠状动脉疾病的病人，在罂粟碱注射前后，经左主冠状动脉注射声振白蛋白，使用时间强度曲线来估价冠脉血流储备。已经证明，人体心肌超声对比剂的清除与创伤性方法测定的冠脉血流相关。
在冠状动脉疾病时，对经皮血管成形术(PTCA)后冠脉内注射声振白蛋白也已有研究。经经皮血管成形术(PTCA)治疗后的血管所供应的心肌储备，在术后有明显改善。改善的程度不取决于经皮血管成形术(PTCA)肉眼可见的成功与否，而取决于狭窄面积定量证实是否成功。声振白蛋白经静脉注射后不能可靠的通过肺循环进入左室，因此，目前不能用于非损伤地发现心肌血流。
已经观察到微泡直径在静态液体中作为时间的函数而减少，这是因为微泡内外之间存在弥散梯度。微泡大小的增加对血中微泡的持久性有明显的作用。声振右旋糖酐白蛋白微泡的平均大小为4-7微米。尽管这一大小对于通过肺循环是理想的，但是由于在静脉注射后到左室的过程中，微泡中气体的明显弥散，使得它们在左室和心肌内的视频密度明显丧失。使用像全氟化碳这类气体增强的微泡比空气具有更低的血液溶解性，比单用声振白蛋白产生更明显的左室和心肌视频密度。
由于表面张力较高，微泡内部的氮气和氧气的浓度明显高于血液的浓度，因此静脉注射后，这种气体可向血液内快速弥散，但氮气似乎比氧气弥散更慢。由于氮气是空气中的主要成分，减少氮气通过微泡的浓度梯度将改善静脉注射后左室和心肌视频密度。在声振过程中将微泡的浓度暴露于比氮气具有更低血溶解性和弥散性的惰性气体，且此气体的密度大于0.3磅/英尺3，可增加右旋糖酐白蛋白的稳定性，而减少微泡在血中的溶解性和弥散性。
因此，本发明提供了一种由药理学上可接受的糖类和人体白蛋白的声振溶液组成的超声造影剂，这种造影剂是由低血液溶解度和弥散性的惰性气体所增强的造影剂。
考虑到制备成药学上可接受的剂型，上述的糖类是右旋糖酐。所说的惰性气体包括药理学上可接受的那些气体密度大于0.3磅/英尺3的惰性气体，例如，全氟化碳或六氟化硫，这些气体已经安全用于人体的眼球内注射，以稳定视网膜的附着(Wang AndThompson，Ophthalmology95609-613)。这些气体通过内部填塞来治疗视网膜剥离，并作为治疗这种疾病的标准方法。
本发明造影剂的微泡浓度大于5×108/ML。这种浓度对于获得独特的超声心动图是极为重要的，该微泡浓度优选范围是1×108/ML-1×1010/ML，特别优选范围是5×108/ML-2.0×109/ML，最佳浓度范围是1×109/ML-1.5×109/ML。如果将5％人血白蛋白用右旋糖酐稀释2-8倍，优选稀释2-5倍，然后与气体密度大于0.3磅/英尺3的气体混合后再进行声振处理，则效果更好。
一般而言，就超声医学应用来说，本发明的造影剂是以药学上有效剂型来配方，用于人体的静脉注射或冠状动脉内注射。因此，本发明的造影剂是一种药理学上可接受剂型的声振超声造影剂，以便注入哺乳动物体内使用，这种造影剂是一种用药学上可接受的液体糖化物进行多倍稀释的声振白蛋白，其生成的微泡浓度大于5×108/ML，心肌视频密度峰值至少大于基线的50％。在声振处理前使用药理学上可接受的惰性气体以增强本发明的造影剂，这种气体的密度大于0.3磅/英尺3。
本发明的糖化物溶液可以是一种单糖溶液，即分子式是C6H6O12，如己糖、右旋糖酐、左旋糖酐或其混合物，也可以是液体双糖溶液，即分子式是C12H22O11，例如蔗糖、乳糖、麦芽糖或其混合物。本发明典型的惰性气体包括全氟丙烷(分子式C3F8)，其气体密度约为0.498磅/英尺3，分子量为188G/MOLE；全氟丁烷(分子式C4F10)，其气体密度约为0.600磅/英尺3，分子量为238G/MOLE；全氟戊烷(分子式C5F12)，其气体密度约为0.780磅/英尺3，分子量为284G/MOLE；六氟化硫(分子式SF6)，其气体密度约为0.382磅/英尺3，分子量为146G/MOLE。其中惰性气体优选使用全氟丁烷和全氟戊烷，特别是，全氟戊烷常温下是液体，在使用时需要将其加温至35℃，以取得理想惰性气体。显然，其它具有类似气体密度的惰性气体也适用于本发明。一般就本发明所用剂型而言，我们使用商业上可获得的人体白蛋白(2％-50％)和商业上可获得的右旋糖酐(5％-70％)，经与气体混合后，在含有空气的大气环境下，进行声振处理。本发明倾向于用5％-50％的右旋糖酐来稀释白蛋白溶液。稀释后的白蛋白浓度为0.5-5％。当这种右旋糖酐-白蛋白混合液与全氟化碳充分混合后，再进行声振处理80秒，可产生极好的效果。
因此，本发明的造影剂是一种含有全氟化碳或六氟化硫的声振右旋糖酐白蛋白溶液，优选由2-10％的右旋糖酐稀释2-8倍的约2-10％人体白蛋白构成。所说的溶液用全氟化碳或六氟化硫充分混合，然后，用声振仪进行处理。在处理过程中，将会形成无数微小气泡，气泡被蛋白所包裹，随着强度的升高，蛋白外壳将变硬。由上述惰性气体构成的气泡在血中的溶解性和弥散性均较低。声振后将此微泡造影剂转移到另一消毒器皿中，然后静脉注入到哺乳动物体内。所说的哺乳动物可以是人类、犬、猴等。
本发明优选使用5％或50％的右旋糖酐将5％白蛋白溶液稀释1-5倍，即，用1份-5份的右旋糖酐稀释1份白蛋白，这种有效剂型可用于静脉内或冠状动脉注射。
本发明特别优选的造影剂是使用5％的右旋糖酐将5％白蛋白溶液稀释3倍，即，用3份的5％右旋糖酐稀释1份5％白蛋白。
一般而言，声振方法能够产生大于1×108/ML浓度和3-7微米大小的微泡(参见美国专利U.S.4，572，203)。但我们的方法可产生大于5×108/ML浓度的微泡。
本发明制备超声造影剂的方法包括下述步骤(1)用2％-70％的右旋糖酐将2％-25％的人体白蛋白稀释成0.5-5％的混合液。充分混合。
(2)取全氟化碳或六氟化硫等惰性气体与上述混合液充分混合。
(3)将上述通入惰性气体后所得的混合液用声振方法(sonicate)处理40-150秒。
上述的超声造影剂中个组分的体积比是2％-70％的右旋糖酐 1-50份2％-25％的人体白蛋白 1-10份药理学上可接受的惰性气体 1-10份。
上述的超声造影剂中个组分的优选体积比是5％右旋糖酐 3份5％人体白蛋白1份药理学上可接受的惰性气体2份。
本发明的造影剂在静脉内注射后，通过超声心动图可以测定心肌血流灌注和心肌视频密度、峰值等。因此，本发明的造影剂可以改进超声心动图测定心肌血流和左室视频密度的方法。这种对测定方法的改善包括用本发明的新型造影剂取代目前用于病人的造影剂。这可以产生最佳的心肌显象和心肌视频密度效果。虽然目前有各种方法在常规超声心动图中应用，但是经静脉注射使用的造影剂更具实用价值。由于本发明使用全氟化碳气体、右旋糖酐与白蛋白的稀释方法，特别是本发明的造影剂具有极为重要的经声振处理后产生的极为稳定的微泡以及特定的微泡浓度，这使得静脉注射本发明的造影剂后，出现更高程度的心肌显影、心内膜边缘显现，并增强了动脉系统多普勒信号显示。因此，本发明使用的经外周静脉注射的造影剂是特别优选的。
使用本发明方法制作的声振白蛋白右旋糖酐混合剂，在声振过程前或过程中可按一定的方法，注入氟碳化物，由此而产生具有重要作用的微泡浓度，能明显改善造影剂通过肺循环，达到心肌造影和左室造影的目的。与声振白蛋白比较时这种方法有三个方面的临床意义第一，氟碳化物增强的右旋糖酐白蛋白混合物经静脉注射具有发现心肌显影和心肌灌注的可能性，因此，这种新的超声造影剂能使超声心动图如同核医学那样对心肌灌注进行定量，且无放射性；第二，使用特定比例的右旋糖酐与白蛋白混合液可用于静脉和冠状动脉内注射；第三，使用这种稀释液可减少造影剂的费用。
如上所述，先用右旋糖酐溶液与人血白蛋白稀释，其后，将溶液与氟碳化合物或六氟化硫暴露后进行声振处理，产生小而稳定的微泡超声造影剂。这些微泡是超声造影作用的来源。因此，产生这些微泡的方法必须产生能小到通过微泡管的程度，大到能足以产生心肌造影的有效程度。
用超声能量方法进行的声振法可使白蛋白溶液产生空穴作用，这种空穴作用产生共振及其微泡(4-7微米)，这种微泡是非塌陷的和稳定的。因此，按照本发明方法，右旋糖酐与白蛋白并加入上述惰性气体可以改善微泡稳定性，减少微泡气体在血中的溶解性和弥散性，增加心肌的对比作用。
静脉注射声振白蛋白，在80％的病例中可产生左室腔内的视频密度。由于大部分微泡气体在通过肺循环时被破坏，所以到达左心的微泡浓度要少于右室，微泡在左室腔内的稳定性也减低。如果高浓度的微泡可达到左室腔内，可有足够的微泡进入冠状动脉循环，以测定心肌造影和心肌血流。冠状动脉内注射声振白蛋白可用于发现冠脉血流储备和测定是否经皮血管成形术(PTCA)成功而改善了冠脉血流储备。但是，静脉内注射声振白蛋白在临床上受到很大限制，因为微泡经过肺循环的结果变异很大。
单独使用声振右旋糖酐也不能产生稳定的微泡溶液，只有通过本发明方法制备的用惰性气体增强的声振白蛋白与右旋糖酐的稀释液，静脉注射后，可产生最大作用的心室视频密度。
改善声振白蛋白通过肺循环作用的重要性有三点第一，已经发现，单用声振白蛋白不能恒定的通过肺循环，并到达左室。为了能够使视觉发现心肌对比和心肌灌注，必须要有高浓度的微泡进入左心室；第二，声振白蛋白的微泡进入左室的效果是不稳定的，事实上，当心室压力升高时微泡丧失了在左室的视频密度。到达左室的微泡必须能够经受左室腔内自然发生的压力；第三，5％人体白蛋白较为昂贵，供应有限，因此，本发明经稀释的超声对比剂既可达到通过肺循环的作用，又更为经济。
实施例1 制备声振右旋糖酐白蛋白从商业上购得5％人血白蛋白和5％右旋糖酐，用于声振处理的声振仪是HEAT SYSTEMS的超声处理仪XL2020。所采用的1/2英寸的探头在每次进行声振时均进行消毒。
将约16毫升的1∶3比例的白蛋白与右旋糖酐液体移入35毫升的注射器中，将LEUR-LOK注射器与一个三通开关相连，将5-10ml任何一种全氟化碳或六氟化硫气体通过三通开关注入溶液内，并快速来回注射约40次，使全氟化碳或六氟化硫与右旋糖酐和白蛋白的混合液充分混合。然后，去除注射器头端的塞子，将消毒过的声振探头伸入注射器的开口端，直到接触到白蛋白-右旋糖酐溶液的表面。溶液接触到探头表面后，用手固定在这一位置，此时使连续波的声振频率为19950±50HZ，时间80±5秒。
声振处理后，将微泡溶液抽入另一无菌的35毫升注射器内备用。
用血球计数器测定微泡的大小，并用显微镜检查微泡是否有粘合在一起的情况。使用Coulter Counter测定微泡浓度。如果出现平均直径小于3微米或大于7.5微米并粘附在一起的微泡、或者微泡平均浓度小于5×108或大于1×1010微泡/毫升，则制备的造影剂不能使用。
在静脉注射之前，将造影剂储存在35毫升注射器中。所有注射溶液在36小时之内使用。并且所有标本在层流室内制备。
实施例2 用不同方法制备声振右旋糖酐白蛋白从商业上购得5％人血白蛋白和5％右旋糖酐，用于声振处理的声振仪是HEAT SYSTEMS的超声处理仪XL2020。所采用的1/2英寸的探头是在每次进行声振时均进行消毒。
将约16毫升的1∶3比例的白蛋白与右旋糖酐液体移入35毫升的注射器中，将LEUR-LOK注射器与一个三通开关相连，将右旋糖酐与白蛋白溶液手动混合7-8秒后，去除注射器头端的塞子，将消毒过的声振探头伸入注射器的开口端，直到接触到白蛋白-右旋糖酐溶液的表面。溶液接触到探头表面后，用手固定在这一位置，此时使连续波的声振频率为19950±50HZ，时间80±5秒。在此期间，将5-10ml任何一种全氟化碳或六氟化硫气体通过三通开关注入溶液内，并快速来回注射约40次使全氟化碳或六氟化硫与右旋糖酐和白蛋白的混合液充分混合。
声振处理后，将微泡溶液抽入另一无菌的35毫升注射器内备用。
实验例1 对声振右旋糖酐白蛋白微泡气体溶解性和弥散性的改变将13条犬手术开胸，静脉接受同等剂量的声振右旋糖酐白蛋白溶液。该溶液已经分别与100％室内空气、100％氮气、100％氦气和100％六氟化硫暴露接触。氮气比空气的血液溶解度低，而氦气和六氟化硫的血液溶解度更低，六氟化硫的弥散性最低。为了进一步减少弥散性，每一样本在吸入空气时同时吸入相应气体。表1表示的是与六氟化硫混合并吸入六氟化硫产生最大的左室频谱密度峰值。
表1
*＝与SDA比较P＜0.05(方差分析)；**＝与其它所有组比较P＜0.05。PVI＝视频密度峰值；SDA＝声振右旋糖酐白蛋白；N＝SDA加入氮气；He＝SDA加入氦气；SF＝SDA加入六氟化硫；inhal＝同一种制剂同时吸入同一气体。
从上表可知，含有六氟化硫的声振右旋糖酐白蛋白产生了左室腔最大的视频密度。由于在静脉注射时它吸入了六氟化硫，其血液溶解性和弥散性在这几种气体中最低。当将含有六氟化硫的造影剂浓缩后，再静脉注射，80％可产生视觉可见的心肌显影。
这一实验表明，在静脉注射前可以很容易地改变微泡气体的组成，而改变气体成分的微泡明显改变了左室腔内视频密度。
实验例2声振含全氟化碳气体的右旋糖酐白蛋白造影剂对心肌显影的影响将4条犬手术开胸，心室内注射0.5毫升声振右旋糖酐白蛋白。使用3.5MHZ探头获取心外膜的左室短轴图，以确定心肌视频密度峰值。结果显示于表2。
表2
PVI＝视频密度峰值；SDA＝声振右旋糖酐白蛋白；SF＝六氟化硫。
表2表明含有较低血液溶解性和弥散性的气体产生较高的心肌视频密度，而含有全氟化碳气体的造影剂产生最高的视频密度。仅有含全氟化碳的造影剂才出现视觉可分辨的心肌显象。这一结果表明用全氟化碳的声振右旋糖酐白蛋白可以明显增强心肌造影作用。这些研究结果还表明本发明的声学造影剂有可能在静脉注射后非损伤性估测心肌血流灌注。
实验例3使用含有全氟化碳的声振右旋糖酐白蛋白测定人体心肌血流给人体静脉注射2-4毫升含有全氟化碳的微泡造影剂，然后用10毫升盐水冲洗。这一剂量因病人而异，体表面积较大的病人可能需要较高的剂量。所有病人在最初都接受了2毫升的注射。如未能产生心肌显象，则加大剂量，直至3-4毫升。这一剂量产生的心肌显影可用于测定心肌血流。在整个超声心动图检查中，检测和记录病人的心率、血压和氧饱和度。每次注射后获得了左室内和心肌内高峰视频密度。
权利要求
1.一种超声造影剂，其特征在于它包括(按体积比计)2％-70％的右旋糖酐1-50份2％-25％的人体白蛋白 1-10份药理学上可接受的惰性气体 1-10份。
2.根据权利要求1的超声造影剂，其特征在于它包括5％右旋糖酐3份5％人体白蛋白 1份药理学上可接受的惰性气体2份。
3.根据权利要求1或2的超声造影剂，其特征在于所说的惰性气体是全氟化碳和六氟化硫，前者包括全氟丙烷、全氟丁烷和全氟戊烷。
4.根据权利要求1或2的超声造影剂，其特征在于所说的惰性气体在造影剂中以微泡形式存在，微泡浓度是1×108/ML-1×1010/ML。
5.根据权利要求1或2的超声造影剂，其特征在于所说的惰性气体密度大于0.3磅/英尺3。
6.根据权利要求4的超声造影剂，其特征在于所说的惰性气体微泡平均直径为3-7微米。
7.一种制备超声造影剂的方法，其特征在于该方法包括(1)用2％-70％的右旋糖酐将2％-25％的人体白蛋白稀释成0.5-5％的右旋糖酐白蛋白混合液；(2)在声振前将上述混合液与药理学上可接受的惰性气体充分混合；(3)将上述加入惰性气体后所得的混合液声振处理40-150秒。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于用5％右旋糖酐稀释5％人体白蛋白2-3倍。
9.根据权利要求7的方法，其特征在于所说的惰性气体是全氟化碳和六氟化硫，前者包括全氟丙烷、全氟丁烷和全氟戊烷。
10.根据权利要求7的方法，其特征在于声振处理后，在右旋糖酐白蛋白混合液中产生大小均值为3-7微米的微泡，微泡浓度为大于5×108/ML。
全文摘要
本发明公开了一种声学造影剂，具体说是一种由药理学上可接受的糖类和人体白蛋白组成的超声造影剂，这种造影剂是由低血液溶解度和弥散性的惰性气体所增强并经声振处理后形成的造影剂。可用于人体诊断目的，它不仅可用于心脏病学领域，也可用于其它能够采用这种造影剂进行超声显象的领域。本发明还提供了这种造影剂的制作方法。
文档编号A61K49/00GK1156626SQ9610656
公开日1997年8月13日 申请日期1996年6月25日 优先权日1996年6月25日
发明者谢峰, 托马斯·波特 申请人:谢峰