专利名称：抗人肝癌单克隆抗体HAb18放射免疫诊断剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术及细胞工程。
肝癌是我国及东南亚常见的恶性肿瘤，尤其在中国每年有11.2万肝癌患者死亡，占全世界肝癌死亡人数的43％，九十年代以来肝癌已上升为第二癌症杀手。肝癌发病凶险，进展迅速，影响极大，加上肝癌与乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)感染关系密切，因此进行肝癌的二级预防(早诊、早治)具有重要意义。以往肝癌的手术切除率较低，其主要原因是肝癌的诊断，尤其是早期诊断比较困难，甲胎蛋白(AFP)临床应用后，虽然检出率有所提高，但在我国还有30％左右的AFP阴性的肝癌病例漏检。80年代以来，由于医学影像学的发展，肝癌的诊断方法日臻完善。国内范桢等报导用131I标记抗人肝癌铁蛋白抗体对16例肝细胞癌作放射免疫显像，阳性率达81.3％，其中经肝动脉导管注射的8例全部获得阳性显像。国外有关放免显像的研究也有报道Dunk等用抗肝癌细胞PLC/PRF/5单克隆抗体标记125I进行荷瘤裸鼠体内定位获得成功，瘤/肝比值为4.4±0.05(1987，J Hepatol 452)，Markham等用结肠癌单克隆抗体(因与肝细胞癌有交叉反应)在人体无肝硬化的肝癌中部分显像，阳性率为50％(8/16)。美国FDA自1992年以来已陆续批准了10多项由单克隆抗体标记放射性核素的体内放免显像剂，如ImmuRAID-IL2用于淋巴瘤诊断的II期临床等，而国内外尚未有肝癌特异性的定性诊断试剂形成产品。
本发明的目的是研制准确性和敏感性高的肝癌体内导向诊断剂，以提高肝癌早诊水平。
为达到此目的，本发明实施的技术方案为以外科手术切除的新鲜人体肝癌细胞为免疫原，免疫小鼠，融合获得高分泌杂交瘤细胞株HAb18，其染色体在81-106间，众数为93-99，其分泌高亲和性抗人肝癌单克隆的抗体亚型为小鼠IgG1，其相应抗原为61KD的单位膜蛋白抗原，与甲胎蛋白、铁蛋白元竞争抑制，亲和常数为8.17×109L/mol，其抗原谱较为特异，主要针对肝癌，和部分胃癌、肠癌有交叉，但和正常组织无交叉反应。
用酶切法将HAb18 IgG分割为F(ab′)2和Fab，分子量减小，更易穿透到达肿瘤部位。
本发明中采用的放射性核素为131I或99mTc。131I半衰期为8.04天，主要发射β-及γ射线，用溴代琥珀酰亚胺法，将131I标记到HAb18单抗及其F(ab′)2上，组成抗人肝癌单抗介导的放免显像剂131I-HAb18和131I-HAb18 F(ab′)2。99mTc半衰期为6小时，可从钼锝发生器中淋洗制备，其主要带电粒子为γ射线，采用还原抗体法或修饰抗体法可将99mTc标记于肝癌单抗HAb18 F(ab′)2和Fab上，组成肝癌放免显像剂99mTc-HAb18 F(ab′)2和99mTc-HAb18 Fab。
临床应用方式静脉给药患者服用卢戈氏碘液2-3天，3滴，每日3次，先静脉注射地塞米松5mg，然后缓慢注入碘标记抗体92.5-111MBq/1.8-2.0ml。
临床前及临床研究1.体外免疫活性检测标记抗体与肝癌细胞的免疫结合率，131I-HAb18 IgG为70％，131I-HAb18 F(ab′)2为55％，131I-C4IgG(无关抗体)为4.5％。
2.体内放免显像及生物学分布注入碘标记抗体后，裸鼠左臀部位肿瘤区明确显像。肿瘤直径在0.5cm以上即能定位，显像率100％。最佳显像时间，全抗体120-168小时，F(ab′)248-72小时，无关对照抗体C4在肿瘤部位无放射性聚集。
HAb18及其F(ab′)2片断在48小时时每克肿瘤组织的摄取，分别占其注入总剂量的2.56％和2.03％，两者均高于对照抗体的1.2％。在不同时间点上处死荷瘤鼠，取全身各组织器官称重，测cpm/mg组织，观察T/NT比值，结果见表1。表1内3种抗体最佳显像时间点上T/NT比值，其中最重要的为瘤/肝、瘤/血比值。注入标记单抗后，在不同时间点上分别取样、测试、计算。瘤/肝比值全抗体在48、120、168小时分别为1.53、3.95、5.15。而F(ab′)2在48小时达14.47，远高于全抗体；瘤/血比值，全抗体在以上时间点上分别为0.42、0.58、1.35。而F(ab′)2在48小时即为4.55比值也明显大于全抗体。无关抗体C4T/NT比值均较小，无集中趋势。
表1 标记抗体注入后在荷人肝癌裸鼠体内分布(T/NT比值X±S)标记物131I-HAb18 F(ab′)2131I-HAb18 IgG131I-C4IgG48h 168h 168h血 4.55±0.07 1.35±0.21 0.44±0.17心18.60±2.05 4.79±1.31 1.62±0.45肺 8.05±0.46 2.30±0.41 0.97±0.12肝14.47±2.35 5.15±0.64 0.93±0.16脾10.88±2.70 5.90±0.59 1.72±0.40胰18.40±1.08 9.58±1.12 1.48±0.23肾 4.46±0.86 3.84±0.62 2.75±0.37胃 2.51±0.69 4.87±1.14 0.92±0.08肠15.83±1.24 7.08±1.10 2.20±0.26肌肉 13.82±3.52 9.51±2.53 3.31±1.42脑81.91±12.13 31.63±1.0211.27±0.73
表2 碘标抗体注入人体内的分布(T/NT比值X±S)标记物131I-HAb18 IgG131I-HAb18 F(ab′)2血2.01±0.162.45±0.22脑4.70±0.305.95±0.32心3.13±0.183.0±0.25肝2.15±0.152.63±0.21脾2.82±0.213.22±0.34肺3.02±0.343.55±0.28腹腔 4.46±0.555.20±0.47注n＝15(IgG 12例，F(ab′)23例)。器官比值为ECT感兴趣区(ROI)单位面积外测量的数据。131I-HAb18对正常人体的器官辐射吸收剂量根据医学内照射剂量委员会纲要(Medical Internal Radiation Dose CommitteSchema，MIRD)，131I-HAb18对正常人体的器官辐射吸收剂量如下①各器官放射性药物有效半衰期[T1]eff在相同显像条件下，从全身显像图像上用感兴趣区(ROI)技术计算出各器官不同时间的计数，拟合时间-放射性曲线，求出[T1]eff(h)肝 肺 心 甲状腺 肠 肾 脾 睾丸 全身48 72 88120 68 24 120 9648②各器官累积放射性强度
肝 肺 心 肾 脾肠 睾丸全身骨皮质 骨髓8338 6822 12583 4370 8895 2202 2308288519440 19440
全身343917③各器官辐射吸收剂量(mGy/MBq)，如下肝 肺心肾脾 肠 睾丸甲状腺 骨皮质 骨髓0.36 0.26 0.022 0.396 1.46 0.164 1.813.570.252 0.252全身0.184有效剂量当量(effective dose equivalent，EDE)为各器官吸收剂量与器官权重因子乘积代数和，经计数为0.958mSv/MBq，按每次显像给药185MBq计算，EDE为177.23mSv/每次检查，乘以现行的危险度系数1.65×10-5/mSv，每次检查因癌致死危险度为2.92×10-3。
本发明有敏感性强，组织特异性高的优点。以“肝占位性病变待查”定位20例，其中13例经CT、B型超声和血清AFP诊断为肝癌。经本发明显像剂诊断阳性显像11例，其中2例小肝癌，最小肿瘤直径仅为0.5cm，血清AFP＜20ng/ml，B型超声诊断为“血管瘤”，但本诊断剂定位发现阳性显像区，手术后病理诊断证实为肝细胞癌。因此，本抗体对血清低值AFP的早期小肝癌的诊断也具有一定的可靠性。而5例肝占位病变，4例术前诊断为肝癌，1例疑为血管瘤，经本诊断剂检查全部为阴性，最后由手术探查或胃镜病理诊断证实3例是血管瘤，2例为来源于胃和贲门的肝转移癌，阴性诊断符合率为100％。
权利要求
1.抗人肝癌单抗HAb18放射免疫诊断剂。其特征在于以外科手术的新鲜人体肝癌细胞为免疫原，免疫小鼠，融合后获得HAb18杂交瘤，其分泌高特异性抗人肝癌单克隆抗体HAb18，用放射性核素131I或99mTc标记HAb18单抗，组成抗人肝癌单抗HAb18交联物。
2.根据权利要求1所述的抗人肝癌单抗HAb18放射免疫诊断剂，其特征在于HAb18杂交瘤细胞株染色体在81-106间，众数为93-99，其分泌特异性抗人肝癌单抗HAb18。
3.根据权利要求1或2所述的抗人肝癌单抗HAb18放射免疫诊断剂，其特征在于HAb18单抗的亚型为小鼠IgG1，其相应抗原为61KD的单位膜蛋白抗原，与甲胎蛋白，铁蛋白无竞争抑制，亲和常数为8.17×109L/mol，其抗原谱较为特异，主要针对肝癌，和部分胃癌、肠癌有交叉，但和正常组织无交叉反应。
4.根据权利要求3所述的抗人肝癌单抗HAb18放射免疫诊断剂，其持征在于还可用酶切法将HAb18 IgG分割为F(ab′)2和Fab片断，使抗体分子量减小，而更易穿透到达肿瘤部位。
5.根据权利要求4所述的抗人肝癌单抗HAb18放射免疫诊断剂，其特征在于所述的抗人肝癌单抗HAb18交联物具体为以下四种制剂[131I]-HAb18 IgG； [131I]-HAb18 F(ab′)2；[99mTc]-HAb18 F(ab′)2； [99mTc]-HAb18 Fab。
全文摘要
抗人肝癌单抗HAb18放射免疫诊断剂，涉及生物技术及细胞工程领域，其主要技术特征为以外科手术切除的新鲜人体肝癌细胞为免疫原，免疫小鼠，融合后获得HAb18杂交瘤，其分泌高特异性抗人肝癌单抗HAb18，用酶切法将HAb18分割为F(ab′)
文档编号A61K39/395GK1166988SQ97108618
公开日1997年12月10日 申请日期1997年7月11日 优先权日1997年7月11日
发明者陈志南, 刘彦仿, 隋延仿, 米力, 仇凯, 陈敏, 边惠洁, 刘成刚 申请人:中国人民解放军第四军医大学