专利名称：使用羟基二苯基醚类化学试剂,以二氯苯氧氯酚作为示例,作为抗疟药及对脂肪酸合成靶确认的制作方法
技术领域：
本发明所属的领域本发明涉及羟基二苯基醚类化学试剂，以二氯苯氧氯酚[2，4，4’-三氯-2’-羟基二苯基醚]作为示例，用作对新靶的确认及用于治疗人类falciparum疟疾疗法中的应用。
发明的
背景技术：
人类的疟疾是由于疟原虫falciparum引起的高热感染。估计每年在发展中国家有3-4亿新感染疟疾、并有1.5-2.7百万人死于疟疾，参见世界健康组织疟疾，WHO Fact Sheet 94，1-3(1995)。这种疾病还消耗了大量的人力和药疗费用。由于寄生虫的抗药性的广泛发展，在传染媒质中的对杀虫剂的抗性，并且在近期都没有一个有效的疟疾疫苗可用，这些需要新靶的确认和较好抗疟疾药物的开发。
疟原虫(Plasmodium)是一个属于Apicomplexa门，Plasmodium属的寄生原虫，是通过按蚊(Anopheles)属的雌蚊传播的。人类的疟疾由四类疟原虫引起的，即疟原虫falciparum，疟原虫vivax，疟原虫ovale和疟原虫malariae。该疾病的特征是在感染的红细胞阶段周期性的发热并伴有裂殖子(merozoites)的释放，在疟原虫malariae的情况下该发热每72小时出现一次，而对于其它种类的疟原虫是每48小时出现一次。在所有的种类中，都有一个红细胞外的裂殖生殖，在疟原虫falciparum和malariae中，这个阶段延续5～15天。疟原虫falciparum引起恶性间日疟，是最常见和最严重的疟疾形式。这种感染是急性的、并且寄生虫倾向吸附在内皮层细胞，可引起堵塞和大脑的损害，通常会导致死亡。
疟原虫vivax引起良性间日疟，是第二严重的感染，疟原虫ovale引起ovale间日疟，集中在西部非洲。
疟原虫malariae引起三日疟，感染可能延续30年或更长。后三种寄生虫感染，尽管会造成衰弱，但很少导致死亡。引起大脑的疟疾的疟原虫falciparum，已经对氯喹有抗药性。
人类寄生虫，除疟原虫malariae外，并不能自然地传染给其它动物，所以灵长目动物和啮齿动物的疟疾寄生虫在为它们自身利益和做为人类感染的模型方面都引起了相当的注意。大约20种在非人类长目动物的疟原虫cynomlgi，与疟原虫vivax相似，被进行了广泛地研究。来自猕猴类的另一种疟原虫knowlesi是目前在实验室研究中被广泛应用的。啮齿动物的疟疾寄生虫比其它任何种类被进行了更广泛的研究。这些主要集中在两个主要群体，疟原虫berghei，yoelii及它们的亚种和疟原虫vinckei，chabaudi及它们的亚种。疟原虫berghei-yoelii群有代表性地侵袭未成熟的红细胞。它们都有24小时的周期性，不太明显的能够提供关于疟疾寄生虫的丰富的生物学信息，这些信息通过其他的途径是不可获得的。
抗疟疾药物对疟疾的治疗包括使用药物，如喹啉、氯喹、青蒿素、甲氟喹(mefloquine)、伯氨喹(primaquine)等治疗，根据它们的化学结构和它们在疟疾生命循环不同阶段的活性，把目前使用的抗疟疾药物可分为三个组是可能的，它们是(a)抗代谢物(b)8-氨基喹啉类(c)血液杀裂殖体剂(d)另外，可能被承认的另外一组是具有抗疟疾活性的抗菌的抗生素。
(a)抗代谢物这些药物作用于叶酸循环，被分为类型I和类型II抗叶酸物。疟疾寄生虫进行嘧啶全合成，在该过程中还原叶酸衍生物是一个至关重要的辅因子。尽管它们拥有嘌呤的补救途经，但是它们不能利用提供的嘧啶，使用象哺乳动物细胞的补救途经，所以它们对这些抗叶酸物敏感。
类型I抗叶酸物，包括磺胺和砜(sulphones)(比如磺胺多辛(sulfadoxine)和氨苯砜)是对氨基苯甲酸的结构类似物 苯甲酸与这些抗代谢物竞争二氢蝶啶酯合成酶(enzyme dihydropteroate)的活性位点，将PABA连接到蝶啶形成二氢蝶啶酯。一个进一步的二氢叶酸合成酶连接谷氨酸到二氢蝶啶酯给出二氢叶酸酯(二氢蝶酰谷氨酸酯)。从PABA到二氢叶酸的路径对微生物是唯一的。在哺乳动物细胞中，二氢叶酸酯通过饮食的叶酸的减少得到，这说明磺胺类和氨苯砜类药剂对微生物的选择性毒性，和在哺乳动物寄生体中相对安全。
第二类抗叶酸物(如，乙胺嘧啶、甲氧苄氨嘧啶和环氯胍，氯胍的代谢物)与叶酸物有相似的结构，与这个代谢物竞争二氢叶酸还原酶(四氢叶酸酯脱氢酶)。哺乳动物宿主通过一个相似的酶产生四氢叶酸酯。乙胺嘧啶和环氯胍的选择性毒性的基础是这些化合物比哺乳动物对疟原虫的酶有高的亲合性，并且寄生虫与宿主细胞相比进行快速的增殖。
(b)8-氨基喹啉8-氨基喹啉，特别地，是这组中毒性最小的，伯氨喹(primaquine)是杀配子体剂(gametocytocides)和hypnozoitocide。8-氨基喹啉对无性血液阶段也有活性，尽管它有明显的毒性。众所周知，对这种抗疟效应的方式，8-氨基喹啉需要代谢激活。伯氨喹(primaquine)激活代谢的许多工作需要指明作用的实际方式，但有提示说使用8-氨基喹啉的治疗会引起疟疾寄生虫线粒体的肿涨，参见R.L.Beaudoin and M.Aikawa Science 160，1233-1234(1968)。
(c)血液杀裂殖体剂(schizonotocides)血液杀裂殖体剂，包括最老的喹咛(quinine)至今仍然是不可缺少的，它在疟疾寄生虫的红细胞阶段是有活性的。它们被用在激活抗疟疾治疗以及抑制的预防中。对这些药物易感性的血红蛋白消化的重要性是众所周知的。
这些血液杀裂殖体剂，根据它们的化学结构和对红细胞内的寄生虫的作用效果分为两组。
i)第一组由合成的4-氨基喹啉，氯喹和吖啶米帕林(acridine mepacrine)等组成。这些药物对含有红细胞内的寄生虫的消化囊的血红蛋白有显著的、快速的作用。
ii)第二组杀裂殖体剂是芳香氨基醇，如奎宁(quinine)和甲氟喹(mefloquine)，这里的芳基可能是或也可能不是氮杂环。它们不象第一组药物，不会引起明显的和快速的效应，尽管它们能有竞争性地抑制由此类药产生的自噬液泡(autophagicvacuole)的形成。
氯喹40多年来，氯喹(CQ)一直是被选用作抗疟疾药物，因为它对感染人类的四种疟原虫(疟原虫falciparum，疟原虫vivax，疟原虫ovale和疟原虫malariae)都有抵抗活性。另外，CQ是唯一已知的对儿童和孕妇安全的抗疟疾药物。由于疟原虫falciparum的CQ抗药株系的出现，CQ的价值已大大降低了。因此，尽管CQ是安全的，但是对CQ抗性使疟疾发病率和死亡率增加，参见A.A.Asindi等，Trop.Geogr.Med.45，110-113(1993)。这导致了其它抗疟疾药物的广泛使用(甲氟喹(mefloquine)，卤泛群(halofantrine)，青蒿素(artemisnin)衍生物和乙胺嘧啶-磺胺多辛(fansidar)。
尽管在过去CQ起过杰出的作用，它的作用方式一直存有争议，参见S.R.Meshnick An.Trop.Med.Parasitol.90，367-372(1996)。有关CQ的抗性机理也存有争议，尽管由于CQ抗性和CQ作用和抗性的机理理论的不确定性造成的实际应用中的限制，仍然有理由不得不考虑与CQ相似的氨基喹啉(AQs)做为潜在的抗疟疾药物。如果这些AQs对人类有效，它们能够在发展中国家用与生产CQ的亲核取代反应相似的方法合成它们，参见D.De等，J.Heterocycl.Chem.34，315-320(1997)。AQs能够提供一种目前治疗CQ抗性疟疾的昂贵的抗疟药物的经济的替代物。尽管乙胺嘧啶-磺胺多辛是相对经济的，但是它做为第一线抗疟疾药物的广泛使用可能快速的选择抗性寄生虫，参见O.C.Nwanyanwu等，Trop.Med.Intl.Health 21，231-235(1996)。
CQ作用的方式对于氯喹作用的机理被提出了很多，它们包括i)DNA相互作用(interacalation)；ii)液泡(vacuolar)中pH的升高；iii)CQ与自由血红素的结合；iv)天冬氨酸和半胱氨酸蛋白酶活性的抑制；v)寄生虫蛋白质合成的抑制。
CQ处理的寄生虫的形态学观察
据报道，CQ在寄生虫食物液泡中产生形态的变化。暴露给CQ后，对CQ易感的疟疾寄生虫的食物液泡变大，并与未处理的对照相比疟疾色素的数量有所减少。另外，寄生虫细胞质证明核糖体的聚积，线粒体的肿涨和粗糙内质网的肿涨。这些效应是特殊阶段的，只有在滋养体成熟时，它能干扰食物液泡的正常功能，这时这些效应才能被观察到。
食物液泡的功能和CQ在疟疾寄生虫中的累积疟疾寄生虫的食物液泡做为次级溶酶体的功能，主要含有血红蛋白的红血细胞(RBC)的细胞质被内吞作用内在化，而且到达食物液泡中，在这里血红蛋白通过天冬氨酸和半胱氨酸蛋白酶(plasmepsins、falcipain)降解释放肽和氨基酸，寄生虫利用这些肽和氨基酸合成蛋白质。参见S.E.Francis等，Annu.Rev.Microbiol.51，97-123(1997)。在蛋白质合成最大时，这个过程在滋养体中是最活跃的。寄生RBC的疟疾比未寄生RCB的疟疾积累更多的CQ，已经知道CQ的累积对它抗疟原虫活性是必须的。总之，由于CQ在食物液泡中的积累，CQ抑制寄生虫成熟这样的观点被提出。寄生虫食物液泡是独特的靶，因为它在哺乳动物细胞中不存在。
CQ可能干扰食物液泡功能的机理CQ干扰食物液泡功能至少有四种机理i)提高液泡pH已经提出氯喹，由于弱碱性效应或转移机理，引起食物液泡的碱化，参见C.A.Homewood等，Nature 235，50-52(1972)，D.J.Krogstad等，J.Cell.Biol.101.2302-2309(1985)，P.H.Schlesinger等，Antimicrob.Agents Chemother.32，793-798(1988)。
ii)抑制天冬氨酸和半胱氨酸蛋白酶活性疟原虫falciparum食物液泡含有至少三种蛋白酶水解寄主的血红蛋白成亚铁血红素和珠蛋白，半胱氨酸蛋白酶falcipain，参见P.J.Rosenthal等，J.Clin.Invest.82，1560-1566(1988)，I.Y.Gluzman等，J.Clin.Invest.93，1602-1608(1994)和天冬氨酸蛋白酶plasmepsin I和plasmepsinII，参见J.L.Hill等，FEBS Lett.352，155-158(1994)。这些酶中的每一个都参加珠蛋白的水解，因为通过寄生虫和食物液泡提取物的血红蛋白的水解被天冬氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制剂以另外一种方式抑制了。
在血红蛋白降解中三个食物液泡蛋白酶的精确的作用还不清楚，部分由于食物液泡氧化还原状态的不确定性。半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶的抑制作用有抗疟疾效应，但是它们似乎作用的方式不同。
天冬氨酸及半胱氨酸蛋白酶抑制剂做为潜在的抗疟疾药物正在研究之中。有效抗疟疾蛋白酶抑制剂应该是理想地抑制寄生虫蛋白酶但不抑制寄主类似物，比如，半胱氨酸蛋白酶Cathepsins L和B，天冬氨酸蛋白酶Cathepsin D等。
在食物泡液中半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶降解血红蛋白，而且，这两类酶的抑制剂呈现出抗疟疾效应，优选的化学治疗法可能涉及有两类蛋白酶抑制剂的组合治疗方法。
iii)结合游离亚铁血红素已经提出了CQ形成有亚铁血红素的毒性复合物，这样，防止亚铁红血素被解毒。
iv)疟原虫色素形成受阻血红蛋白的降解红细胞疟疾寄生虫寄居在细胞内环境，它屏敝它们免受免疫系统的攻击，同时使它们和已准备好的血液中循环供给的营养分离，寄生虫已发展了从红细胞胞液中获取营养的方法。在酸性食物液泡中红细胞寄生虫吸收和降解了大量的血红蛋白成为亚铁血红素和珠蛋白，参见P.J.Rosenthal.And S.R.Meshnick，Mol.Biochem.Parasitol.83，131-139(1996)。球蛋白的进一步地水解提供了大量的寄生虫蛋白质合成所需的氨基酸。在处理过程中血红蛋白产生大量浓度的自由亚铁血红素，为了避免寄生虫毒性，必须被修改或隔离，这些自由的亚铁血红素被聚合成疟原虫色素做为排毒机理。疟原虫色素的组成有一定的争议。看起来疟原虫色素以β-正铁血红素——每一个亚铁血红素三价铁的部分和相邻亚铁血红素分子的羧基侧链结合的非共价配位复合物形式的聚合亚铁血红素组成。是否亚铁血红素聚合是由亚铁血红素聚合酶催化的还是非酶催化的反应是有争议的另一个领域。参见A.F.G.Slater和A.Cerami，Natnure 355，167-169(1992)和K.Raynes等，Biochem.Pharmacol.52，551-559(1996)。
大部分这些假说不可能充分解释氯奎的抗疟疾作用，理由如下a)氯喹的药理浓度引起pH的变化可能太小，不能充分解释药物的作用，氯喹碱化食物液泡的相对能力不能和它们的抗疟疾效能相关。
b)在处理过的寄生虫中，没有形成毒性亚铁血红素氯喹复合物所必需游离的亚铁血红素的数量的直接证据。
c)半胱氨酸蛋白酶抑制剂的形态上影响不同于氯喹引起的那些，参见，P.J.Rosenthal，Exp.Parasitol.75，255-260(1995)。
CQ抑制寄生虫生长的可选机理i)与DNA相互作用多年来，这个假说被认为是CQ对疟疾寄生虫效用的的最可能解释。对这个假设的争论因素是依赖于CQ抗寄生虫活性的专一性和浓度。在细菌、病毒和哺乳动物细胞中，CQ以毫摩尔浓度抑制DNA合成。这个毫摩尔CQ浓度(抑制DNA合成)比抑制寄生虫生长纳摩尔的浓度高5到6个数量级(CQ对寄生虫作用的最显著的方面是在纳摩浓度的专一性)。
ii)寄生虫蛋白合成的抑制作用发明者之一(Namita Surolia)提出CQ在治疗浓度通过隔离亚铁血红素抑制寄生虫蛋白质的合成，因为亚铁血红素对于最佳的蛋白质合成是必需的。参见N.Surolia和G.Padmanaban，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，4786-4790(1991)。这样引起的亚铁血红素的不足导致eIF2α激酶或亚铁血红素调节抑制剂(HRI)的增强的自动磷酸化，接下来，通过磷酸化翻译起始因子的最小亚单元(eIF-2α)抑制蛋白质合成。发明都者提出寄生虫蛋白质合成的抑制作用是寄生虫的死亡的一个早期事件(其它的机制是基于和药物温育和处理24小时后 CQ的效用的基础上的，鉴于蛋白质合成的抑制在药物和寄生虫温育15-20分钟能被观察到)此外，CQ在细胞质中发挥作用，起作用的位点是蛋白质的合成，它到达食物液泡前，是其它提出的作用机理的位置。
发明者也证明了酶的活性，即蛋白质合成所需从头生物合成亚铁血红素涉及的ALA脱水酶和ALA合成酶和象细胞色素P-450和细胞色素C氧化酶的血蛋白质中的辅助因子，参见N.Surolia和G.Padmanaban，Biochem.Biophys.Res.Commun.197，562-569(1993)。
不同药物的作用机理a.奎宁奎宁是喹啉甲醇。喹啶是奎宁的纯的d型异构体，更为有效。象其它很多抗疟疾药物，奎宁被认为影响疟原虫色素——疟色斑的形成。自从1937年就已经知道亚铁血红素与奎宁的作用。
b.青蒿素(Artemisinin)(Qinghaosu)奎宁后，青蒿素(artemisinin)保留了抗疟疾药物的基本的成分。Artemisia annua(甜苦艾)做为青蒿而为中草药行医者所知至少有2000多年了。活性的、水不溶的成分即所谓的青蒿素(qinghaosu)或artemisinin。两个青蒿素的衍生物是artemether和artesunate。这些中药不适用于除中国以外的其它国家研究所用，因为它们仅能在中国被培养，而且许多中国的原始研究不被西方政府接受(因为它们没有遵循临床实验所要求的许多标准实践)。
青蒿素的作用的机理涉及亚铁血红素和中心碳原子自由基产生的作用机理越来越得到一致的认同。假设青蒿素通过产生自由基起作用。从青蒿素产生的自由基被发现是依赖于铁的。提出通过青蒿素使寄生虫专一蛋白质的烷基化是青蒿素的作用的机理。蛋白质烷基化如何导致寄生虫死亡？青蒿素靶蛋白质的结构和功能的进一步阐明将回答这个问题。
正在开发中的药品(Drugs in the pipeline)对私人药物公司进行抗疟疾药物的开发几乎没有经济上的驱动。抗疟疾药的发现和设计过程极端费时和复杂，我们直接关心的是下一代的抗疟疾药物。目前开发的药物如下图所示。
来自Milhous，W.K.and Kyle，D.E.疟疾寄生虫生物学，发病机制，和保护，I Sherman，Eds.，ASM出版社，Washington，D..(1998)pp 303-316对本发明的总结一个羟基二苯基醚类化合物——二氯苯氧氯酚在体外有效地抑制人类疟疾寄生虫(疟原虫falciparum) 的生长。也说明了感染疟原虫berghei(啮齿疟疾寄生虫)的小鼠注射二氯苯氧氯酚能够消减寄生物血症并延长它们的生存时间。尤其本发明提供了证据(1)羟基二苯基醚(以二氯苯氧氯酚为例)消除在体内和体外疟疾寄生虫的生长，认定这类化合物能做为有前途的治疗药物。(2)提供了二氯苯氧氯酚抑制在脂肪酸合成中[14C]或[3H]丙二酸单酰CoA的结合的证据。(3)从用在疟疾寄生虫脂肪酸合成过程中前体物[14C]或[3H]丙二酸单酰CoA合成的脂肪酸链的缩短，提供了证明二氯苯氧氯酚把脂烯酰ACP还原酶(FabI)做为靶的证据。
因为在疟疾寄生虫中脂肪酸合成涉及的酶不同于人类寄生体中的，所以本发明为以疟疾寄生虫生存机理的基本元素(FabI)为靶的药物开发铺平了道路。
图的简要说明
图1.说明体外不同浓度二氯苯氧氯酚和疟原虫falciparum温育后寄生物血症抑制的百分数。
图2.照片说明二氯苯氧氯酚对24小时温育后培养体中疟原虫falciparum生长和的形态的影响。
图3.说明体内在疟原虫berghei感染小鼠中二氯苯氧氯酚控制寄生物血症的效力，其中二氯苯氧氯酚是在感染后1和2天进行皮下注射配给的。结果表明第一次和第二次注射后的寄生物血症，每一点代表用4～5个动物的一个分立实验。
图4.照片说明分别是一剂和两剂二氯苯氧氯酚配给后(3mg/kg体重)，在体内在疟原虫berghei感染小鼠中，二氯苯氧氯酚对寄生虫生长的效应。
图5.通过不同浓度二氯苯氧氯酚及通过培养体中[35S]蛋氨酸的减少说明蛋白质合成的抑制作用图6a.0.15、0.3、0.6、1.2和4.8μg二氯苯氧氯酚对在无疟原虫falciparum脂肪酸合成体系的细胞中[14C]丙二酸单酰CoA结合的影响图6b.说明以上浓度二氯苯氧氯酚对体外疟原虫falciparum合成脂肪酸类型影响的薄层层析(TLC)结果专业用语的描述定义涂片，指在一块片上提供薄的或厚的血液膜，这个膜空气干燥的，在甲醇中固定，染色后被用来在显微镜下检查寄生虫的形态学特征。
RPMI 1640，指在组织培养物中用于培养寄生虫和其它细胞的合成培养基。
CRPMI，指的是完整的RPMI培养基，将25mM Hepes缓冲液，0.2％NaHCO3和10％人类血清加入到RPMI 1640中。
酸化的柠檬酸葡萄糖(ACD)，提供柠檬酸溶液，一种抗凝血剂，用于收集红血细胞，ACD的组成如下柠檬酸三钠 22.0g柠檬酸 8.0g葡萄糖 24.59使用1000ml蒸馏水。每50.0ml完整的血液，7.5mlACD。它可在4℃时贮存至4周，Webster等，Application of Genetic Engineering to Research on TropicalDisease Pathogens with Special Reference to Plasmodia.A laboratory manual ofselected techniques.S.Panyim，P.Wilairat和Yuthavong，Eds.WHO，Geneva(1985)pp.437.
寄生物血症，指每100个红血球中寄生虫的数目，表达为10个不同区域1000个红血球中寄生虫的计数，并取平均值后的寄生百分数。涂片用吉姆萨(Giemsa)染色。
IC50，指杀死50％寄生虫的药物浓度。
血细胞比容，指堆积的红血球的体积，用％表达。
MIC，提供抑制寄生虫生长药物/抑制剂/分子的最小浓度(以摩尔浓度或绝对重量/毫升)。
体外，提供在玻璃容器中做的实验，在完整的活的有机体或身体之外，所有的组分和条件都要求模拟完整的系统。
体内，提供在整个身体/有机体内进行的实验。
放射自显影通过使照相胶片保持在黑暗中，和被分离的放射性组分的薄层色谱接触而变黑，检测放射性化合物，例如合成和薄层色谱分离的放射性标记的脂肪酸，参见F.Turnowsky等，J.Bacteriol.171，6555-6565(1989)。
红血细胞中疟原虫的不同阶段疟疾寄生虫的生命循环由二个阶段组成1)发生在人体中的无性阶段，2)发生在蚊子中的有性阶段。在无性阶段，寄生虫通过分裂繁殖，一个称为分裂生殖过程。在人体中，分裂生殖发生在二个地方，在红血细胞中(红细胞分裂生殖)和肝细胞(红细胞外的分裂生殖)中。无论在红细胞的还是在红细胞外的分裂生殖的产物都叫裂殖子。
人类阶段当人被一只感染的雌性按蚊咬后，人被感染了。存在于蚊子的唾液腺中的孢子体(sporozoites)注入人的血液中。注入后的一个小时内，孢子体到达肝，进入肝细胞，这些孢子体进行重复的核分裂，被称为裂殖体阶段。在5.5到15天间，裂殖体成熟并破裂，释放出成千的裂殖子，进入血液，感染红血细胞。寄生虫在它的红血细胞生长期间有下列阶段。
环阶段在红细胞内，裂殖子聚拢，失去它的内部细胞器官。它看起来是一个圆形体，在中心有液泡，细胞质被推到外围，核位于一个极上，用(吉姆萨)Giemsa染色时，环的细胞质染为兰色，核为红色，这给出寄生虫环型的或图章戒指的外形。这些幼小的寄生虫因而被称为环形式。
滋养体(原虫)阶段随着环的发展，尺寸增加，形状上变为不规则的，表现出变形虫的运动性。这被叫做变形虫形式，然后达到一定的发育阶段，开始分裂，叫做滋养体。这些滋养体也含有正铁血红素色斑，疟色斑或疟原虫色素。
裂殖体阶段从核开始分裂时，红细胞内寄生虫叫做裂殖体。首先，只有核分裂成易变的大量的小核，细胞质保持完整和不分裂，这个阶段叫做早期裂殖体。每一个子核被细胞质所围绕时，叫做后期裂殖体。成熟的裂殖体是完全生长形式，其中的可见的10-13个细胞核被细胞质所环绕。成熟的裂殖体破裂释放裂殖子，进入循环。成熟裂殖体的破裂也释放大量的热原，导致热病的发作，是疟疾的特征。
同步化疟原虫falciparum的体外培养通过使用5％的D-山梨醇做为含有后期滋养体和裂殖体的细胞的裂解剂后，从混合阶段被同步化(调整到同一阶段)，参见C.Lambros & J.Vanderberg，J.Parasitol 65，418-420(1979)。含有环和早期滋养体(裂殖子侵入后24小时)的细胞允许同步生长。
主要含有环的的培养体(7-8％)以1300rpm离心7分钟，弃上清。5倍体积的5％的D-山梨醇加到堆积的红细胞中，混合物在室温下培养5分钟，然后，在1300rpm离心7分钟，弃上清，用CRPMI洗掉未感染的红细胞来制备一50％细胞悬浮液，并且培养物根据寄生物血症来稀释，以保持最初的寄生物血症为0.5-1％。
在48小时后重复对培养物的山梨醇处理，以“微调”同步，这个由环、滋养体和裂殖体的同步培养物可在山梨酸处理后，分别可在0～18小时，24～36小时和36～45小时收获。
从寄生的红细胞中的游离的寄生虫的分离从培养体来的感染细胞在3000g，4℃离心7分钟，弃上清，堆积细胞用5～10倍体积的磷酸盐缓冲液洗四次，在3000g，离心3分钟。洗过的堆积细胞悬浮在一已知体积的PBS中。为了从感染的红细胞中释放分离的寄生虫，加入等体积的0.15％皂角苷(在PBS中)，悬浮液在37℃培养在振荡水浴中以15分钟间歇振荡以使红细胞完全裂解。10倍体积冷的PBS加入到培养混合物中，在10,000g旋转10分钟，弃上清，用PBS充分清洗含有游离寄生虫的褐色的沉淀颗粒。寄生虫的沉淀颗粒可贮存在-70℃备用，参见Application of Genetic Engineering toResearch on Tropical Disease Pathogens with Special Reference to Plasmodia；Alaboratory manual of selected techniques；S.Panyim，P Wilairat and Yuthavong，编辑，WHO，Geneva(1985)pp.394所描述的。
ApicoplastApicoplast是一种最近在人类疟疾寄生虫和弓浆虫gondii中描述的细胞器官，参见G.I.Mc Fadden等Nature 381，482(1996)。它是同类的细胞器官质体(在蓝绿藻类、植物、腰鞭毛虫等中发现)。推测在上述原生动物寄生虫中的Apicoplast是由这些3～4层膜包裹的细胞器官引起的一级内共生的内共生起源的。已经证实了这些二级内共生失去大部分宿主细胞核的基因。这样的核编码基因的产物在疟原虫中靶向apicoplast(结果大多apicoplast蛋白质是在糙面内质网合成的细胞溶质。然后，它们被转运到apicoplast)。在这些寄生虫中脂肪酸合成体系涉及到了Apicoplast，参见G.I.Mc Fadden等Proc.Natl.Acad.Aci.(USA)95，12352-12357(1998)。此外，这些寄生虫的Apicoplast中脂肪酸合成体系是细菌体系的reminescent，即它是分离类型。的确，Fab H基因产物，β-酮脂-ACP合成酶III，缩合乙酰-CoA与丙二酸单酰ACP成为乙酰乙酰ACP在疟疾寄生虫(疟原虫falciparum)及弓浆虫gondii两种情况下都已经被确认，参见G.I.McFadden等Proc.Natl.Acad.Aci.(USA)95，12352-12357(1998)。
脂肪酸的生物合成脂肪酸是构成膜的磷脂和糖脂类的基本单元，限定了细胞和它们的细胞器官的边界。它们还做为燃料的贮存，并且它们的一些衍生物还作为细胞内和细胞之间的信使，及维生素和辅酶的前体物。在脂肪酸合成中，中间体和酰基基团共价地连接到酰基载体蛋白质(ACP)上。从乙酰CoA中衍生顺序增加两个碳单元以增长生长的脂肪酸链，在这里丙二酸单酰ACP是两个碳单元激活的供体。从乙酰CoA，丙二酸单酰CoA和NADH或NADPH的催化饱和脂肪酸的合成的全部酶被称为脂肪酸合成酶，参见L.Stryer(1995)inBiochemistry W.H.Freeman and Company，San Francisco，Chapter 24。
在脂肪酸生物合成中涉及的酶在活的体系中被组织成两个有本质不同的方式，参见L.Stryer(1995)in Biochemistry W.H.Freeman and Company，SanFrancisco，Chapter 24和C.O.Rock and J.E.Cronan，Biochim.Biophys.Acta 1302，1-16(1996)。真菌、哺乳动物和一些支原菌通过多功能蛋白质完成脂肪酸合成，每一个反应都是通过这些巨大的蛋白质的一个特定区域(域)来催化。这类脂肪酸合成酶被分为类型I的脂肪酸合成酶，也可以描述为联合类型的脂肪酸合成酶，脂肪酸合成反应的连续步骤发生在这些域如同一个线上的玻珠一样是“硬线的”。另一方面，植物和许多细菌利用类型II或分离的脂肪酸合成酶，这是细菌大肠杆菌(Escherichia Coli)很好被标识特征。与哺乳体系单一多功能酶相对比，在E.Coli和植物中脂肪酸合成的每一个个别反应是通过分离的从其它蛋白质中独立地纯化酶进行的。乙酰基CoA和丙二酸单酰或乙酰ACP和丙二酸单酰ACP在β-酮脂酰ACP合成酶III(FabH)或脂酰丙二酸单酰ACP缩合酶(FabB或FabF)分别催化的缩合反应中形成乙酰乙酰ACP。紧跟缩合反应的是还原，脱水和由β-酮脂酰ACP还原酶(FabG)，β-羟基乙酰还原酶(FabA或FabZ)和脂烯酰ACP还原酶分别催化的第二个还原反应，它们转乙酰乙酰ACP成为丁酰ACP。正在进行循环的产物末端和丙二酸单酰ACP缩合开始了延长循环的重复，导致棕榈酸ACP的形成，它水解成游离的棕榈酸。这样生成的棕榈酸可通过另一套酶延长或通过另外的途径形成磷脂，参见L.Stryer(1995)in Biochemistry W.H.Freeman andCompany，San Francisco，Chapter 24。
优选实施例的详细描述本发明证实二氯苯氧氯酚和其它羟基二苯基醚在体外及体内拥有抗疟疾活性。
A.1.人类疟疾寄生虫的培养为检测羟基二苯基醚的效力，本发明者提供了培养疟原虫falciparum检验。这些寄生虫能够保存在体外，在CRPMI 1640培养基中37℃下培养的人类红细胞中，如W.Trager和J.B.Jensen，Science 173，673-674(1976)中描述的方法。
2.洗过的红细胞50％悬浮液的制备正常人类红细胞[O+类型血液，在柠檬酸、柠檬酸盐和葡萄糖(ACD)中收集]，以1000g离心10分钟，除去上清和暗黄色的包被，细胞以等体积的完全RPMI(CRPMI)培养基冲洗两次，在3000g离心5分钟，最后在完全培养基中制备了洗过细胞的50％的悬浮液。
有5-6％寄生物血症的疟原虫falciparum培养体用洗过的红细胞的50％悬浮液和CRPMI稀释，这样使起始的寄生物血症变为1％，血细胞比容为2％。1.5毫升这种稀释的感染的细胞悬浮液放在平底小瓶中，保存在带活塞的干燥器中。点燃一只蜡烛，盖上打开活塞的干燥器的盖。蜡烛熄灭后，关上活塞。这是一个简单但有效的产生低氧气(1-5％)和高CO2(7％)气氛的方法。每天除去上层漂浮物，补充1.25ml CRPMI的细胞以提供新鲜的培养基。当寄生物血症达到6～8％时，每3～4天加入新鲜的红细胞后使其下降到1％。在培养体中，在任一时刻能够看到无性循环的所有阶段，因为培体失去了部分在人体中疟原虫falciparum同步的特性。带有两个染色质点的精细环是平常的。裂殖体或片段表现15～18裂殖子，在人类感染疟疾的材料中看到了相同数目。
B.寄生虫的形态学检查这通过在显微镜下观察油浸中的感染红细胞的染色涂片来实现。可以看到具有特征特性的疟原虫falciparum的下列阶段，这些阶段如下1.环它有图章状的环型外观的特征。核被染为红色，而细胞质为蓝色呈现为细环。
2.滋养体在这个阶段，稠密的寄生虫细胞质占据了大部分的寄主红血细胞，滋养体有特征的褐色黄的疟疾色斑和食物液泡。后期的滋养体有3-4个核和未分裂的细胞质。
3.裂殖体在寄生虫的这个阶段，大部分红血细胞被12～13核占据，每个核都被细胞质所环绕，染色涂片也包含有宿主红血细胞(RBC)，其不被染色，也没有核。
疟原虫berghei涂片有另外的网状细胞，疟原虫berghei更倾向于侵袭网状细胞。不同类型的白血细胞比如淋巴细胞、中性粒细胞等也在疟原虫berghei的涂片中出现。一般地，它们比红细胞或网状细胞大，并在染色后呈现深蓝色。
C.测定寄生虫生长抑制的IC502-羟基二苯基醚(以二氯苯氧氯酚为例)作为体外抗疟疾药物的证明是本发明的一个方面。必需评价这些化合物在体外杀死寄生虫的能力。药物的IC50可在有96个孔的滴淀板中测定，参见R.E.Desjardins等，Antimicrob.Agents Chemother.16，710-718(1979)。将二氯苯氧氯酚以适当的浓度溶解在适当的溶剂中。根据需要在孔中等分有4-7％寄生物血症和1.5～2％血细胞比容的感染的红血细胞200μl试样。具有最高浓度的药剂用吸液管加到第一个液池中。经过板上的一系列双倍稀释后，25μl稀释药物的溶液被加到其余的需要数量的孔中。每一浓度在三份孔中试验。这些板被放在干燥器中，在37℃培养24小时。如果打算在48小时或72小时时研究药物的效应，则在每24小时加入新鲜的培养基和药剂。
D.同位素的制备和寄生虫标记摄取[35S]蛋氨酸，NEN，DuPont，(专一的活性1175Ci/mmol)被用作寄生虫生长的指示。最终加到每一个孔中的同位素浓度是100μCi/ml培养物。总培养期(24、48或72小时)的一小时前，把20μl的在培养基中同位素的加到每个孔中，再培养另外一小时。培养后，孔中的物质被吸取到微型离心管中，保存在冰中。样品在3000g，旋转离心10秒，弃上清，沉淀颗粒用1ml 0.9％的NaCl溶液洗涤二次。沉淀颗粒用50μl蒸馏水裂解，点在Whatman 3号纸盘上(用有冷的蛋氨酸的10％TCA预浸并干燥)。点板后，这些纸盘被干燥，用热的TCA、冷的TCA(都是10％)、醇/醚(2∶1，v/v)、及最后用醚处理。在热TCA处理期间，为漂白的目的将过氧化氢溶液(30％，v/v)加到最后浓度为3％，每一处理期是7分钟。这些纸盘用醚处理后，空气干燥，用Wallacβ计数器(Model 1409，Finland)在Optiphase高安全闪烁流体(Wallac闪烯产品，U.K.)中计数。
E.体内二氯苯氧氯酚的效应本发明还涉及羟基二苯基醚用做体内抗疟疾药剂。在被疟原虫berghei感染的小鼠中监控各种浓度二氯苯氧氯酚对于控制寄生物血症的影响。
1.疟原虫berghei感染通过一系列的血液传递，疟原虫berghei寄生虫保存在Swiss雄性小鼠中。
2.二氯苯氧氯酚处理用大约106个感染的红血细胞(IRBC)同一天感染Swiss小鼠(5只/组)。观察并记录这些动物的寄生物血症和死亡率，通过计数用吉姆萨(Giesma)染色的薄血液涂片中103个红细胞测定寄生物血症，并把它表示为每100个红细胞中寄生的细胞数目。只给DMSO(dimethylsulfoxide)的动物作为对照，并被当作未处理的动物。在用二氯苯氧氯酚处理的第一天寄生物血症大于1％。寄生物血症每24小时监控一次，连续7～8天。未处理的动物在感染后8天之内死亡，然而在处理过的动物中观察的延迟的死亡率与剂量有关。
F.羟基二苯基醚类化合物作为抗疟疾剂本发明揭示二氯苯氧氯酚(参见以下结构)和其它羟基二苯基醚，这类广泛应用的抗菌剂做为开发有效的抗疟疾试剂的主要化合物以及抗疟疾治疗的脂肪酸生物合成过程的靶。
二氯苯氧氯酚另外，Fab I被认定为疟疾中的酶，二氯苯氧氯酚的靶，一种羟基二苯基醚。间接证据强力地指出在疟疾寄生虫中分立类型脂肪酸合成酶的存在，参见，G.I.McFadden，等，Proc.Natl.Acad.Aci.(USA)95，12352～12357(1998)。所以，提出了在疟疾寄生虫及类似的细菌体系中脂肪酸合成的延长循环由下列方案所示反应组成。
它们是β-酮脂酰ACP合成酶III(FabH)催化的缩合反应，用还原酶(FabG)把β-酮脂酰ACP还原成β-羟基脂酰基ACP，它被β-酮脂脱水酶(FabZ)脱水，形成的脂烯酰ACP通过脂烯酰ACP还原酶(FabI)还原。这样，脂烯酰ACP的每一个延长循环的终端都加上了两个亚甲基，即-(CH2)2-。棕榈酰CH3(CH2)14CS-ACP形成时，这种延长的循环终止。通过水解酶从棕榈酰ACP释放出棕榈酸CH3(CH2)14COOH。脂肪酸合成酶延长循环的四个反应，它们中的两个，FabH和FabZ在基因中存在，最近在疟原虫falciparum中已被证明。
然而，如同在缩合反应和脱氢反应中可能涉及的几个基因产物，FabH和FabZ，尽管对脂肪酸合成是很重要的，但或许并不是必需的，参见C.O.Rock和J.E.Cronan，Biochim.Biophys.Acta 1302，1～16(1996)。
很有说服力地表明在细菌体系中脂烯酰ACP的还原反应中涉及一种酶，即FabI基因产物，脂烯酰ACP还原酶。更多地，已经建立了在脂肪酸延长的完整循环中，脂烯酰ACP还原酶，是速率决定因素，参见，R.J.Heath和C.O.Rock，J.Biol.Chem.270，26538-26542(1995)和R.J.Heath和C.O.Rock，J.Biol.Chem.271，1833-1836(1996)。所以，在任何分离脂肪酸合成酶体系中它是一个关键的调整元素。此外，也表明在E.Coli中二氯苯氧氯酚把FabI做为靶，参见L.M.McMurray等，Nature394，531-532(1998)和R.J.Heath等，J.Biol.Chem.273，30316-30320(1998)。正如疟疾寄生虫的脂肪酸合成体系是分离类型的，脂烯酰ACP还原酶的抑制剂证明是有效的抗疟疾试剂。
2-羟基二苯基醚是一类表现广谱抗菌活性的化合物，大量的这类化合物广泛地应用在包括对于纺织品处理的消费品中，这些化合物中，二氯苯氧氯酚是最有效的微生物杀菌剂，被应用在牙膏、肥皂、除臭剂、漱口剂、皮肤油膏和一定范围的儿童玩具的塑料中，参见H.N.Bhargava和P.A.Leonard Am.J.Infect.Control.24，209-218(1996)。
然而，本发明很清楚地表明二氯苯氧氯酚展现了很有效的抗疟疾活性。
G.二氯苯氧氯酚对疟疾寄生中脂肪酸合成的抑制在前几节中说明了二氯苯氧氯酚很效地抑制人类疟疾寄生虫的生长。为了进一步阐明它的作用方式，说明了它对在没有疟疾寄生虫系统细胞中在脂肪酸中，一个脂肪酸合成所需的关键性中间体[14C]丙二酸单酰CoA结合的影响。参见P.W.Majerus等(1968)，Methods in Enzymol.14，43-52。
这些实验清楚地表明二氯苯氧氯酚抑制在寄生虫中没有脂肪酸合成体系的细胞中的[14C]丙二酸单酰CoA在脂肪酸中的结合。在二氯苯氧氯酚存在下较长链脂肪酸的递减清楚地表明疟疾寄生虫的FabI做为靶，因为它在脂肪酸合成的延长循环中起一个决定性的作用。本发明也包含了羟基二苯基醚，如二氯苯氧氯酚或其它这类化合物在将来被开发用作这个酶的抑制剂起到抗疟疾剂作用以及影响这个酶活性的其它类分子。
实施例实施例1在体外二氯苯氧氯酚对疟原虫falciparum生长的影响在特定阶段(即山梨醇处理后获得的环(ring)或滋养体)将10％寄生物血症的200μl疟原虫falciparum培养体在96孔微滴淀板中按需要孔数量等分。在DMSO中制备二氯苯氧氯酚储备(Stock)溶液，进一步稀释用DMSO∶甲醇∶水为1∶1∶3组成的溶剂混合物完成，药物用完全的RPMI进一步稀释，DMSO的最终浓度是0.005％。这个DMSO浓度对寄生虫的生长没有任何抑制作用。10μl的药物(0.5μg～0.0019μg/200μl培养体)通过一系列的双倍稀释加到每一个孔中。滴淀板放在干燥器中，按照J.B.Jensen和W.Trager，Science 173，673-675(1796)的方法在37℃培养。每一个药物浓度在三个孔中检验。对照孔加0.005％DMSO溶剂或不加溶剂，也可以认为是未处理的培养物。培养基每24小时换一次，加入含有药物的新鲜培养基，检验(吉姆萨)Giemsa染色的涂片的寄生物血症及寄生虫的形态学特征。
实施例2[35S]蛋氨酸摄取的测量，做为寄生虫生长抑制作用的指示根据需要数目的孔在96孔的滴淀板中等分药物和寄生虫，如示例1中描述的。在需要收获时间点(24、48或者72小时)前1小时，将[35S]蛋氨酸(20μCi/孔)加到每一个孔中。每个孔中的物质被转移到微型离心管，保存在冰中，以3000g旋转离心10秒钟。弃上清，感染的红血细胞(IRBC)沉淀颗粒用0.5ml 0.9％NaCl洗涤四次。洗过的沉淀颗粒用50μl蒸馏水裂解，在3号Whatman纸盘上点板(在有冷蛋氨酸的10％TCA中预浸，干燥)。干燥后，这些纸盘用热的TCA、热的有3％用来漂白的过氧化氢的TCA、冷的TCA、醇∶醚(2∶1，V/V)，及最后是醚来处理(按此顺序)，每次7分钟。在醚处理后，纸盘被干燥，放在来自Wallac闪烁流体相III中用Wallacβ计数器计数。
实施例3在体内二氯苯氧氯酚配给后，小鼠的抗疟疾保护用疟原虫berghei感染雄性Swiss小鼠。这些动物被置于观察之下，每天记录寄生物血症。在DMSO中的二氯苯氧氯酚(分别是0.8、1.6、3.0、8.0、14.0和28.0mg/kg小鼠体重)，在寄生物血症大于1％被感染的第一天及随后的6天被皮下注射。用一组五个动物进行二氯苯氧氯酚实验，每一个用以上提到的剂量。DMSO被用于对照动物组(6)并被作为未处理的动物参考。记录寄生物血症和死亡率直到未处理的小鼠死亡。典型地在对照组内的全部6只小鼠在感染的9天内死亡，而用0.8、1.6、3.0mg二氯苯氧氯酚/kg(体重)处理的5只中的3、3和4只小鼠生存至14天。而用8.0、14.0和28.0mg二氯苯氧氯酚/kg(体重)处理时，所有的小鼠(5只中的5只)在14天时都存活。
实施例4在体外脂肪酸中[14C]丙二酸单酰CoA的结合和二氯苯氧氯酚对它的抑制作用在后环(ring)阶段通过在3000g离心5分钟收获呈现10-12％寄生物血症的疟原虫falciparum的同步培养物。沉淀颗粒用冷的磷酸盐缓冲液洗涤四到五次。洗涤后，沉淀颗粒悬浮在3ml磷酸盐缓冲液中，加入等体积的0.15％的皂代苷分离游离的寄生虫。(参见特定的具体体现)。这样分离的后ring阶段(滋养体)的寄生虫用PBS充分洗涤一次，细胞悬浮在0.4ml 1mM磷酸钾缓冲液中(pH7.0)，声波降解15秒。这样制备的溶解细胞与含有70μM乙酰基CoA、8mM葡萄糖-6-磷酸、3mMNADH和NADPH、0.4mM EDTA、4单位葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、45μM[14C]丙二酸单酰CoA(专一活性54.2mCi/mmol，DuPont)和3mM二硫代苏糖醇(DTT)的200μl200mM的磷酸钾缓冲溶pH7.0混合。加入来自E.Coli(Sigma)的200μg DTT还原酰基载体蛋白(ACP)的25μl 75mM的磷酸缓冲溶液。反应混合物在37℃培养30分钟，在相同条件下在加入还原ACP溶液前加入0.15、0.225、0.3、0.6、1.2μg的二氯苯氧氯酚至反应混合物进行反应。5ml 4M HCl加入到反应混合物，样试在100℃培养2小时，用氯仿萃取得到的游离的脂肪酸，溶剂蒸发后，残余物溶解在醚中，在4℃用重氮甲烷在醚中甲基化。蒸发醚，甲基醚溶解在75μl甲醇中，25μl的试样在硅烷化的硅酸盐薄层板(E.Merck.AG，Germany)上点板，混合物用丙酮∶甲醇∶水∶乙酸(70∶50∶35∶1，v/v/v/v)色层分离。用放射自显影观看空气干燥的板。在二氯苯氧氯酚存在和不存在的情况下，用闪烁计数测定25μl甲醇中的样品中[14C]丙二酸单酰CoA在脂肪酸中的结合程度。
这些实验表明二氯苯氧氯酚不仅抑制[14C]丙二酸单酰CoA在脂肪酸中的结合，还以一个显著的方式把脂肪酸合成的延长反应做为靶。
权利要求
1.羟基二苯基醚类化合物(以二氯苯氧氯酚为示例)和药理上可以接受的衍生物，在体内和体外抑制人类疟疾寄生虫的生长(Plasmodium Falciparum)中的用途。
2.通过检测后证实在使用了羟基二苯基醚类化合物后人体的疟疾寄生虫确被抑制的检测方法如下a)将对寄生虫的体外培养物的形态学特征的涂片检验作为其生长的指示标志；或b)将监控蛋白质中的[35S]蛋氨酸的结合作为抑制寄生虫生长的定量指标。
3.一种含有羟基二苯基醚类化合物(以二氯苯氧氯酚为示例)或其药学上可接收的衍生物，及药学上可接收的佐药，稀释剂或载体的组成的合成物，该合成物适合用任何方法引入血内。
4.权利要求3的权利要求中的合成物，用于一动物模型，如被P.Berghei感染的小鼠中抑制寄生虫生长的用途。
5.一种确定通过如权利要求4所述的注射后动物寄生虫的生长被抑制的方法，包括a)通过检验从动物体内取出的血的涂片来监控对于寄生物血症抑制的程度；或b)测定经处理的小鼠对未经处理小鼠的死亡率的降低。
6.一种确定任何化合物抑制在疟疾寄生虫中脂肪酸合成的延长的方法，是通过估测在脂肪酸中结合的放射标记的丙二酸单酰CoA的量，或通过使用层析法来分析所合成脂肪酸的类型来证实在没有脂肪酸合成系统的疟疾寄生虫的细胞中脂肪酸合成。
7.一种抑制疟疾寄生虫脂肪酸合成的延长反应的方法，包括羟基二苯基醚与所说的寄生虫、培养物、动物模型的培养中，或在来源于任何种类疟疾寄生虫没有脂肪酸合成系统的的细胞中，或包含FabII酶的疟疾寄生虫制备作为测试系统中。
8.如权利要求6或7权利要求的方法中，其中的样品是来源于人或动物的疟疾寄生虫。
9.通过任何注射途径—肌肉、皮内、腹膜、静脉、动脉或皮下注射在体内通过羟二苯基醚抑制疟疾寄生虫的生长的任何应用。
10.使用上述方法抑制疟疾寄生虫脂肪酸的延伸的任何其它种类的化合物。
全文摘要
我们报道了以二氯苯氧氯酚[2，4，4″－三氯－2′－羟基二苯基醚]作为示例的羟基二苯基醚类化学试剂作为治疗及疟疾治疗疗法应用的用途。更特别之处在于，本发明是关于脂肪酸合成作为这种化合物靶的确认，同时也涉及参与合成脂肪酸的一种关键性酶的确认。
文档编号A61K35/00GK1630525SQ99810238
公开日2005年6月22日 申请日期1999年6月23日 优先权日1999年6月23日
发明者苏罗拉·南米塔 申请人:苏罗拉·南米塔, 贾瓦哈拉尔尼赫鲁高级科学研究中心