一种产生功能性免疫球蛋白超家族蛋白的方法

专利名称：一种产生功能性免疫球蛋白超家族蛋白的方法
发明简述人类免疫系统的特异性和反应性受MHC(在人HLA中)分子控制。HLA的功能是对免疫T细胞选择和呈递抗原肽。可以认为免疫系统是通过MHC视孔观察世界，任何一种合理的免疫操作途径都必须考虑到MHC。这类合理的途径应该具有多种科研、实用或临床的价值。为了开发这些可能性，我们设计了一种方法，以新颖并且简便、可靠和价廉的方式产生高纯度的重组MHC分子。这些重组分子作为肽结合剂和T细胞激活剂具有充分的功能活性。可以使它们构成二种不同的形式a)作为完全成熟的肽填充部分，它非常稳定并具有极强的T细胞激活性，b)作为部分成熟的无肽部分(“空”MHC分子)，它具有合理的稳定性和肽易接受性。应该注意到，后一种结果修正了当前关于“空”MHC分子就是不存在的，或者至少是极不稳定的错误概念。
我们已知的产生重组或非重组MHC的所有其它方法，都更加麻烦并且/或者只能得到具有局限功效和纯度的产品。MHC分子的复杂性和不良稳定性导致要产生肽易接受性纯MHC分子将非常因难，因而要产生预定的纯肽-MHC复合物也非常困难。作为出自天然来源的天然分子，MHC分子的产物是缓慢和低产率的。并且只能用很麻烦的方法纯化它们，导致制备物中MHC被大量不同的肽预先占据了，并且有时还污染了其它MHC单倍型，最终结果是非常受污染的制备物。
产生MHC分子的难题综合起来是MHC基因座的极端多态性。在人类群体中存在400个以上不同的HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因，并存在200个以上HLA-D等位基因。这种多样性当然具有免疫学目的，但是对于产生MHC是一种实际障碍，因为需要产生许多不同的MHC，并且需要对它们单独地最优化、确认、鉴定和储存等。
重组表达系统可能具有多种优点。可能获得较高的产率和设计简便的纯化方案，并且可能用一个特定的肽对其分子作同质性标记。但是这种方法的主要障碍是，正确折叠的MHC结构是由三个成分(重链、轻链(β-2-微球蛋白β2m)和肽)组成的相当复杂的结构。只有三个成分都在一起时MHC方能获得充分的稳定性。特别是不存在其它两个成分时重链极不稳定。因此，很难制备、操作和贮存没有β2m和肽的分离的重链，因而也很难产生MHC分子，它可容易地结合实验者选择的任何一种肽。因为其有限的稳定性，分离的MHC分子会迅速聚集并被丢失，导致最终产率非常差。
本专利申请描述了大量产生具有所需任何等位基因特异性的重组MHC分子的一般方法。此方法还首次获得了真正的空MHC分子，并具有相当的稳定性，结果表明这些空分子的结合特征不同于过去产生的MHC所具有的结合特征。合理的预期是，这些空分子与生理性MHC结合有更多的关系，因为它们反映出重新结合状态，而以前使用的MHC分子已反映出更多的人工交换反应。除了改进MHC质量之外，这种新颖的制备方案还简便可靠，容易适合于大部分(可能是全部)MHC分子，并且对于完整功能的纯MHC分子具有高产率。这些重组分子是非常有效的，因为可对它们检测出小至2-4ng分离MHC重链的肽结合活性，并且可检测出小至150ng肽/MHC的T细胞结合能力。它们具非常的亲和活性，类似于对天然存在的分子所测定的亲和性，具有更快的结合速率并可充分地结合(即没有内源性肽)。我们已能够储存这种分子并使它们保持数个月活性。此含义既有分析证明又有治疗证明。
最后，所描述的方法已成功地用于其它(非-MHC)分子如CD3复合体成分。实际上，所公开的方法可应用于设计产生任何蛋白质(重组的或非重组的，在原核生物内或真核生物内)，其中在制备的某一阶段蛋白质通过变性或解析叠成为溶剂化物(其目的可能是解除蛋白质的聚集，为了纯化蛋白质等)，以后必须实施恢复/再折叠步骤。因此，本方法可能具有非常大的应用范围。我们推测，特别是它可能用于免疫球蛋白超家族的所有成员，包括抗体、MHC和T细胞受体。它可能用于产生包含至少一个半胱氨酸的所有分子。
存在二种MHC亚型，MHC I类和MHC II类。这二种亚型对应于二个T淋巴细胞亚群1)CD8＋细胞毒T细胞，它通常识别由MCH I类分子呈递的肽，杀灭受感染的或突变的细胞，以及2)CD4＋辅助T细胞，它通常识别由MHC II类分子呈递的肽，调节免疫系统其它细胞的应答。MHC I类由非共价结合于12000 MW非糖基化蛋白(β链，也称为β2-微球蛋白)的43000MW跨膜糖蛋白(α链)组成。MHC II类具有类似于MHC I类的整体结构，虽然功能区的分布不同。MHC II类由二个非共价结合的大约34000和29000MW的跨膜糖蛋白组成。对MHC I类和II类分子的详细结构已在X-射线晶体学的水平进行了分析(Bjrkman等，1987)。MHC结构最引人注目的部分是其上部，它显示出一个独特的肽结合凹槽，由形成凹槽围墙的二个α螺旋和形成凹槽底面的第八β-折褶的外套层组成。
MHC是非常多形性的，也就是说，人群中存在许多不同的版本(等位基因，同种异型)，但是每个个体只继承了其中的一个或二个(一个来自父亲，另一个来自母亲)。MHC也是多基因的，即在基因组中存在几个MHC编码基因座，使之有可能同时表达几个同种型。重要的是，大多数多形性残基是指向对其大小、形状和功能性起作用的肽结合凹槽(Mrtsumure等1992)。肽-MHC相互作用是特异性的，而虽然较宽，但可使许多无关的肽结合于每种MHC同种异型(Buus等1987)。这种多形性限定了肽结合的特异性，它的生物学结果是，群体中的每个个体培育和形成一套独特的T细胞指令表。MHC特异性的产生从结构上，MHC的肽结合部位形成一个凹槽，还可细分成从A至F的多个口袋。肽-MHC结合能的大多数包含在结合肽的主链原子(包括MHC I类的未端)；其特点对所有的肽都是共同的(Matsumura等1992)。只有少量结合能包含在肽侧链原子，但是认为这些相互作用可解释MHC的特异性。这种机制可解释MHC如何实现宽特异性及高亲和性的肽结合。从功能上，MHC是通过“基元序列”的识别来实现其较宽的肽结合特异性(Sette等1987)。一个基元序列表示出肽结合所需要的重要结构要求，例如在锚定位置中特定氨基酸的存在和适当间隔。相当多的兴趣已集中在理解MHC特异性和基元序列是如何产生的，以及鉴定各种MHC分子的特异性。这种努力的根本目的之一是能够预测肽结合。从MHC的多形性(同为这点在结构和功能上已证明)可以推断，每个MHC同种异型都具有其自己的特异性特征。迄今为止还只能够经过实验描述这些特异性。对MHC特异性的描述和预测目前有二种根本不同的，但互补的方法用于测定MHC的肽结合特异性。一种方法包括对已结合于给定同种异型MHC分子的肽进行测序(Buus等1988；Falk等1991)，而另一种方法包括测定哪些肽将会结合于此MHC(Buus等1986；Olsen等1994)。二种方法各有优缺点。测序的方法使用非人工处理的肽-MHC复合物，但是此方法人为地规定重要的残基、比较不重要的残基和不重要的残基，并且不能够鉴别负相互作用的残基。因此它最适合于鉴别最优势的正相互作用残基。后一种方法是直接结合法，是定量的方法，它可将结合的与不结合的进行比较。此方法可以鉴别和定量正的以及负的相互作用残基。因此如下结果可能不会令人意外与测序的方法(大约30％成功)相比较，直接结合法可获得较好的可预测性(大约70％预测的肽确实结合了)(Kast等1994)。已经证明，要准确地预测肽结合需要详细地了解所研究MHC的精细特异性(有时称为扩展的基元序列)(Paker等1994，Rupert等1993；Stryhn等1996)。但是，获得如此详细的基元序列需要非常多的人力和物力。目前，为了测定所需每种MHC分子的精细特异性，是对倾向于具有特殊序列或基元序列的大批肽进行常规分析(Parker等1994，Rupert等1993)。我们最近建立了一种基于肽文库的方法，此方法可对所有功能上重要的MHC结合残基给予准确、无偏见的和定量的描述(Stryhn等1996)。它是普遍运用的，因为对许多不同的MHC分子可以用相同的一套肽文库进行寻址，并且试验结合的测定法可被发展用于任何一种MHC分子。此方法简便，可显著地减少实验安排和随后的数据处理，因此便于绘制全部MHC I类特异性的完整图谱。基于这种无偏向的肽文库的方法也确实导致改进了对肽结合的预料(Stryhn等1996)。这种预测规则系统的成功暗示，基本上可将MHC I类的结合看作是独立起作用的亚特异性排列的结果。重组MHC分子的产生其它的研究者已可用细菌作载体用于产生重组MHC分子(Parker和Wiley 1989)。但是这些MHC分子被包裹在细菌内的包涵体中而不能为肽结合利用。包括使这些包涵体完全变性和还原的方案已被用于提取和溶解此重组MHC分子(Parker等1992，Parker等1992，Parker和Wiley1990)。这又使之需要在有还原/氧化剂如谷胱甘肽(GSH/GSSG)存在时在体外应用重折叠步骤。已加入了其它一些成分如L-精氨酸以便防止聚集和错误折叠。但是，体外折叠将面对在产生正确形成的二硫桥中的主要问题。MHC I类的重链包含4个半胱氨酸(在某些分子中是5个)。在这种重折叠过程中对于错误配对的二硫桥存在几种可能性。已有报导应用这种方法功能性MHC I类的一般产率很低(大约10-20％)，并具有非常缓慢的功力学过程(Garboczi等1992)。
发明详述本发明涉及一种我们发明的方法，是为了解决在聚集体如包涵体中表达的具有功能的免疫球蛋白超家族蛋白的问题。在本发明的方法中，功能性蛋白可能由在相同细胞中或在不同细胞中产生的几个蛋白质亚单位组成。在后一种情况下，此功能性蛋白质可能正好是二种不同的蛋白质，例如MHC I类蛋白的重链和β2微球蛋白，它可能是在折叠时或稍后被组合成。
在一个实施方案中，本发明涉及一种产生功能性免疫球蛋白超家族蛋白的方法，此蛋白在有功能时具有至少一个二硫键，此方法包括如下步骤(ⅰ)提供一种包含编码此蛋白质基因的细菌细胞，此基因在该细胞中可表达，(ⅱ)在使此基因表达的条件下培育此细胞，(ⅲ)在不会改变细胞产生的二硫键的条件下从细胞中分离出此蛋白质，并且任选地纯化此蛋白质，(ⅳ)使分离出的蛋白质经受折叠处理。
在本详细说明和权利要求中当使用“a”或“an”时，这意指一个或几个，即至少一个。
用名词“功能性蛋白”意指能够实现某些功能中至少一种功能的免疫球蛋白超家族蛋白，这些功能至少在相当程度上归因于这种蛋白质，例如通过体外检测法所评估的。作为例子，“功能性MHC I类蛋白”被定义为包含重链、轻链(b2m)和肽的蛋白质。为了使它在水溶液中能溶解可将重链截去。此肽是可结合于所述MHC蛋白的肽。可借助于例如由Buus等1986和Olsen等1994所描述的直接结合法发现这种肽。
“功能性MHC II类蛋白”意指包含二个重链(α和β链)和一个肽的复合体的蛋白质。为了使此复合体可溶解于水溶液可将其重链截去。此肽是可以结合于所述MHC蛋白的肽。可借助于例如由Buus等1986和Olsen等1994所描述的直接结合法发现这种肽。
本发明特别优选的实施方案是一些方法，其中的MHC蛋白是一种MHC I类蛋白，选自重链、与β2m组合的重链和功能成熟的MHC I类蛋白质；或者是一种MHC II类蛋白，选自α/β二聚体和带有肽的α/β二聚体。本发明的一个重要方面是一种方法，其中所形成的MHC蛋白是作为一种无肽的MHC蛋白被获得。
“无肽的MHC I类蛋白”意指包含与轻链(b2m)结合的重链但不含肽的蛋白质。这种蛋白质还可被称为“空”MHC I类蛋白。
“无肽的MHC II类蛋白”意指包含重链复合体但不含肽的蛋白质。这种蛋白质还可被称为“空”MHC II类蛋白。
将根据MHC I类蛋白对本发明作例证性说明，但是可设想按相似的方式有可能产生所有的免疫球蛋白超家族蛋白(由二硫键结合确定的蛋白)，即包括选自如下种类的蛋白质抗体、免疫球蛋白可变(V)区、免疫球蛋白恒定(C)区、免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链、CD1、CD2、CD3、I类和II类组织相容性分子、β2微球蛋白(β2m)，淋巴细胞功能相关的抗原-3(LFA-3)和FcγRIII、CD7、CD8、Thy-1和Tp44(CD 28)、T细胞受体、CD4、多免疫球蛋白受体，神经细胞粘附分子(NCAM)、髓鞘相关糖蛋白(MAG)，髓鞘质P蛋白、癌胚抗原(CEA)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、集落到激因子-1受体、αβ-糖蛋白、ICAM(细胞间粘附分子)，血小板以及白介素。本发明者已提供了关于几种MHC I类分子、β2-微球蛋白、MHC II类分子、以及T细胞受体CD3链γ和ε的资料。
按照例如“分子克隆”(Sambrook，Fritsch和Maniatis，冷泉港出版社，1989)中所述的标准程序克隆编码所需不同蛋白质的cDNA。概括地说，可使用商品cDNA合成试剂盒(碰巧购自Pharmacia)从适合的细胞系合成cDNA。为了用于人，此细胞可从一组表达HLA的EBV转化的人B细胞系得到，此B细胞系是来自第12届国际组织相容性专题讨论会的细胞系各单数据库(“HLAHLA的基因多样性，功能和医学意义”，Dominique Charron编辑EDK出版，1997，或者参见http//www.icnet.uk/axp/tia/marsh/ihw.html)。对于HLA-A*0201，适合的细胞系可以是IHW9012。与所需MHC/HLA分子相对应的核苷酸序列可以在http//www.anthonynolam.com/HIG/index.html，或 者 在http//www.ncbi.nl m.nih.gov找到。应用此序列信息可以设计雾核苷酸引物，以便近过聚合酶链式反应扩增包含来自此适当cDNA的成熟MHC/HLA分子氨基酸1-274的编码区。选定相关的正向和反向引物用于扩增HLA-A*0201，并将它插入Pet28a表达载体(Novagen，见http//www.novagen.com/vectfram.html)的NcoI和HindIII限制性位点。将连接产物转化进入细菌TOP10F’并对卡那霉素抗性选择过夜。挑选出几个克隆并借助于Wizard miniprep(Promega)制备它们的质粒。在应用此克隆引物的聚合酶链式反应中将该质粒用作模板，并通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色分析此扩增产物。对导致适当大小扩增产物的质粒进行测序(ABL310测序仪)，以便鉴别包含所需序列的克隆。将这些确定无疑的克隆用于随后的制备过程。类似的方案可用于克隆任何所需的基因。
特别优选的蛋白质是脊推动物蛋白质，例如人的、鼠的、大鼠的、猪的、牛或鸟类的蛋白质。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种产生多种功能性蛋白质的方法，在此至少其中一种蛋白质是免疫球蛋白超家族，并且此多种蛋白质当有功能时包含至少一个分子内或分子间二硫键，此方法包括如下步骤(ⅰ)提供一种细菌细胞，此细胞包含各编码一种蛋白的多种基因，所有的基因都可在该细胞中表达，
(ⅱ)在使这些基因表达的条件下培养此细胞，(ⅲ)在不会改变细胞产生的二硫键的条件下从细胞中分离出这些蛋白质，且任选地可纯化它们，(ⅳ)使分离出的蛋白质经受折叠处理。
在此实施方案中，此蛋白质可以是融合蛋白，或者可能是二个单独的蛋白质，即共表达蛋白质。
另一个实施方案涉及一种产生功能性免疫球蛋白超家族蛋白的方法，此蛋白质在有功能时具有至少一个二硫键，此方法包括如下步骤(ⅰ)提供一种包含编码该蛋白质基因的细胞，此基因在该细胞中可表达，此蛋白质是作为一个聚集体被表达，(ⅱ)在使该基因表达的条件下培养这种细胞，(ⅲ)在不会改变细胞产生的二硫键的条件下从细胞中分离出此蛋白质聚集体，并且任选地纯化它，(ⅳ)使分离出的蛋白质经受折叠处理。
变性蛋白质可能以许多不同的构象存在—它没有一个独特的构象-而在水溶液中折叠的蛋白质是以一种或几种截然不同的构象存在。本发明的基本特征之一是，它避免对在还原条件下由复性作用引起的蛋白质聚集体进行常规的溶解，这将导致完全未折叠的蛋白质。为了产生正确折叠的蛋白质而需要再形成正确的二硫键，这使随后的再折叠复杂化了。本发明方法的特点在于它意外地发现，存在于聚集体如包涵体中的蛋白质似乎是以具有正确二硫键的功能性形式存在，因此其任务是使它们不破坏二硫键而被溶解。本发明者已发现，必须在不改变蛋白质的氧化还原状态的非-还原条件下使此蛋白质变性溶解。应用具有正确二硫键的变性蛋白质可导致简化重折叠过程，现在可能像稀释例如尿素一样简单而不需加氧化还原偶合物。但是可借助于其它一些蛋白质如伴侣蛋白帮助折叠，在MHC I类的情况下可借助于β2m和/或肽的帮助。进而根据本发明，对于某些蛋白质如MHC可以基本上在没有氧化还原偶合物如GSSG/GSH的存在下进行折叠处理。
可通过使细胞破裂来实现分离过程，分离出聚集体如包涵体(例如通过离心)，任选地可进行洗涤，在导致提取可溶性蛋白质的变性剂(例如尿素或盐酸胍，或者借助于本领域技术人员已知的其它方法)中提取此聚集体(如包涵体)。这是分离步骤(ⅲ)的简要过程，对于本领域的技术人员显然还可以对它进行修改或者随后加入例如纯化步骤。这是一个特别方便的时机，对于MHC分子加入纯化步骤确实是优选的，因为可以除去包括寡肽的许多非共价结合的分子。可借助于如下多种方法进行这种纯化过程离子交换层析、大小排阻层析、亲和层析、疏水相互作用，沉淀法，过滤法，离心法和本领域技术人员已知的其它方法。
通过将变性剂(如尿素)稀释至导致蛋白质折叠的浓度点可启动折叠。本发明方法中的折叠步骤优选地是在含有至少一种缓冲剂化合物的水介质中进行。然后可使蛋白质经过如上所述的纯化程序。
在本发明的方法中，含有编码异源性或同源性蛋白质基因的细胞，并且此基因可在其中表达的细胞可以是任何一种细胞。优选地此细胞可选自细菌细胞，真菌细胞，酵母细胞，动物细胞和植物细胞。更优选地此细胞是选自革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细菌细胞。在本发明优选的实施方案中此革兰阴性菌是大肠杆菌，包括BL21株或它的衍生株或者XA90株或它的衍生株。
预期可用的另一种细胞是被遗传修饰的细胞，与相同株的未修饰细胞相比较这种细胞较弱的细胞内还原环境，例如此细胞已被修饰具有降低的或者缺乏硫氧还蛋白还原酶或对细胞质硫氢基还原潜力具有相似作用酶的活性，如trxB-突变株。另一种可用的细胞株可以是能够生物素化蛋白质的细胞株，即此细胞株能够生物素化具有生物素化序列的蛋白质。可以在体内或体外修饰这种蛋白质，例如被磷酸化、糖基化、乙酰化、酰胺化或任何所适当的其它修饰方式。
被表达的蛋白质可能定位在细胞内、细胞周质或细胞外。
借助于任何一种用于将核苷酸序列导入细胞的常规技术可实施插入编码功能性蛋白的基因，例如通过转化、转染或转导技术。一般可借助于转座(transposome)或通过重组过程将基因插入宿主细胞的染色体，或者可以借助于适当的载体以游离体的形式将基因导入。适合于此目的的载体包括pET载体如T7质粒。
人们会总意识到，基因可被单独地或者与另一些核苷酸序列组合在一起导入宿主细胞。包括调节基因表达的序列如启动子序列，调节启动子的序列，增强子序列，编码包括反义RNA的阻抑物的序列，或者终止序列。为了增加所产生蛋白质的量，可以将编码此功能蛋白质的多拷贝基因导入宿主细胞。也可能导入编码伴侣蛋白的序列或者调节天然伴侣蛋白表达或功能的序列，或者编码导致此功能性蛋白质糖基化的基因产物的序列。此启动子可能是组成型或可诱导的。
本发明方法的优越性表现在蛋白质产物的一方面或几方面。按照本发明方法产生的功能性蛋白质的产率，相对于在基本类似的条件下，但其中是在确实改变细胞产生的二硫键的条件下实施步骤(ⅲ)所得到的功能性蛋白质的产率可能增加至少10％，例如至少20％、至少40％、至少50％、至少70％、或至少100％。另一方面，按照本发明方法的速度，与在确实改变细胞产生的二硫键的条件下实施步骤(ⅲ)时的速度相比较可能至少快10％，例如至少20％，至少40％，至少50％，至少70％，或至少100％。预期其速度实际上可能是多达2倍、5倍、10倍、100倍或10000倍地增加。在本发明优选的实施方案中，其速度至少增加50倍。最后，按照本发明的方法产生的功能性蛋白质的纯度，相对于在基本上相似的条件下，但其中是在确实改变细胞产生的二硫键的条件下实施步骤(ⅲ)所得到的功能性蛋白质的纯度可能增加至少10％，例如至少20％、至少40％、至少50％、至少70％或至少100％。
根据实施例特别是MHC蛋白A2，其折叠效率可能是至少40％，而MHC蛋白Db具有认为还要更高的折叠效率，即至少50％。对于活性蛋白质此百分率是在折叠后立即被测定，与在折叠过程中所研究蛋白质的输入量相比较。预期当使本发明的方法对于所研究的蛋白质最佳化时，那么在所产生的免疫球蛋白超家族蛋白中至少可获得25％具有功能形式的蛋白。
优选地此蛋白质不含有未配对的半胱氨酸残基。但是在本发明范围内的一个实施方案，其中该蛋白质含有1个未配对的半胱氨酸残基。此蛋白质可能含有至少2个例如至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、或至少20个半胱氨酸残基。优选地此蛋白质含有偶数的半胱氨酸残基。非常可能此蛋白质具有至多20个，例如至多14个、至多10个、至多8个、至多5个、至多4个、至多3个或至多2个半胱氨酸残基。此蛋白质优选地能够具有至少1个，例如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个二硫键。非常可能此蛋白质能够具有至多20个，例如至多15个、至多10个、至多8个、至多5个、至多4个、至多3个或至多2个二硫键。
在优选的实施方案中，其基因是天然存在基因的衍生物。通过取代至少一个密码子可获这种衍生物，此密码子与原来存在的编码相同氨基酸的密码子相比较更经常地被宿主细胞利用。一般地说此基因是在天然状态不与此基因结合的调节性DNA序列的控制之下。但是它还可能是在它自己的启动子控制之下。在本发明优选的实施方案中，是以选自pET载体例如T7质粒的表达载体转化细菌细胞。对于本领域的技术人员显然还有其它的载体。
本发明最重要的方面是可通过本发明方法获得的一种稳定的无肽MHC蛋白。在本领域以前还没有通过任何方法产生稳定的无肽MHC蛋白。虽然已声称(Matsumura等1992)从TAP缺乏的真核细胞如T2或昆虫细胞可以获得空分子，但是从这种制备物中已提取并鉴定出肽(Wei和Cresswell1992，Henderson等1992)，也就是说，这些制备物不是真正的空分子。稳定的无肽MHC蛋白的用途之一是提供用于高效率地产生纯的同源肽-MHC复合体。用名词“稳定的”意指在尿素中分离形式的重链在-20℃，50％甘油下可以保存至少3个月。此复合物的半寿期实际上大于6个月，正在研究功能性MHC复合体即11重链和β2m在水溶液中的稳定性。但是已知在存在过量β2m时重链在水溶液中稳定的半寿期在4℃是大约2天。
本发明的另一个重要方面是一种试剂盒，它包含有使其接受者能产生功能性MHC I类蛋白的MHC I类重链和β2m，对此蛋白可以加入能够结合于该MHC I类蛋白而导致形成功能性MHC I类蛋白的肽。此MHC蛋白将通过本发明的方法被优选地产生。在一个实施方案中，此试剂盒包含将允许最终使用者可测定对他/她所选择的任何一种肽结合的试剂，可应用如酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)或本领域技术人员已知的其它检测系统。在另一个实施方案中，此试剂盒包含低聚合的MHC蛋白，例如2个、3个、4个或更多MHC蛋白的低聚合物。在一个特定的实施方案中，此试剂盒包含被加入作为标记物的另一种试剂，使此试剂盒适合于诊断的目的。标记物优选地可选自荧光染料、酶、化学发光和放射活性的标记物。
本发明方法的优选用途是用于生产MHC，特别是无肽的MHC分子。稳定的无肽MHC蛋白的优选用途是用于分析MHC中改变一个氨基酸对该MHC结合特异性的影响，如通过应用肽文库法分析所测定的，不论是合成的或者是重组的文库。这样一种MHC点突变的组合，随后通过肽文库进行特异性分析，可构成一种测定结构-功能相互关系的新型方法。本发明的另一些用途如下面所述。重组MHC I类分子的用途a)分析和诊断(特别是借助于ELISA和/或FACS)a.1)对肽-MHC相互作用的定量测定测定肽和MHC之间的相互作用是相当有价值的。对任何推定存在的T细胞抗原表位都应该检验其对MHC的结合，优选地是进行定量测定。目前不良控制的检测系统、缺乏空MHC分子和/或需要标记至少一种成分都阻碍了用于测定这种相互作用的方法。空分子是高活性的，易运用于高度受控制的RIA类型的生物检测系统(BuuS等1995)。空分子还适合于通过ELISA法检测。在优选的实施方案中，这种ELISA包括泛-特异性的抗-MHC抗体的捕捉和泛-特异性的抗-MHC抗体的检测，随后是高灵敏度、定量的非放射活性检测。其它的ELISA检测方案(例如包括亲和性标记的)也是本领域技术人员已知的。
a.2)对用于定量和定性鉴定T细胞群的特异性T细胞的详述1996年Mark Davis和其同事(Altman等1996)证明，用加入的附着于重链C-端的生物素化信号可产生重组体纯肽-MHC I类复合物。在酶促生物素化过程之后，可用藻红素标记的链亲和素使这些复合物四聚体化。然后可按肽特异性的、MHC I限定的方式将这些多聚体化的标记的肽-MHC I类复合物用于标记T细胞。一般认为对于肽-MHC I复合物T细胞受体的稳定性太低，不能引起稳定的生物化学结合。但是四聚体化之后，多聚体化复合物的亲合性足够引起生物化学结合。因此，借助于荧光激活的细胞分选仪(FACS)的分析，可将这种四聚体用于对任何给定的细胞悬液中T细胞的数目进行计数。此后表明，用于计数特异性T细胞的老方法，有限稀释分析法非常不准确，并会过低估计特异性T细胞的数目。因此不论从科学的观点而且从公布文献的观点进行“四聚体”分析都已成必需的。Davis的方法具有二个主要的问题难以产生大量的纯MHC I分子，以及生物素化过程是昂贵、麻烦的，特别是需要在37℃持续地温育。许多肽在此温育的后期确实仍然结合于MHC I，这可能解释即使在相同的实验中结果易变的原因。本专利申请公开了一种方法，按照此方法可以快速有效地产生肽-MHC复合物，致使复合物形成后只要作最小的修正。预期按照本发明方法产生的MHC I分子经得起作为商品试剂盒的运输和贮存的考检，它还进一步允许在任何非专门的实验室，用最后使用者选择的任何相关肽生产最终的肽-MHC I复合物。相比之下，以前生产MHC I的方法可能要求有相当多的蛋白质和分子生物学知识以及经验。最后可以预期有许多比酶促生物素化法更好的方法能用于标记MHC I(Gallimore等1998，Walter等1998)。
a.3)对使免疫处理可受到精确监控的特异性T细胞的详述任何免疫处理(例如免疫接种)都需要精确和特异性的监控。上述的“四聚体”技术是目前对免疫处理过程进行科学、临床和商业评价的极好标准。
b)科学价值b.1)对MHC I分子特异性的功能和结构测定在产生T细胞介导的所有应答时MHC I分子是主要的角色。相当多的努力都是针对理解MHC I分子的功能和特异性。在所有这些场合都需要获得有功能活性的MHC I分子。从天然来源产生MHC I分子有几个严重的缺点(麻烦、昂贵的生产过程，还会产生少量不纯的MHC I)。在此公开的方法使有可能简便、快速和高效率地产生肽-MHC I复合的。以前用于产生肽-MHC I复合物的方法包括对处于重折叠过程中的MHC I提供过量肽的步骤(Garboczi等1992)。因此所形成的复合物被肽预先占据了，不能很快地重新进行肽结合。按照在此公开的方法可以将所产物的MHC I分子立即用于结合肽，并因此可用于对肽结合进行任何一种分析，包括将异性分析。重组MHC I分子与最近公布的肽文库法相结合(Stryhn等1996)，研究者可仔细地测定包括突变MHC I分子在内的任何MHC I子的特异性。应该着重指出的是，这种详细的分析还导致提高了对肽结合的预测(Styrhn等1996)。
b.2)对T细胞特异性的功能和结构测定通过在此公开的方法可快速有效地产生纯肽-MHC I复合物。这种复合物可在T细胞受体与该肽-MHC I复合物相互作用时用于分析此T细胞受体的结构，并且应用肽变异体或MHC I变异体还可能对T细胞变体的特异性进行功能分析。
b.3)对特异性T细胞的处理(诱导或阻断)在此公开的肽-MHCI复合体能够与给定靶细胞的T细胞受体相互作用。为了刺激此细胞，它的T细胞受体必须被交联。因此可以预料，多聚体化的肽-MHCI复合物(如“四聚体”)可能刺激适合的肽特异性的MHC I-限制性T细胞，而可溶性肽-MHC I复合物可能阻断这种细胞。
b.4)对免疫处理(如免疫接种)特异性作用的监测在技术得到进一步改善之前，任何关于如何操纵T细胞免疫系统的研究都依赖于现存的“四聚体”(或类四聚体)技术。可以精确、简便地测定其诱导预测的特异性应答的能力，并且借助于现代的FACS分析技术可更进一步分析哪些亚群受到影响和程度如何。因此四聚体技术对于免疫处理的未来发展将是必不可少的。
b.5)纯化特异性T细胞四聚体将使对肽特异性的MHC I限制性T细胞的有效纯化成为可能。作为例子，如果此四聚体通过它们的生物素被偶联于顺磁性微珠，那末使用一个磁体就可比较直接了当地纯化其相应的特异性T细胞。然后此特异性T细胞可被洗脱出，用于分析或被扩展并被用于进一步的免疫处理(例如适应性T细胞转移)。与目前极端麻烦和缓慢的克隆技术相比较这可能成为一个巨大的改进。
c)治疗用途c.1)疫苗的开发对疫苗开发的作用可被粗略地细分为直接的和间接的作用。所公开技术的直接作用可能是将b3中所述的原理用于治疗，在此，基于按刺激性方式(交联成“四聚体”或在微珠上等)所给予的被分离的富有肽的MHC I分子，预期将高度特异性并非常有效地激活特异性T细胞(随后是激活免疫系统)。间接的作用是由改进对候选疫苗的鉴别引起的，这种改进将是本公开技术的结果。通过使其能够对人全部MHC I分子进行大批量详细地分析，将改善对能够结合于MHC的病原体来源肽的预测，并且有可能容易地证实这种预测(MHC特异性抗原表位分析)。
c.2)对自身免疫性疾病的治疗对治疗自身免疫疾病的作用可被粗略地细分为直接的和间接的作用。所公开技术的直接作用可能是将b3中所述的原理用于治疗，在此，基于按非刺激性方式(即作为可溶性的非交联复合物)所给予的被分离的富有肽的MHC I分子，预期将导致高度特异性地阻断特异性T细胞(随后是阻断免疫系统的重要部分)。间接的作用是由改进对诱发自身免疫性疾病的候选物的鉴别引起的，这种改进将是本公开技术的结果。通过使之能够对人全部MHC I分子进行大批量详细地分析，将改善对能够结合于MHC的自身蛋白来源肽的预测，并且有可能容易地证实这种预测。
c.3)纯化T细胞用于适应性转移可以用“四聚体”特异性地标记T细胞，因此也可以对它进行挑选(即通过磁性微珠)，获得具有预定特异性的纯T细胞群制备物。然后可以使这种T细胞群扩展用于例如针对感染性疾病或致癌性疾病的适应性转移(adoptivetransfer)。
c.4)治疗癌症许多癌症与突变的致癌基因/肿瘤抑制基因有关，或者与不良调控的致癌基因/抑制基因有关。形成的细胞代谢改变可被免疫系统发觉。现在有例子表明，不良调控可导致完全正常的自身蛋白水平发生改变。但是在这种情况下已证明自身蛋白水平的改变使它变得具有致免疫性和肿瘤排斥作用(Vierboom等1997)。作为例证但不局限于这些例证，借助于基因分析(例如“单链构象多态性”，“选择性聚合酶链式反应”或“差异展示”)或者蛋白质分析(质谱驱动的蛋白质分析)可发现这种突变和不良调控。可以对任何这样鉴定的蛋白质进行上述的MHC特异性抗原表位分析，并可如c1和c3所详述的尝试对癌症进行特异性治疗。
泳道1如所指示的标准参照物。泳道2诱导前的细胞蛋白质。泳道3诱导后3小时的细胞蛋白质。泳道4用阴离子交换层析纯化后的重组HLA-A*0201。图2非还原条件下在15％SES-PAGE中分析的重组HLA-A*0201重链的阴离子交换组分，此重链是来自尿素溶解的包涵体蛋白。分析了与纯化肽结合单体相应的组分(在上端标明了组分号，与图中相对照)。显示重组HLA-A*0201象二种大约31-32kD的不同蛋白质一样迁移；蛋白带2a和3都具有完整的二硫键。图3存在或不存在DTT时对纯化的重组HLA-A*0201分子的SDS-PAGE分析。泳道1通过稀释法折叠(非还原的方法)得到的高度纯化的和功能性HLA-A*0201重链。泳道2和3在非还原条件下阴离子交换的HLA-A*0201重链(蛋白带2a和3)。在泳道3显示二条蛋白质带通过存在于泳道4中的还原剂被部分地还原成蛋白带1。泳道4在还原条件下阴离子交换的HLA-A*0201重链，显示出蛋白质带1，它比蛋白带2a和3迁移更缓慢。图4对洗脱量蛋白质分析的阴离子交换组分和相对应的肽结合能力。由BCA确定浓度并在OD562下(实线)测定。还对相同的组分测定了肽结合。对柱加样的大约30％蛋白质总量没有结合(碱性的或中性带电的蛋白质)。这些蛋白质与同包函体共纯化的细菌本底蛋白质相对应。用大约200mM的NaCl洗脱重组HLA-A*0201分子，并通过肽结合分析(虚线)和SDS-PAGE分析(图3)进行鉴定。图5用特异性抗体免疫沉淀重组HLA-A*0201分子。
在4℃将重组HLA-A*0201重链、b2m和放射性标记肽的复合物与抗HLA-A*0201，H-2Kk或H-2Dh分子的单克隆抗体共同孵育。然后加入蛋白A沉淀免疫复合物。反复洗此沉淀并作放射性记数。只有HLA-A*0201特异性的抗体BB7.2和W6/32能沉淀结合了放射性标记肽的重组HLA-A*0201。在重组HLA-A*0201与具有无关特异的抗体之间不存在可测定出的相互作用。图6与重组HLA-A*0201重链结合的肽。
将逐渐增加剂量的重组HLA-A*0201重链与b2m(1μM)的微量放射性标记的肽(2nM)在18℃共温育4小时。借助于G25旋转柱层析测定复合物形成的程度。图7肽与重组HLA-A*0201相互作用的亲和性。
将5nM重组HLA-A*0201与微量放射性标记的肽和b2m(1μM)以及分别具有对HLA-A*0201和H2-Kk特异性的逐渐增加浓度的未标记肽共同温育。在18℃共温育这些反应物4小时，并借助于G25旋转柱层析测定复合物形成的程度。将结合的配体浓度对结合与游离配体之比作图得到Scatchard直线图(插入图)。图8对重组HLA-A*0201的b2m依赖性肽结合。
将重组HLA-A*0201重链与微量肽和如所示的逐渐增加浓度的人和小鼠b2m共温育。在18℃温育此反应物4小时，并借助于G25旋转柱层析测定复合物形成的程度。图9逐渐增加剂量的重组HLA-A*0201重链与放射标记的人b2m在有或没有特异性肽(10μM)存在时，在18℃共温育4小时。将此反应物在18℃温育4小时之后，借助于G50旋转柱层析测定复合物形成的程度。

图10b2m从重组HLA-A*0201复合物中的离解。将旋转柱层析纯化的重链和带有或不带有肽的放射标记b2m的复合物与3μM未标记的b2m混合，并在4℃温育所指定的时间。借助于葡聚糖凝胶G50旋转柱层析测定离解的程度。图11通过FACS分析评估的四聚体染色。被分析的细胞是CD8阳性的T细胞，此T细胞是来自携带有对与H-2Db结合的KAVYNFATM肽特异性的T细胞受体转基因的小鼠，或者是来自非转基因对照H-2Db小鼠。以藻红素-链亲合素形成的四聚体进行分析，此四聚体包含与重组H-2Db和生物素化b2m复合的相关的KAVYNFATM肽，或者带有与重组H-2Db和生物素化b2m复合的无关的FAPGNYPAL肽。以在x-轴上的四聚体染色和y-轴上的CD8染色进行FACS分析。在右上四边形中可见阳性四聚体和CD8阳性细胞的数量。对方框右边计算四聚体和CD8都为阳性的细胞总百分数，并在右上四边形中直接给出。
T细胞复合物 ％四聚体+和CD8+图11A 相关的 相关的53％图11B 相关的 无关的2％图11C 无关的 相关的1％图11D 无关的 无关的3％
在pGMT7载体(pET衍生载体)中的重组H-2Db来自Dr Gallimore的友好赠送。将含有H-2Db的质粒转化进入大肠杆菌BL21菌株(DE3)(Novagen)，在含有100μg/ml氨苄青霉素的200ml Luria-Bertani培养基中37℃培养。为了制备在含有100μg/ml氨苄青霉素的200mlLuria-Bertani培养基中接种来自过夜培养物的这种细胞，并在37℃培养。
用0.4mM异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在对数生长中期(A600-0.6)诱导蛋白质表达。3小时后通过离心收细胞。将此细胞悬浮于含有1mM EDTA的10ml20mM，pH8.0的tris缓冲液中，-20℃保存。分离包涵体和纯化重组HLA-A2*01 I类重链在含有溶菌酶(100μg/ml)，EDTA(1 mM)，PMSF(50μg/ml)的10ml20mM pH8.0的tris缓冲液中借助于超声处理破裂冷冻的细胞制备物(来自200ml培养物的)，并在室温下温育20分钟。随后加入DNA酶(10μg/ml)和MgCl(10mM)。放置一段时间之后通过以10000g离心15分钟部分地纯化包涵体。在tris缓冲液内洗含有包涵体的沉淀3次。最后通过在含有PMSF和EDTA的3ml8M尿素、20mM tris pH8.0的溶液中4℃温育2小时使沉淀溶解。通过离心除去不溶解的物质。收集此上清液，使之通过孔径0.22μm的滤器然后保存在-80℃。这些制备物含有HLA-A*0201I类重链，根据SDS-PAGE测定此重链具有大约60-80％的纯度。用阳离子交换(速流、Pharmacia)柱(1×25 cm)纯化了此HLA-A*0201I类重链。用8M尿素、pH8.0的20mM tris缓冲液将含有部分纯化重链的制备物稀释5倍，并对此离子交换基质加样。用20ml8M尿素、pH8.0的20mM tris缓冲液洗柱，然后以在8M尿素、pH8.0的20mM tris缓冲液配制的0-500mM NaCl梯度液洗脱蛋白质。通过BCA蛋白测定，SDS-PAGE分析和肽结合能力监测被洗脱的蛋白质。将含有高度纯化的重链蛋白质单体的组分和具有高度肽结合能力的组分合并在一起，保持于-80℃。111.4b2m和单克隆抗体的纯化按以前所述方法(Pedersen等1995)制备并纯化了重组人和小鼠b2m。以腹水的形式制备了单克隆抗体W6/32(α-HLA I类)、BB7.2(α-HLA-HLA-A*0201)、11-4.1(α-Kk)、S13-29(α-Kk)、28-14-8S(α-H-2Db)，和B22-249(α-H-2Db)，并通过蛋白A层析进行了纯化(这些杂交瘤大多数来自ATCC)。放射性碘化标记b2m和肽通过反相HPLC层析纯化HLA-A*0201和H-2Db特异性肽，并被冷冻干燥。按以前所述的方法(Olsen等1994)放射标记此肽(1-2μg)，达到60mCi/μg的比活性。可结合于重组的或天然MHC I类的被标记肽的百分率通常是80％。电泳用均质的聚丙烯酰胺凝胶(15％)进行一维的小型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。在SDS-PAGE分析之前先在加入或不加入50mM DTT的Laemmli样品缓冲液中将样品煮沸。用Coomassie兰R-250对蛋白质染色。肽对重组HLA-A*0201 I类分子的结合(示踪结合)对来自阴离子交换纯化的变性重组HLA-A*0201重链测定其在b2m存在时结合肽的能力。基本上如同通过稀释测定(Garboczi等1992)实施肽对重组重链的结合-不同的是放射标记肽的量是示踪量即大约2nM。通常是在下述的折叠缓冲液中将取自离子交换纯化组分的1μl变性的重链液稀释100倍。温育此反应物至少4小时。借助于葡聚糖凝胶G25旋转柱层析(Buus等1995)检测肽的结合。所有的实验都进行了二次或二次以上。揭示出由20mM tris pH7、150mM NaCl、1mM EDTA、50μg/ml PMSF、1μM b2m和1-2nM示踪肽组成的最佳折叠缓冲液可优化肽对重组H-2Db和HLA-A*0201的结合。值得注意的是，经典的折叠剂如L-精氨酸和细菌伴侣蛋白如GRO-EL/ES对此肽结合没有负面影响(资料未显示)。正常浓度范围的GSH/GSSG例如1.8mM/0.2mM对此肽相互作用没有影响。在4℃-37℃温度范围内的肽结合分析表明18℃有最佳的结合。在pH5.5-9的范围内肽结合分析表明在pH6.5-7.5有最佳的结合。动力学研究显示在18℃4小时温育之后达到示踪肽结合平衡。功能性HLA-A*201 I类分子的产生(递增性折叠)通过在折叠缓冲液(如上面)中100倍稀释使变性的和纯化的HLA-A*201重链制备物(300-600μg/ml)折叠，对它加入肽达到大约10μM的浓度。应用具有大约10kD阻隔孔径的Amicon滤器在4℃将此反应物浓缩10-20倍。在4℃保温此浓缩物1小时，然后在15000g离心15分钟。进一步使用具有大约3kD阻隔孔径的Centricon装置在4℃浓缩其上清液。反复离心后将上清液对大小排阻层析柱(葡聚糖凝胶G50)加样，除去游离的b2m和肽。合并含有功能性HLA-A*201I类的组分，并浓缩至大约1mg/ml的浓度。结果对变性的重组HLA-A*201重链的表达和纯化用基本上如Garboczi等(Garboczi等1992)所述的方法表达并部分地纯化重组HLA-A*0201和H-2Db。在大约0.6的细胞浓度用0.4mM IPTG诱导细胞并在37℃温育3小时。以15％SDS-PAGE凝胶分析在加入和未加入IPTG时煮沸和还原样品的迁移率。估计重组HLA-A*0201的产率是大约50-50ml/L培养物，相当于图1中泳道3大约33kD的主要蛋白带。
为了分离包涵体通过超声波处理使此细胞破裂。离心此表达重组重链的细胞(来自200ml培养物)，并使沉淀在含有20mM tris、pH8、溶酶体、PMSF和EDTA的缓冲液中再溶解。随后加入DNA酶和MgCl2。待此溶液放置一段时间之后(20-30分钟，22℃)离心沉淀出包涵体。在tris缓冲液pH8中洗沉淀3次，最后在8M尿素中再溶解并保存在-80℃。
应用阳离子交换层析将来自包涵体的部分纯化的蛋白质进一步分级分离。进行这一纯化步骤的原因是为了使制备物有效地富集高度折叠的重组HLA-A*0201分子，并避免异质性(少量污染物，在细菌中对重链的少量酶促改变等)。
以梯度(0-500mM)NaCl洗脱单体重组HLA-A*0201。分别在大约200mM和350mM NaCl洗脱出了重组HLA-A*0201和H-2Db重链单体。以SDS-PAGE分析了此纯化重链的纯度、浓度和功能性(图1泳道4和图2)，并进行了BCA-蛋白质测定试验和示踪蛋白质结合分析(图4)。
阴离子-交换纯化和非还原性SDS-PAGE分析表明，从分离的包涵体中溶解的大多数，如果不是全部，重组HLA-A*0201蛋白被氧化了，即含有二硫桥。如图2中显示的，在非还原性SDS-PAGE分析中洗脱出的重组HLA-A*0201重链迁移成二个不同的带(此后分别被分称为2a和3)。应用大小排阻层析、离子-交换层析或疏水性层析我们都未能使蛋白质2a与蛋白质3分开。在还原性条件下，此二种HLA-A*0201重链像一个单独的蛋白带——被称为带1，缓慢地共-迁移(图3，将电泳道2和3与电泳道4相比较)。此蛋白带相当于图1中占优势的HLA-A*0201蛋白带(电泳道3)。总之此蛋白质仿佛是带有完整的二硫桥包裹在包涵体内，导致成为至少二个不同的单体。如下面所述的折叠实验清楚地表明，只有蛋白带2a折叠成为功能性重组HLA-A*0201复合物(图3，比较泳道1和2)。在通过稀释法的折叠过程中蛋白带3错误折叠并聚集。推测蛋白带2a包含正确的二硫桥，而蛋白带3是不正确的。使放射标记的肽化学交联于重组HLA-A*0201重链还发现此蛋白带2a为肽受体(资料未被显示出)。
包裹在包涵体内的蛋白质快速迁移似乎是普遍现象。在非还原性SDS-PAGE分析中我们已观察到多种不同蛋白质的较快速的迁移，如人b2m、CD3复合物蛋白质γ-和ε-链的功能区、H2-Kk、MHC II类的α-和β-链。在非还原性条件下重组H-2Db分子以比较高的速度迁移(资料未被显示出)。与HLA-A*0201重链相比较，非还原的H-2Db重链像在还原性SDS-PAGE分析中较缓慢迁移的一条单独的快速迁移带一样迁移(资料未被显示出)。放射标记的肽对部分纯化的变性重组HLA-A*201重链的结合对通过阳离子交换层析分级分离的重组重链测定了它们结合在通过稀释法(见材料和方法)折叠过程中加入的放射标记特异性肽的能力。如图4中显示的，在重组HLA-A*0201重链单体的单体存在(带2a和带3)与肽结合能力之间存在良好的相关性。在即使存在GSH/GSSG时进行生物化学纯化之后，从具有还原剂(大于0.1mM DTT)的尿素制备物中得到的纯化重链不与肽结合。因此，肽结合的能力与具有预先形成的二硫桥的重链有关。
重组HLA-A*0201和重组H-2Db重链都可结合特异性放射配体，这种放射配体可被特异性肽抑制，但不能被非-结合性肽抑制。复合物中具有放射标记肽的重组HLA-A*0201可用抗HLA-A*0201的特异性抗体使之沉淀，但是用抗H2-Kk和H-2Db分子的抗体不能使之沉淀，表明产生了正确的HLA-A*0201(图5)。放射标记的肽对高度纯化的变性重组HLA-A2*201重链的结合使用放射标记的肽和放射标记的b2m评价了从具有预先形成的二硫桥的变性状态重链功能性MHC I类的产生。通过用8M尿素变性功能性重组HLA-A*0201获得了与蛋白带2a相对应的完全纯化的HLA-A*0201重链。在含有8M尿素的20mM tris pH8缓冲液中通过大小排阻层析(葡聚糖凝胶G50)对此变性的蛋白质作分级分离，重链被收集在空隙体积中。
通过在上面所述的折叠缓冲液中稀释进行放射标记配体(肽或b2m)的结合。剂量响应曲线(图6)显示在折叠过程中放射标记的肽对变性重链非常有效和灵敏的结合。相比之下常规亲和性纯化的MHC I类分子为了结合相似量的肽需要10-50倍的较高浓度。
以抑制试验和Scatchard分析对肽结合的高效率进行了分析。如图7所示，重组HLA-A*0201只与特异性肽相互作用。Scatchard分析(图7插入框)显示出完全直线的Scatchard作图，亲和平衡常数是大约30nM。重要的是，活性受体的百分率大约是输入蛋白质的80-90％。因此，此HLA-A*201重链是完全活性的，没有被来自细菌或由任何后续操作步骤产生的肽预先占据。相比之下，常规亲和性纯化的MHC I类制备物被具有通常是2％的有限数量活性受体的肽预先占据了。
肽结合是非常地取决于b2m。如图8所示，对结合反应加入逐渐增加剂量的b2m可促进放射标记肽的结合。不存在b2m时完全阻止了肽对重链的结合。也有相反的反应，即b2m对重链的结合也显示出对特异性肽存在的某些依赖性(图9)。因为b2m在没有肽时确实与重链结合了，虽然是以较低的亲和性，所以肽不是绝对的需要。
在动力学研究中进一步分析了肽对b2m相互作用的影响。在有或没有特异性肽存在时分析了由放射标记b2m和重链组成的HLA-A*201复合物的离解速度。异二聚体复合物即在没有特异性肽存在时形成和保持的复合物37℃以大约4小时的半寿期迅速地离解。三聚体肽-b2m-重链复合物即在有肽存在时形成或保持的复合物比较稳定，半寿期大约是14小时。因此肽可稳定b2m的结合。我们的结论是，通过变性重链和b2m之间的初级相互作用可形成HLA-A*201复合物。此相互作用可产生异二聚体，它表现出高亲合性的肽结合位点。肽本身又可增加被结合b2m分子的亲和性，导致形成稳定的功能性HLA-A*201复合物。功能性HLA-A*0201的产生收集具有高度肽结合能力的组分(大约15ml相当于含有单体重链组分的60-70％)并合并在一起用于产生(折叠)功能性HLA-A*0201分子。在上述的折叠缓冲液中稀释重组HLLA-A*0201重链。将1ml500μg部分纯化的重链(相当于大约13ml细菌培养物)加到99ml缓冲液中，并立即用具有大约10kD阻隔孔径的Amicon滤器浓缩。将5-10ml浓缩液(在1小时内获得的)在4℃保温1小时，然后以15000g离心除去聚集物。收集上清液并用具有大约3kD阻隔孔径的Centricon装置进一步浓缩至大约150-200μl。再一次离心之后应用滞留游离b2m和肽的大小排阻层析(G50)纯化此折叠的HLA-A*0201。将含有所集中的HLA-A*0201的组分合并在一起并用Centricon装置浓缩至最后的浓度大约1mg/ml。从加入的变性蛋白质的量计算，折叠效率大约是40-50％。通过整个过程功能性HLA-A*0201的产率相当于大约10mg功能性HLA-A*0201/L细菌培养物。整个折叠和纯化过程可在24小时内完成。注意折叠过程中未加入常规的作用剂如L-精氨酸和GSH/GSSG。前者抑制具有预先形成二硫桥的变性HLA-A*0201重链的折叠。后者不影响此结果。已在SDS-PAGE中常规地测定了此折叠的重组HLA-A*0201分子(图3)，并用特异性抗体测定了其反应性(图5)。最近将使用生物素化的b2m通过此程序产生的重线H-2Db复合物用链亲合素进一步装配成了寡聚体复合物。此寡聚体化的(“四聚体”)H-2Db复合物已被用于特异性T细胞的FACS染色(图11)，以及用于当通过共焦显微镜检测时染色T细胞。后者证明了其特异性的结合和内在化作用。
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第12届国际组织相容性专题讨论会的细胞系名单数据库(“HLAHLA的基因多样性，功能和医学意义”。Dominique Charron编辑，EDK出版，1997)。
权利要求
1.一种产生功能性免疫球蛋白超家族蛋白的方法，此蛋白质在有功能时具有至少一个二硫键，此方法包括如下步骤(ⅰ)提供一种包含编码此蛋白质基因的细菌细胞，此基因在该细胞中可表达，(ⅱ)在使此基因表达的条件下培养此细胞，(ⅲ)从该细胞中分离出此蛋白质而不还原它，(ⅳ)使分离出的蛋白质经受折叠处理。
2.一种产生多种功能性蛋白质的方法，其中包括至少一种是来自免疫球蛋白超家族的蛋白，并且此多种功能性蛋白质在有功能时具有至少一个分子间和/或一个分子内的二硫键，此方法包括如下步骤(ⅰ)提供一种细菌细胞，此细胞包含各编码一种蛋白的多种基因，所有的基因都可在该细胞中表达，(ⅱ)在使这些基因表达的条件下培养此细胞，(ⅲ)从该细胞中分离出这些蛋白质而不还原它们，(ⅳ)使分离出的蛋白质经受折叠处理。
3.一种产生功能性免疫球蛋白超家族蛋白的方法，此蛋白质在有功能时具有至少一个二硫键，此方法包括如下步骤(ⅰ)提供一种包含编码该蛋白质基因的细胞，此基因在该细胞中可表达，此蛋白质是作为一个聚集体被表达，(ⅱ)在使该基因表达的条件下培养这种细胞，(ⅲ)从细胞中分离出此蛋白质聚集体而不还原它，(ⅳ)使分离出的蛋白质经受折叠处理。
4.根据权利要求1-3中任何之一的方法，其中按照本方法产生的功能性蛋白质的产率，相对于在基本类似的条件下但其中是在还原条件下实施步骤(ⅲ)所得到的功能性蛋白质的产率增加至少10％，例如至少20％、至少40％、至少50％、至少70％、或至少100％。
5.根据权利要求1-4中任何之一的方法，其中当在非还原条件下实施步骤(ⅲ)时，本方法的速度与在还原条件下实施步骤(ⅲ)时相比较至少快10％。
6.根据权利要求1-5中任何之一的方法，其中按照本方法产生的功能性蛋白质的纯度，相对于在基本上类似的条件下但其中是在还原条件下实施步骤(ⅲ)所得到的功能性蛋白质的纯度增加至少10％。
7.根据权利要求1-6中任何之一的方法，其中的蛋白质是选自如下种类的免疫球蛋白超家庭蛋白抗体、免疫球蛋白可变(V)区、免疫球蛋白恒定(C)区、免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链、CD1、CD2、CD3、I类和II类组织相容性分子、β2微球蛋白(β2m)、淋巴细胞功能相关的抗原-3(LFA-3)和FcγRIII、CD7、CD8、Thy-1和Tp44(CD28)，T细胞受体、CD4、多免疫球蛋白受体、神经细胞粘附分子(NCAM)、髓鞘相关糖蛋白(MAG)、髓鞘P蛋白、癌胚抗原(CEA)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、集落刺激因子-1受体、αβ-糖蛋白、ICAM(细胞间粘附分子)、血小板以及白介素。
8.根据权利要求1-7中任何之一的方法，其中的免疫球蛋白超家庭蛋白是例如脊椎动物蛋白质，如人、鼠、大鼠、猪、牛或鸟类的蛋白质。
9.根据权利要求1-8中任何之一的方法，其中的免疫球蛋白超家庭蛋白是MHC。
10.根据权利要求9的方法，其中的HHC蛋白是人MHC。
11.根据权利要求9或10的方法，其中的MHC蛋白是选自重链、与β2m结合的重链、和功能性成熟MHCI类蛋白的MHCI类蛋白；或者是选自α/β二聚体和带有肽的α/β二聚体的MHCII类蛋白。
12.根据权利要求9-11中任何之一的方法，其中是作为无肽的MHC蛋白得到所产生的MHC蛋白。
13.根据权利要求7-12中任何之一的方法，其中当折叠过程结束时可得到至少25％所产生的免疫球蛋白超家庭蛋白是有功能形式的。
14.根据权利要求1-13中任何之一的方法，其中步骤(ⅱ)的蛋白质是作为包涵体产生。
15.根据权利要求1-14中任何之一的方法，其中是在不改变氧化还原状态的非还原条件下实施步骤(ⅲ)。
16.根据权利要求1-15中任何之一的方法，其中该方法进一步包括在步骤(ⅳ)之前使从步骤(ⅲ)分离的蛋白质经受纯化的步骤。
17.根据权利要求1-16中任何之一的方法，其中是在水基质和至少一种缓冲化合物中实施折叠处理(ⅳ)。
18.根据权利要求1-17中任何之一的方法，其中是在基本上不存在还原剂如DTT的情况下实施折叠处理。
19.根据权利要求1-18中任何之一的方法，其中所表达的蛋白质是处于细胞内。
20.根据权利要求1-19中任何之一的方法，其中所表达的蛋白质是处于细胞周质中。
21.根据权利要求1-20中任何之一的方法，其中所表达的蛋白质被转移至细胞外。
22.根据权利要求1-21中任何之一的方法，其中是以糖基化的形式表达该蛋白质。
23.根据权利要求1-22中任何之一的方法，其中是以磷酸化的形式表达该蛋白质。
24.根据权利要求1-23中任何之一的方法，其中是在体外使该蛋白质糖基化或磷酸化。
25.根据权利要求1-24中任何之一的方法，其中该蛋白质不包含未配对的半胱氨酸残基。
26.根据权利要求1-25中任何之一的方法，其中该蛋白质包含1个未配的半胱氨酸残基。
27.根据权利要求1-26中任何之一的方法，其中该蛋白质包含至少2个、例如至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、或至少20个半胱氨酸残基。
28.根据权利要求1-27中任何之一的方法，其中该蛋白质包含偶数的半胱氨酸残基。
29.根据权利要求1-28中任何之一的方法，其中该蛋白质具有至多20个、例如至多14个、至多10个、至多8个、至多5个、至多4个、至多3个或至多2个半胱氨酸残基。
30.根据权利要求1-29中任何之一的方法，其中该蛋白质能够具有至少1个、例如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个二硫键。
31.根据权利要求1-30中任何之一的方法，其中该蛋白质能够具有至多20个、例如至多15个、至多10个、至多8个、至多5个、至多4个、至多3个或至多2个二硫键。
32.根据权利要求3-31中任何之一的方法，其中的细胞是选自细菌细胞、真菌细胞、酵母菌细胞、动物细胞和植物细胞。
33.根据权利要求1-32中任何之一的方法，其中的细胞是选自革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细菌细胞。
34.根据权利要求33的方法，其中的革兰氏阴性菌是大肠杆菌，包括BL21侏或它的衍生株或者XA90株或它的衍生株。
35.根据权利要求1-34中任何之一的方法，其中的细胞经遗传修饰，与未经修饰和同株细胞相比它具有较弱的细胞内还原环境。
36.根据权利要求1-35中任何之一的方法，其中的细胞已被修饰具有降低的或者缺乏硫氧还蛋白还原酶或对细胞质硫氢基还原潜力具有相似作用酶的活性。
37.根据权利要求1-36中任何之一的方法，其中该修饰的细胞是trxB突变株。
38.根据权利要求1-37中任何之一的方法，其中的基因是天然存在基因的衍生物。
39.根据权利要求38的方法，其中通过取代至少一个密码子可获得该衍生物，此密码子与原来存在的编码相同氨基酸的密码子相比较更经常地被宿主细胞利用。
40.根据权利要求1-39中任何之一的方法，其中该基因是在天然状态不与此基因结合的调节性DNA序列的控制之下。
41.根据权利要求1-40中任何之一的方法，其中是以选自pET载体例如T7启动子的表达载体转化该细胞细胞。
42.一种稳定的无肽MHC蛋白，可通过权利要求1-41中任何之一的方法获得。
43.一种包含MHCI类重链和β2m的试剂盒，它能够使其接受者产生和测定或检测出功能性MHCI类蛋白，对此蛋白可以加入能够结合于该MHC I类蛋白而导致形成此功能性MHC I类蛋白的肽。
44.根据权利要求43的试剂盒，它包括对一种或几种MHC I类亚单位(重链、b2m和/或肽)的标记，以便测定或检测MHC I类蛋白的产生。
45.根据权利要求43和44的试剂盒，其中对所产生MHC I类蛋白的测定或检测系统可选自如下技术放射-配体、免疫沉淀、ELLSA、胞质团共振、荧光极化、分析超离心、生物化学沉淀、超过滤、层析和平衡透析技术。
46.根据权利要求43-45的试剂盒，它包含低聚合的MHC蛋白，例如2个、3个、4个或更多MHC蛋白的低聚合物。
47.根据权利要求43-46的试剂盒，其中加入了作为标记物的一种试剂，使此试剂盒适合于诊断的目的。
48.根据权利要求44-47的试剂盒，其中的标记物可选自生物素、荧光染料、酶、化学发光和放射活性的标记物。
49.根据权利要求1-41中任何之一的方法用于生产MHC的用途。
50.根据权利要求42的稳定空MHC蛋白用于分析MHC中改变一个氨基酸对该MHC结合特异性的影响的用途，这种影响通过应用肽文库法分析测定，合成的文库或者是重组的文库均可。
全文摘要
本发明涉及一种产生功能性免疫球蛋白超家族蛋白的方法,此蛋白质在有功能时具有至少一个二硫键,此方法包括如下步骤:提供一种包含编码此蛋白质的基因且此基因可在其中表达的细菌细胞;在使此基因表达的条件下培养此细胞;从该细胞中分离出此蛋白质而不还原它;以及使分离出的蛋白质经受折叠处理。优选地,此免疫球蛋白超家族蛋白是选自如下种类的蛋白质:抗体、免疫球蛋白可变(Ⅴ)区、免疫球蛋白恒定(C)区、免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链、CD1、CD2、CD3、Ⅰ类和Ⅱ类组织相容性分子、β
文档编号A61P37/02GK1326466SQ99813211
公开日2001年12月12日 申请日期1999年9月14日 优先权日1998年9月14日
发明者拉斯·奥斯特加德·佩德森, 索仁·布斯 申请人:拉斯·奥斯特加德·佩德森, 索仁·布斯