一种蜂花粉提取物及其制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蜂花粉提取物的制备方法，，具体地说先提取蜂花粉的黄酮类化合物、 再用提取残渣制备蜂花粉中的生物活性肽，再将黄酮类化合和活性肽混合制备成为蜂花粉 提取物，所制备的蜂花粉提取物同时兼备活性肽和黄酮类化合物的活性。本发明属于生物 化工、制药、食品等技术领域。
【背景技术】
[0002] 蜂花粉是蜂蜜采集有花植物的花粉粒，在采集过程中加上蜂蜜自身的腺上分泌 物、唾液和花蜜而形成。蜂花粉是蜂群生长和繁衍的主要营养来源之一，具有很高的营养价 值。蜂花粉包含蛋白质、碳水化合物、黄酮类化合物、微量元素、酶等多种营养成分，因此蜂 花粉素来就有"天然微型营养库"等美誉。关于蜂花粉的生物活性研究表明，蜂花粉具有改 善心血管疾病、增强免疫力、降血糖、抗氧化、抗衰老、抑制前列腺疾病等功效。
[0003] 文献1 (中国专利CN200810007853. 2)公开用不同有机溶剂提取油菜蜂花粉的有 效部位，有效部位在预防酒精性肝损伤的新用途。文献2(中国专利200610052876.6)公 开了用酒精提取破壁蜂花粉活性组分，该活性组分具有降血脂的功能。文献3 (中国专利 200810134816. 8)公开了提取蜂花粉蛋白质并用酶解法制备肽，蜂花粉肽具有血管紧张素 转移酶抑制。文献4 (中国专利201010295791. 7)公开了从油菜蜂花粉中得到了一种具有 抗炎、镇痛、抑菌活性的提取物的方法。文献5 (中国专利201010169477. 4)公开了一种从 蜂花粉中提取油脂类化合物的方法。文献6 (中国专利201110364321. 6)公开了一种从蜂 花粉中提取辅酶QlO的方法。文献7 (中国专利200410073514. 6)公开了从油菜花粉中制 备具有治疗前列腺肿瘤的有效部位的方法。尽管目前关于蜂花粉活性组分提取的方法已有 很多，但是现有方法都是以蜂花粉中某种单一物质为目标产物。虽然提取得到的组分具有 较好的活性，但是却在提取过程中损失了蜂花粉中其他的活性成分，使蜂花粉仅仅成为某 种成分的原料，而无法体现蜂花粉"全能营养库"的特点。未经加工的蜂花粉作为功能性食 品或者药物时使用时要达到理想的功效所需剂量较大。
【发明内容】
[0004] 目前蜂花粉存在原药直接使用所需剂量大、提取物活性成分单一无法体现蜂花粉 全效的问题，至今为止还未见有关蜂花粉保留全效的制备方法。本发明人经过研究发现蜂 花粉中的主要生物活性成分为黄酮类化合物以及肽类化合物，提出一种全新的蜂花粉提取 物制备方法，该技术浓缩黄酮类化合物、精制蜂花粉肽化合物，利用该技术制备的蜂花粉提 取物最大程度地保留了蜂花粉的生物活性，同时又大大降低了蜂花粉的有效剂量。
[0005] 本发明的目的是提供一种蜂花粉提取物的制备方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0007] 选用干燥的蜂花粉，首先用溶剂提取花粉中的黄酮类化合物，再将提取剩余的残 渣用蛋白水解酶酶解制备蜂花粉活性肽，然后将黄酮类化合物和活性肽合并，成为蜂花粉 提取物。
[0008] 蜂花粉提取物按照以下方法制备：干燥的蜂花粉按照原料：溶剂=Ikg: 5?50L的 比例加入溶剂，20-70°C提取1?10小时，提取结束后过滤或离心将提取液与固形物分离分 别进行处理：
[0009] (1)提取液的处理方法：提取液经真空浓缩，浓缩样品用体积浓度40-70%乙醇溶 解后上大孔树脂柱,先用2?10倍柱体积的去离子水淋洗，然后再用体积浓度40?90%乙 醇洗柱子并收集流分，将含乙醇洗脱剂洗脱的流分真空浓缩得到组分1。
[0010] (2)固形物处理方法：按照原料：溶液=Ikg :2?IOL的比例加入水或者缓冲液混 合，pH调整混合液在范围2?10,再加入原料质量的0. 001?3%的蛋白水解酶，于20? 60°C酶解1?48小时；酶解结束后将反应体系温度升至80-100°C保持10-60分钟，使酶失 活，然后离心或过滤，收集滤液浓缩干燥得到组分2。
[0011] 将组分1与组分2再次混合，得到蜂花粉提取物。
[0012] 本发明干燥花粉提取所用的溶剂为：水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲 烷、环己烷、正己烷、石油醚中的一种或二种以上的溶剂混合物
[0013] 本发明固形物酶解中所用的蛋白水解酶为：蛋白水解酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、风 味蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶或中性蛋白酶中的一种或二种以上。
[0014] 本发明所述缓冲液为：磷酸缓冲液、TriS-HCI缓冲液、醋酸缓冲液、去离子水中的 一种。
[0015] 含有本发明的提取物的药物、功能食品、食品可制备成任何形式，例如口服剂型： 粉剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、水性药物、糖浆剂、酊剂、丸剂、散剂、小包、颗粒剂；局部制 齐IJ:乳膏、软膏、乳液。凝胶。半固体膏、贴剂糊膏。喷雾剂。气雾剂等；注射剂：溶液、悬剂、 乳剂。
[0016] 本发明的特点如下：
[0017] 1.本发明的技术工艺设计巧妙：首先提取蜂花粉中的黄酮类化合物，既浓缩了黄 酮类化合物又不影响后续工艺中生物活性肽的制备；生物肽制备的过程又是其浓缩的过 程，工艺最后又将这种活性组分按原药的比例组合，不仅最大程度地保留了蜂花粉的生物 活性，而且减少了使用的有效剂量。
[0018] 2.工艺简单，效率高。本发明的提取过程中蜂花粉不需要破壁等特殊处理，生物活 性肽制备过程中不需要单独提取蛋白质，因此制备工艺简、效率高，易于实现产业化；提取 过程所使用溶剂易回收，有机溶剂残留可控，具有绿色环保的特点。
[0019] 3.具有良好的应用前景。蜂花粉的疗效有悠久的历史，但是由于通常所需剂量较 大、疗效不显著，因此在市场推广中受到限制。现有的蜂花粉活性成分提取技术都仅仅是单 一组分的提取，无法体现蜂花粉原有多功效的特点。本发明的技术工艺克服了不仅现有技 术存在的缺陷而且，因此通过浓缩活性组分从而达到提高活性的目的，因此将在食品、保健 品、药品、化妆品等领域有良好的应用前景。
【具体实施方式】
[0020] 实施例1
[0021] 一、蜂花粉提取物制备方法
[0022] 以油菜花粉为原料，按照以下工艺制备蜂花粉提取物：
[0023] 取干燥的蜂花粉1000克，加入体积浓度70%乙醇5L，20°C提取10小时，提取结束 后过滤将提取液与固形物分离分别进行处理：
[0024] (1)提取液的处理方法：提取液经真空浓缩干燥，浓缩样品用体积浓度70%乙醇溶 解后上大孔树脂柱，先用5倍柱体积的去离子水淋洗，然后再用体积浓度70%乙醇洗柱子并 收集流分，将70%乙醇所洗的组分真空浓缩干燥得到组分1。
[0025] (2)固形物处理方法：固形物按照原料：溶液=Ikg: IOL的比例加入水，pH调整混 合液在范围2,再加入原料质量的0. 2%的胃蛋白酶，于40°C酶解48小时；酶解结束后将反 应体系温度升至90°C保持20分钟，使酶失活，然后离心或过滤，收集滤液浓缩干燥得到组 分2。
[0026] 将组分1与组分2再次混合，得到油菜蜂花粉提取物。
[0027] 二、蜂花粉提取物成分及活性测定方法
[0028] 1，油菜蜂花粉提取物的主要成分测定方法：
[0029] (1)蛋白质含量测定：凯氏定氮法；
[0030] (2)多糖含量测定：硫酸-苯酚法；
[0031] (3)黄酮类化合物含量测定：硝酸铝比色法；
[0032] (4)酌·酸测定：Foiln-ciocalteu 法。
[0033] 2,油菜蜂花粉提取物的生物活性测定方法：
[0034] (I) ACE抑制活性测定方法：
[0035] ACE在37°C、PH8. 3的条件下催化分解血管紧张素 I的模拟底物Hippuryl-L-His tidyl-L-Leucine (HHL)产生马尿酸，该物质在228nm处有特征紫外吸收峰。当加入ACE抑 制物时，ACE对HHL的催化作用受到抑制，马尿酸的生成量会减少。通过测定加入抑制剂前 后的马尿酸紫外吸收值可以计算出抑制活性的大小。
[0036] 反应体系
[0037] 缓冲液为 0· 05M，PH8. 3 硼酸盐缓冲液；底物为 Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine (HHL)，MW429. 47,用上述缓冲液配成 5mM ;ACE (angiotensin-converting enzyme)用上述 缓冲液配成〇. lU/ml。
[0038] ODA (对照组，为不存在抑制剂但存在酶时的吸光值）：50 μ 1缓冲液 +50ulHHL+50y 1缓冲液于37°C水浴5min，然后加入50μ I ACE，37°C水浴30min，加入 200μ 1、1M的HCl终止反应，再加入Iml乙酸乙酯萃取产物马尿酸，振荡15S，3500r/min离 心5min，取0. 8ml上清，90°C水浴干燥15min，重溶于0. 8ml蒸馏水中，228nm处检测吸光值 为 0DA。
[0039] ODB (样品组，为存在抑制剂和酶时的吸光值）：50 μ 1蜂花粉提取液 +50 μ 1HHL+50 μ 1缓冲液于37 °C水浴5min，然后加入50 μ 1ACE，37 °C水浴30min，加入 200μ 1、1M的HCl终止反应，再加入Iml乙酸乙酯萃取产物马尿酸，振荡15S，3500r/min离 心5min，取0. 8ml上清，90°C水浴干燥15min，重溶于0. 8ml蒸馏水中，228nm处检测吸光值 为 0DB。
[0040] ODC (空白组，为不存在抑制剂和酶时的