一种带软骨的胶原移植材料及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种移植材料及其制备方法，具体涉及一种带软骨的胶原移植材料及其制备方法。
【背景技术】
[0002]在骨肿瘤、人工关节置换或成形术中，尚无合适的移植材料，因此临床上对该种类疾病并无理想的治疗方案。合适的移植材料需同时满足两部分要求:骨支架及活性软骨组织。自体骨移植因来源有限并具有破坏性，难以广泛使用；异体骨同时为抗原，移植后引起体内免疫反应，虽经各种方法处理，如射线照射、冻干保存、深低温及术后应用免抑制剂等，可在一定程度上减轻排斥反应，但随着时间的延长，移植关节均出现退行性变，甚至关节结构完全破坏而失去功能。
[0003]软骨组织损伤后极难自行修复，组织工程软骨移植是目前治疗软骨缺损的全新技术，但仍存在需要解决修复组织与正常软骨边界的整合、形成由软骨细胞与支架材料复合生成的新生软骨组织并具备功能、以及对机械承重的耐受能力等问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种带软骨的胶原移植材料及其制备方法，该移植材料以骨胶原构成其支架且带有活性软骨组织，既可促进新生软骨形成又利于骨组织生成。
[0005]为实现上述目的，本发明采取的技术方案为:一种带软骨的胶原移植材料的制备方法，包括以下步骤:
[0006](I)取骨关节，用组织包埋介质封闭骨关节的关节软骨；
[0007](2)将经步骤(I)处理的骨关节置于质量百分比浓度为8?12%的甲酸中，于4?8°C浸泡3?4天，冲洗浸泡后的骨关节；
[0008](3)去除组织包埋介质，清洗关节软骨，得到带软骨的胶原移植材料。
[0009]本发明带软骨的胶原移植材料的制备均在无菌条件下进行，制备过程中，步骤(I)仅用组织包埋介质封闭骨关节的关节软骨，以保护软骨组织，使其保持活性；骨关节的骨头部分外露不予保护。本发明步骤(2)中将骨关节置于甲酸中，需使骨质完全软化；冲洗浸泡后的骨关节主要是为了去除甲酸以及软化后骨关节骨髓腔中的杂质，降低移植材料的抗原性，消除免疫反应。本发明步骤(3)中，去除组织包埋介质的方法为:轻轻剥离保护软骨的封闭介质。
[0010]按照本发明上述方法制备得到的带软骨的胶原移植材料，其骨质只保留胶原成分，并暴露出凹凸不平的天然孔隙结构，有利于移植后骨髓基质细胞的迀入与各种促生长因子的渗透，故利于骨组织生成。同时，所述带软骨的胶原移植材料还带有活性软骨组织，可促进新生软骨形成。
[0011]作为本发明所述带软骨的胶原移植材料的制备方法的优选实施方式，所述骨关节为兔桡骨近端骨关节。作为本发明所述带软骨的胶原移植材料的制备方法的更优选实施方式，所述兔桡骨近端骨关节的长度为1.8?2.2厘米。
[0012]作为本发明所述带软骨的胶原移植材料的制备方法的优选实施方式，所述组织包埋介质(Tissue Embedding Medium)含有石錯成分(美国McCormick公司产品)。
[0013]作为本发明所述带软骨的胶原移植材料的制备方法的优选实施方式，所述步骤
(1)中，用组织包埋介质封闭骨关节的关节软骨的方法为:加热组织包埋介质至其熔化，将骨关节的带软骨一端浸入组织包埋介质中后迅速取出，自然冷却凝固关节软骨表面的组织包埋介质以封闭关节软骨。
[0014]作为本发明所述带软骨的胶原移植材料的制备方法的优选实施方式，所述步骤
(2)中冲洗浸泡后的骨关节和所述步骤(3)中清洗关节软骨所使用的溶液为磷酸盐缓冲溶液或生理盐水。更优选地，所述磷酸盐缓冲溶液的PH值为7.4。
[0015]本发明还提供了一种带软骨的胶原移植材料，该移植材料以骨胶原构成其支架，且带有活性软骨组织。
[0016]本发明的有益效果为:本发明方法制备得到的带软骨的胶原移植材料，其包含构成移植材料支架的骨胶原成分，该骨胶原支架具有凹凸不平的天然孔隙结构，有利于移植后骨髓基质细胞的迀入与各种促生长因子的渗透，从而利于骨组织生成；同时，该移植材料还带有活性软骨组织，可促进新生软骨形成。
【附图说明】
[0017]图1a为本发明所述带软骨的胶原移植材料的结构外观图；
[0018]图1b为本发明所述带软骨的胶原移植材料中软骨组织的扫描电镜图；
[0019]图1c为本发明所述带软骨的胶原移植材料中骨胶原支架的扫描电镜图；
[0020]图2a为本发明所述带软骨的胶原移植材料中骨胶原支架的激光扫描共聚焦显微镜立体扫描图；
[0021]图2b为本发明所述带软骨的胶原移植材料中软骨组织的激光扫描共聚焦显微镜立体扫描图；
[0022]图3a为正常兔桡骨关节的X线影像结果图；
[0023]图3b为本发明实施例5所述实验组新西兰大白兔植入带软骨的胶原移植材料16周后的X线影像结果图；
[0024]图3c为本发明实施例5中，术后第16周所述对照组新西兰大白兔的X线影像结果图；
[0025]图4a为本发明实施例5中，术后第16周观察植入带软骨的胶原移植材料的新西兰大白兔骨关节缺损处组织生长情况的大体图；
[0026]图4b为本发明实施例5中，术后第16周，观察对照组新西兰大白兔骨关节缺损处组织生长情况的大体图；
[0027]图5a为正常兔烧骨关节Safranin O染色分析的结果图；
[0028]图5b为本发明实施例5中，术后第16周，植入带软骨的胶原移植材料的新西兰大白兔骨关节Safranin O染色分析的结果图；
[0029]图5c为本发明实施例5中，术后第16周，对照组新西兰大白兔骨关节Safranin O染色分析的结果图。
【具体实施方式】
[0030]为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
[0031]下述实施例中，成年兔桡骨近端骨关节的制备方法为:(I)实验动物:从广东省医用实验动物中心购得体重为2.5-3kg的普通级新西兰大白兔；(2)动物麻醉:按照每千克大白兔予以0.5mL戊巴比妥钠麻醉剂的比例予以新西兰大白兔浓度为3%的戊巴比妥钠进行静脉注射麻醉(该戊巴比妥钠麻醉剂用生理盐水配制)，另予以0.5mL速眠新注射液肌注辅助麻醉；(3)骨关节取材:选择前臂外侧纵切口，从肘关节延伸至前臂中段，长约3-4cm，逐层切开皮肤、皮下组织、浅筋膜，将肘关节关节囊桡侧纵切0.5cm左右，暴露桡骨近端约2cm，将桡骨近端1.8?2.2cm锯下，取出骨关节；(4)将取出的桡骨近端骨关节上附着的骨膜、肌肉及肌腱等软组织清理干净，得到成年兔桡骨近端骨关节。
[0032]实施例中，制备带软骨的胶原移植材料时，骨关节置于质量百分比浓度为8?12%的甲酸中3?4天，以致骨质完全软化；并且，下述带软骨的胶原移植材料的制备过程均在无菌条件下进行，制得的带软骨的胶原移植材料贮存于4°C冰箱中备用。
[0033]实施例中，所述组织包埋介质(Tissue Embedding Medium)含有石錯成分(美国McCormick公司产品)，其商品名为PARAPLAST。
[0034]实施例1
[0035]本发明带软骨的胶原移植材料及其制备方法的一种实施例，本实施例所述带软骨的胶原移植材料采用下述方法制备而成:
[0036](I)取1.8?2.2厘米长的成年兔桡骨近端骨关节，用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液将其清洗干净；然后，加热组织包埋介质至熔化(加热温度为56°C左右)，将成年兔桡骨近端骨关节的关节软骨快速浸入组织包埋介质中后立即取出，自然冷却凝固关节软骨表面的组织包埋介质以封闭关节软骨；
[0037](2)将经步骤(I)处理的骨关节置于质量百分比浓度为8?12%的甲酸中，于4?8°C浸泡3?4天直至骨质完全软化，用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗浸泡后的骨关
-K-
T ；
[0038](3)轻轻剥离封闭关节软骨的组织包埋介质，用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液充分清洗，得到带软骨的胶原移植材料。
[0039]实施例2
[0040]本发明带软骨的胶原移植材料及其制备方法的一种实施例，本实施例所述带软骨的胶原移植材料采用下述方法制备而成:
[0041](I)取1.8?2.2厘米长的成年兔桡骨近端骨关节，用生理盐水将其清洗干净；然后，加热组织包埋介质至熔化(加热温度为56°C左右)，将成年兔桡骨近端骨关节的关节软骨快速浸入组织包埋介质中后立即取出，自然冷却凝固关节软骨表面的组织包埋介质以封闭关节软骨；
[0042](2)将经步骤(I)处理的骨关节置于质量百分比浓度为8?12%的甲酸中，于4?8°C浸泡3?4天直至骨质完全软化，用生理盐水冲洗浸泡后的骨关节；
[0043](3)轻轻剥离封闭关节软骨的组织包埋介质(即去除组织包埋介质)，用PBS清洗关节软骨，得到带软骨的胶原移植材料。
[0044]实施例3
[0045]为了考察本发明带软骨的胶原移植材料的结构，我们将制得的带软骨的胶原移植材料表面进行喷铂金处理，然后置于扫描电子显微镜下观察其软骨组织和骨胶原支架的表面结构。本发明带软骨的胶原移植材料的结构外观如图1a所示(图1a中的方框内所示为需要封闭保护的关节软骨部分)，其软骨组织的超微结构见图lb，其骨胶原支架的超微结构见图lc。
[0046]结果表明，本发明带软骨的胶原移植材料的骨胶原支架具有凹凸不平的天