然空隙(具体见图lc)。
[0047]实施例4
[0048]为了证明本发明带软骨的胶原移植材料软骨组织的活性，我们通过吖碇橙(Acridine Orange, AO)标记分析带软骨的胶原移植材料中的组织细胞DNA/RNA的表达。
[0049]测定时，先将移植材料纵切，加入0.01 %吖碇橙浸泡染色lOmin，再用PBS洗涤，然后于激光扫描共聚焦显微镜(Confocal Laser Scaning Microscope, CLSM) (Zeiss LSM510META system)下观察组织细胞形态标记情况。实验过程中，控制图像采集的参数各组为同一条件，通过单通道荧光检测骨胶原支架，图像采集所用激发波长为DNA 488nm、发射波长为DNA 520nm，在低倍镜下(X35)观察骨胶原材料孔径及大体结构；软骨组织通过双通道荧光检测，从而观察被保护的软骨组织细胞DNA/RNA的表达，图像采集所用激发波长分别为DNA 488nm、RNA 453nm，发射波长分别为DNA 520nm、RA 615nm。实验结果如图2a和图2b所示，其中，图2a为本发明带软骨的胶原移植材料中骨胶原支架的激光扫描共聚焦显微镜立体扫描图；图2b为本发明带软骨的胶原移植材料中软骨组织的激光扫描共聚焦显微镜立体扫描图。
[0050]由图2a可知，本发明带软骨的胶原移植材料的骨胶原材料具有正常骨小梁组织的孔径，表层关节软骨排列整齐(箭头所示)；由图2b可见，箭头所示受保护的表层关节软骨的软骨组织呈放射状排列，呈现特异性的DNA (绿色)/RNA (红色)标记，证实软骨层为具备活性的软骨组织(X70)。
[0051]实施例5
[0052]我们通过动物实验考察了本发明的带软骨的胶原移植材料在带关节的骨移植中的应用，考察的方法如下:
[0053](I)实验动物:从广东省医用实验动物中心购得体重为2.5-3kg的普通级新西兰大白兔；
[0054](2)动物麻醉:按照每千克大白兔予以0.5mL戊巴比妥钠麻醉剂的比例予以新西兰大白兔浓度为3%的戊巴比妥钠进行静脉注射麻醉(该戊巴比妥钠麻醉剂用生理盐水配制)，同时予以0.5mL速眠新注射液肌注辅助麻醉；
[0055](3)动物模型建立:选择前臂外侧纵切口，从肘关节延伸至前臂中段，长约3_4cm，逐层切开皮肤、皮下组织、浅筋膜，将肘关节关节囊桡侧纵切0.5cm左右，暴露桡骨近端约2cm，将烧骨近端1.8?2.2cm锯下，取出骨关节；
[0056](4)移植手术:将本发明的带软骨的胶原移植材料按其正常解剖关系植入新西兰大白兔骨关节缺损处，移植材料用近端预弯成环的1#克氏针作内固定，其弧度按正常桡骨弧度预弯，远端经骨髓腔至桡骨远端干骺端松质骨内；然后冲洗伤口，按其正常的解剖关系逐层缝合关节囊、深筋膜、皮下及皮肤，最后消毒包扎，肌注40万IU青霉素注射液，分笼饲养；经所述移植处理的新西兰大白兔为实验组，同时，我们将未经移植处理的新西兰大白兔作为对照组，对照组在缺损处不植入本发明的带软骨的胶原移植材料，不放置克氏针，其余处理方法与实验组相同。我们每隔两周采用X线观察实验组与对照组新西兰大白兔的骨关节，并于术后16周对其进行组织学分析，实验结果如下:
[0057](a) X 线观察
[0058]术后2周，实验组新西兰大白兔移植处未见显影，其周围见大片骨痂生长并连接宿主骨；术后第4周，其移植处显示出模糊骨影象，骨痂从远端向近端生长包裹移植骨；术后第8周，移植处明显新生骨生成，初具正常骨关节形态，截骨面与宿主骨接合处已融合；术后第12-16周，实验组新西兰大白兔移植处的新生骨关节通过塑形呈现基本正常形态骨关节形态，而对照组新西兰大白兔直到第16周仍未见新生骨生长。
[0059]术后第16周，X线观察实验组与对照组新西兰大白兔骨关节的结果如图3a?图3c所示(图中，NC为正常兔桡骨关节，DOAA为移植本发明带软骨的胶原移植材料后的新生骨关节；UG为不移植骨对照组)；其中，正常兔桡骨关节的X线影像结果见图3a ;实验组新西兰大白兔的X线影像结果见图3b，对照组新西兰大白兔的X线影像结果见图3c。
[0060]实验结果表明:术后第16周，植入本发明带软骨的胶原移植材料的实验组新西兰大白兔骨关节缺损处出现新生骨关节(见图3b，箭头所示)，通过塑形，呈现基本正常形态；对照组新西兰大白兔骨关节缺损处未见骨痂生长(见图3c，箭头所示)，桡骨断端变尖变硬，未见新生骨关节形成。
[0061](b)大体观察及组织学检测
[0062]大体观察及组织学检测的步骤如下:
[0063](I)标本处理:静脉注射25%苯巴比妥钠Iml过量麻醉动物行安乐死，标本采用10%中性福尔马林固定24h后，用10%甲酸脱钙I?2周；
[0064](2)纵切样本，大体观察骨关节缺损处组织生长情况；
[0065](3)组织包埋介质包埋按常规方法，切片5 μ m备用，作Safranin O特殊染色检测分析。
[0066]术后第16周，观察植入本发明带软骨的胶原移植材料的新西兰大白兔骨关节缺损处组织生长情况的大体图如图4a所示，观察对照组新西兰大白兔骨关节缺损处组织生长情况的大体图如图4b所示。图4a表明，实验组新西兰大白兔原植骨区已经长出新骨，并形成关节软骨层(新生关节软骨层如箭头所示)，类似正常关节结构；图4b表明，对照组新西兰大白兔原手术区域缺少骨及软骨组织生成。
[0067]术后，Safranin O染色分析的结果为:移植后早期(第2_4周)，实验组新西兰大白兔仅于骨小梁间出现少量不规则红染；术后8周，其部分关节软骨被较厚的新生软骨组织替代，新生软骨团块产生大量糖胺多糖，形成大小不等的团块状红染区域；术后12-16周，团块状红染区域增多，颜色加深，新生软骨组织继续爬行替代关节软骨，骨小梁继续被吸收塑形，新生骨关节基本形成。
[0068]术后第16周，组织学Safranin O染色分析的结果(X50)如图5a_图5c所示(图中，NC为正常兔桡骨关节，DOAA为移植本发明带软骨的胶原移植材料后的新生骨关节；UG为不移植骨对照组)，其中，正常兔桡骨关节Safranin O染色分析的结果见图5a ;植入本发明带软骨的胶原移植材料的新西兰大白兔骨关节Safranin O染色分析的结果见图5b ;对照组新西兰大白兔骨关节Safranin O染色分析的结果见图5c。图5a表明，正常兔桡骨关节，软骨层呈现浓重的红染现象，有大量糖胺多糖的分泌；软骨下骨为少量、散在和不规则红染的正常结构；图5b表明，植入本发明带软骨的胶原移植材料16周后，新西兰大白兔骨小梁中新生软骨细胞团块出现大量的红染现象，提示有大量糖胺多糖的分泌，新生软骨细胞具备正常生理功能，处于软骨形成与骨重塑阶段；图5c表明，未进行移植的对照组，骨缺损区内由大量纤肉芽组织不规则红染现象。
[0069]最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
【主权项】
1.一种带软骨的胶原移植材料的制备方法，其特征在于:所述方法包括以下步骤: (1)取骨关节，用组织包埋介质封闭骨关节的关节软骨； (2)将经步骤⑴处理的骨关节置于质量百分比浓度为8?12%的甲酸中，于4?8°C浸泡3?4天，冲洗浸泡后的骨关节； (3)去除组织包埋介质，清洗关节软骨，得到带软骨的胶原移植材料。
2.如权利要求1所述带软骨的胶原移植材料的制备方法，其特征在于:所述骨关节为兔桡骨近端骨关节。
3.如权利要求2所述带软骨的胶原移植材料的制备方法，其特征在于:所述兔桡骨近端骨关节的长度为1.8?2.2厘米。
4.如权利要求1所述带软骨的胶原移植材料的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中，用组织包埋介质封闭骨关节的关节软骨的方法为:加热组织包埋介质至其熔化，将骨关节的关节软骨浸入组织包埋介质中后取出，自然冷却凝固关节软骨表面的组织包埋介质以封闭关节软骨。
5.如权利要求1所述带软骨的胶原移植材料的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中冲洗浸泡后的骨关节和所述步骤(3)中清洗关节软骨所使用的溶液为磷酸盐缓冲溶液或生理盐水。
6.如权利要求5所述带软骨的胶原移植材料的制备方法，其特征在于:所述磷酸盐缓冲溶液的PH值为7.4。
7.一种采用如权利要求1?6任一项所述方法制备得到的带软骨的胶原移植材料。
【专利摘要】本发明公开了一种带软骨的胶原移植材料及其制备方法，属于生物医学领域。本发明带软骨的胶原移植材料的制备方法包括以下步骤：(1)取骨关节，用组织包埋介质封闭骨关节的关节软骨；(2)将经步骤(1)处理的骨关节置于质量百分比浓度为8～12％的甲酸中，于4～8℃浸泡3～4天，冲洗浸泡后的骨关节；(3)去除组织包埋介质，清洗关节软骨，得到带软骨的胶原移植材料。本发明制备的带软骨的胶原移植材料包含骨胶原构成的支架，并带有活性软骨组织，可促进新生软骨形成且利于骨组织生成。
【IPC分类】A61L27-50, A61L27-36
【公开号】CN104606715
【申请号】CN201510016524
【发明人】李斯明, 杨小红, 崔树良
【申请人】广州市红十字会医院
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月13日