超级因子和合成因子:具有新的和增强的信号传导活性的经改造细胞因子的制作方法
【专利说明】超级因子和合成因子：具有新的和増强的信号传导活性的 经改造细胞因子
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求在2013年5月21日提交的美国临时专利申请第61/825, 980号、在 2012年11月13日提交的美国临时专利申请第61/725, 791号，以及在2012年8月9日提 交的美国临时专利申请第61/681，490号的优先权，上述每一申请的公开内容出于所有目 的以引用方式整体并入本文。
[0003] 背景
[0004] 细胞因子是由许多细胞分泌的小的细胞信号传导分子并且是广泛用于细胞间通 信的一类信号传导分子。细胞因子调节关键的细胞功能，包括分化、增殖和凋亡/抗凋亡。
[0005] 许多细胞因子通过以下方式介导刺激作用：首先与相对高亲和力的细胞因子受体 链（通常标记为"α "）相互作用，之后与不同细胞因子共有共有的受体链（共有受体链） 相对低亲和力的相互作用。细胞因子与第一高亲和力受体的结合产生复合表面，所述共有 受体链可随后与该复合表面结合。
[0006] 白细胞介素-4(IL-4)为这种细胞因子之典型。IL-4的主结合链是IL-4受体 a (IL-4Ra)。IL-4/IL-4Ra复合物充当IL-4受体的第二组分yc的配体。另外，IL-4/ IL_4Ra复合物充当白细胞介素-13(IL_13)受体a l(IL_13Ra 1)的配体。与IL-4不同， IL-13不结合至IL_4Ra，但是IL-13/IL_13Ra 1复合物结合至IL_4Ra。
[0007] 因为IL-4和IL-13可以通过不同的受体进行信号传导，所以可以假设IL-4和 IL-13能够激活不同的信号转导通道。实际上，γ c激活酪氨酸激酶Janus激酶3 (JAK3)，而 IL-13Ra 1激活Tyk2和JAK2。被激活的JAK介导IL-4R对保守的酪氨酸残基的胞质尾区 磷酸化，所述保守的酪氨酸残基充当包含Src同源2(SH2)域的蛋白的停靠位点。三个紧密 成簇的酪氨酸残基充当信号转导和转录激活蛋白6 (STAT6)的停靠位点，所述STAT6是选择 性地偶联至IL-4Ra链的转录因子。IL-13与IL-13Ra 1的结合还通过IL-13/IL-13Ra 1 复合物与IL_4Ra的结合而激活STAT6。
[0008] 除了 STAT6, IL-4募集和激活IRS-2。结构-功能分析已经显示IL-4Ra的跨膜 结构域上的酪氨酸残基[Tyr497,胰岛素/IL-4R基序（I4R)的部分]是在IL-4Ra已经被 IL-4激活之后IRS-2停靠至IL-4Ra所必需的。JAKl和JAK3随后磷酸化结合IL-4Ra的 IRS-2。IRS-2的激活导致磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K)和下游蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶Akt 的激活，这种途径被认为介导许多细胞类型中的生长信号和存活信号。实际上，这种途径对 表达I型IL-4R的细胞（NK细胞、T细胞，以及B细胞）中的IL-4-介导的生长是重要的。
[0009] 虽然IL-4Ra是普遍存在的，但是γ。而非IL-13Ral存在于T细胞、自然杀伤 (NK)细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞以及大部分小鼠 B细胞上（大部分人B细胞表达γ。和 IL-13R a 1两者）。因此，IL-4而不是IL-13,促进天然T细胞分化成ΤΗ2细胞，并且IL-4显 得比IL-13对小鼠 IgE反应的诱导更加重要。
[0010] 一些骨髓源细胞，包括巨噬细胞和树突状细胞，表达γ。和IL-13Ra 1两者并且因 此对IL-4和IL-13两者应答。这两种受体亚基在这些细胞的不同亚群上的相对丰度差异 可以部分地负责其对IL-4相对于对IL-13的相对反应性。在大部分非骨髓源细胞（包括 平滑肌细胞和上皮细胞）上发现的是IL-13Ra 1，但很少或没有γ。亚基；因此，与IL-13相 比，IL-4在刺激这些细胞方面并没有固有的优势。
[0011] 在20世纪90年代早期，进行了使用IL-4治疗癌症的临床试验。已经观察到IL-4 诱导体外白血病淋巴母细胞的生长抑制和凋亡。这些观测已在使用移植到免疫缺陷型小鼠 中的人白血病细胞的实验中得到证实。不幸地是，IL-4的临床有效性受到细胞因子的多效 活性的限制，所述多效活性包括肾毒性、肝毒性、神经毒性和胃肠道毒性以及血管渗漏综合 征，这与IL-4与非造血细胞的结合相关。因此，"野生型"IL-4作为治疗剂的用途受到其结 合造成不良反应的细胞类型的能力的限制。
[0012] 因此，本领域中存在对具有对一种受体相对于另一种受体的增加的选择性的分子 的需求；使用IL-4作为实例，其对ye相对于IL_13Ra 1增加的选择性可以是有利的，或者 反之亦然。
[0013] 此外，与野生型细胞因子的使用相关的一些毒性可以是高剂量施用的结果。因此， 可用较低剂量实现所需共有受体的激活的分子也是有利的。
[0014] 因此，本发明解决了本领域中的这些和其他需要。
[0015] 附图简述
[0016] 图1描绘IL-4超级因子（superkine)的基于结构的工程改造。（a) IL-4和IL-13I 型和II型三元胞外域复合物6的晶体结构。（b)和（C)分别在IL-4和IL-13的D螺旋上 的主要的γ c和IL-13Ra 1结合位点。在（b)中显示了在IL-4位点2库中随机化的位置， 以及在（〇)中在所述受体复合物中11^-4和11^-13的结构重合显示11^-4的位置121、124和 125紧密重叠在IL-13的类似位置上，导致我们要用IL-13的那些位置来取代这些位置。在 (c)中IL-13显示为紫色，并且IL-4显示为浅绿色，经取代的残基显示为红色。（d)在展示 IL-4的酵母上IL-4/IL_4Ra /yc三元胞外域复合物的协作组装。（e)在图（b)中显示的 IL-4位点2库通过分选ye四聚体而逐步富集。在第一分选步骤中用IL-4Ra复合所述 库，后续的循环不包括IL-4R a。最终的第六分选循环是对1以!11的ye单体的分选（未显 示）。
[0017] 图2描绘了 IL-4和合成因子与通过C末端生物素化固定在表面上的γ。结合的 表面等离子体共振分析。
[0018] 图3描绘IL-4对γ。的亲和力增强的结构基础。（a) super-4/γ。二元复合物在 3.25 A的晶体结构。（b) super-4/ γ c二元复合物与IL-4/IL-4Ra/ γ。三元复合物的结构 重合。super-4与yc的停靠模式与IL-4的停靠模式实质相同。（d)野生型与γ。的复合 物（左）和super-4与γ。的复合物（右）中位点2界面的分离视图。所显示的视图为表 示细胞因子的A螺旋和D螺旋的条带，所述条带具有显示的与γ。相互作用的侧链，投射到 γ。的半透明分子表面上。γ。的相互作用残基在该表面下部可见为该表面上的黑色轮廓。 γ。上被各个细胞因子接触的区域在该表面上被标示为黄色，以及γ。的能量关键的Υ103为 红色。虚线椭圆环绕在图（d)中从侧面显示的界面的区域。在（d)中，显示借助于super-4 中的S125F和Y124W取代，super-4(右）中相对于IL-4(左）中的界面填装和形状互补性 改善的特写。显示细胞因子和受体的半透明分子表面。
[0019] 图4描绘super-4螺旋D的电子密度。
[0020] 图5描绘super-4/ γ c界面中重塑的氢键键合相互作用。
[0021] 图6描绘细胞系上IL-4受体组分的表达。（a) IL-4R α、γ c和IL-13R α 1的mRNA 的表达是通过对已经饥饿过夜的细胞以材料和方法中描述的定量PCR来测量的。结果显 示三次独立实验的平均值和SEM。（b)通过流细胞计数法测定指定细胞系的细胞表面上 IL-4Ra、γ c和IL-13Ra 1的表达。用特异性抗体测量的MFI标准化为相同同种型的对照 抗体。
[0022] 图7描绘IL-4超级因子对细胞内信号传导的影响。（a)经过夜饥饿的Ramos细胞 未经刺激，或者用l〇〇pg/ml的IL-4、super-4或者KFR刺激所示时间。细胞随后被固定、透 化，以及用抗磷酸化STAT6的抗体染色。进行三次独立实验，具有所示的平均值和SEM。（b) 用递增量的IL-4或super-4刺激Ramos细胞15分钟，随后进行如图7(a)中所示的分析。 重复该实验三次；指示平均值和SEM。（c) Ramos细胞经饥饿过夜，接着用递增量的IL-4或 所指示的超级因子刺激15分钟。指示了三次独立实验的平均值和土SEM。（d)A549细胞经 饥饿过夜，用指示浓度的IL-4或超级因子刺激15分钟。细胞如7 (a)中所示地固定和准备； 进行三次独立实验，并指示平均值和SEM。（e) U937细胞经饥饿过夜，接着用IL-4或者超级 因子刺激15分钟；pSTAT6如在7(a)所示测量。重复实验三次；指示了平均值和SEM。（f) 如所示用IL-4或者super-4刺激Ramos细胞8小时，接着用⑶23进行表面染色。重复实 验三次；指示了 CD23上调的平均值和SEM。
[0023] 图8描绘单次实验中响应于IL-4和超级因子的STAT6磷酸化染色。
[0024] 图9描绘响应于第二链募集的增强和第二链的数量变化的受体组装的模型化。使 用Matlab脚本来计算仅表达I型IL-4受体的细胞表面上IL-4受体的组装。（a)在上方 的三个图中，IL-4Ra数目设置为1500。第二链的数目从500升至4500,并且IL-4Ra复 合物对于第二链的二维平衡常数在从〇. 01 μ m2到1 μ m 2的范围内，如所指示的。计算针对 100pg/ml和1000pg/ml配体，γ c分子为每细胞500个、1500个和4500个时最高第二链K 值（1.0 μ m2)对最低第二链K值（0.01 μ m2)的组装链比率。（b)在中间三个图中，IL-4R a 的数量设置为1500。二维平衡常数从1 μ m2变化至0. 01 μ m2,以及第二链数量从每细胞167 个到每细胞4500个。显示用每细胞167条γ c链组装的复合物，IL-4或者突变蛋白浓度 为100pg/ml和1000pg/ml，二维平衡常数是1·0μπι2、0· Iym2或者Ο.ΟΙμπι2。在底部的图 中，绘制组装复合物的数量与IL-4或者super-4浓度的关系，并且绘制在IL-4浓度范围为 10, 000pg/ml到30, 000pg/ml时逼近组装受体的最大数量的线条。
[0025] 图10描绘改变γ c可用性对IL-4诱导的STAT6激活或者超级因子诱导的STAT6 激活的影响。（a)用指示浓度的IL-4或突变蛋白刺激HH细胞，进行如图7所示的细胞内染 色和分析。显示了具有相同结果的两次独立实验的代表性实验。（b)经饥饿的Ramos细胞 保持未处理，或者用5 μ g/ml或者50 μ g/ml的抗γ c封闭抗体孵育1小时。随后用IOOpg/ ml的IL-4或者所示超级因子刺激所述细胞。随后如图7a所示地进行分析。进行三次独立 实验，指示了平均值和SEM。（c)经饥饿的U937细胞如IOb中的Ramos细胞一样进行处理 和分析。
[0026] 图11描绘超级因子对人原代细胞的作用。（a)用指示浓度的IL-4、super_4或KFR 刺激PBL15分钟，或者PBL保持为未经刺激。如图7所示地计算pSTAT6的诱导；指示了来 自5个供体的数据的平均值和SEM(L =淋巴细胞，M =单核细胞，Ne =中性粒细胞）。（b) 如图6b所示地测量来源于单一供体的人PBL上IL-4受体链的表达。对于IL-4R α、γ c和 IL-13Ra 1表达的测量，B细胞和T细胞通过细胞表面标志物（CD19、⑶3)门控，而单核细胞 和中性粒细胞则基于其区别性的前向和侧向散射而被识别为CD19和CD3阴性细胞。合适的 同种型对照充当阴性对照。（c)如在图Ilb中所示地测量来源于六个供体的PBL上IL-4R 受体链的表达；提供了平均值和SEM(T = T细胞，B = B细胞，M =单核细胞，Ne =中性粒细 胞）。（d)人PBL上IL-4I型和II型受体链的表达。对于IL-4R a、γ c和IL-13R a 1表达 的测量，B细胞和T细胞是通过细胞表面标志物（CD19、CD4、CD8)门控的，而单核细胞则被 识别为CD14+细胞。合适的同种型对照充当阴性对照，提供了平均值和SD。（h)基于IL-4 和超级因子的S形剂量响应曲线（图19)获得的标准化pSTAT6EC50值。来源于IL-4wt的 PSTAT6EC50被标准化为1，并且相应地计算super-4和KFR的EC50值。配对T检验被于确 定显著的变化。
[0027] 图12描绘在CD4和CD8T细胞中，相较于IL-4和KFR，super-4诱导更强的STAT6 磷酸化。基于IL-4和超级因子的S形剂量响应曲线获取的标准化P-STAT6EC50值。将来 源于IL-4野生型的P-STAT6EC50值标准化至1，并且相应地计算super-4和KFR的EC50值 (L =淋巴细胞，M =单核细胞，Ne =中性粒细胞）。
[0028] 图13描绘由IL-4和超级因子表现出的功能活性。（a)在TGF和指示浓度的IL-4、 super-4或者KFR的存在下，用抗⑶3/抗⑶28包被珠培养人天然⑶4+CD45RA+⑶45ROTD25T 细胞。4天后，在布雷菲德菌素 A存在下用PM和离子霉素再刺激细胞另外4小时。随后分 析细胞的IL-9和Foxp3的细胞内表达。数据（平均值和SEM)来源于>4个供体的3次独 立实验。（b)从健康的血液供体获取的外周血单核细胞分离CD14+单核细胞（>97%纯度）， 并且仅用50ng/mL的GM-CSF培养所述细胞，或者用指示浓度的IL-4、KFR或者super-4培 养所述细胞。
[0029] 图14描绘超级因子图解树突状细胞的成熟依赖于II型IL-4受体复合物的激活。 ⑶14、⑶86和⑶209表面标志物的表达用于指示超级因子对DC成熟的影响。为了这个实验， 分离⑶14+单核细胞（>97%纯度），并在所示抗体的存在下用50ng/mL的GM-CSF和2 μ g/ ml的IL-4、KFR或super-4培养