因子特异性和细胞特异性。共有受体也 是差异表达的。因此，细胞因子对某些细胞类型优选的活性可以通过操纵配体来工程改造。 例如，操纵共有受体募集的结合参数可以使细胞因子的活性向某些细胞类型偏移。这可以 应用于通过共有和/或异源二聚体受体进行信号传导的宽范围细胞因子。
[0065] 为了使本发明更易于理解，将在下文以及贯穿说明书定义某些术语和短语。
[0066] 定义
[0067] 除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的 普通技术人员所通常理解的相同含义。通常，本文所使用的命名法则和在细胞培养、分子 遗传学、有机化学中所使用的实验方法是本领域中众所周知并且通常使用的那些。标准技 术用于核酸和肽的合成。通常根据本领域和各种一般参考文献中的常规方法（一般参见， Sambrook 等人，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL，第 2 版（1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y·，该参考文献以引用方式并入本文） 来进行所述技术和方法，其在本文件通篇提供。本文所使用的命名法则和如下所述的分析 与合成有机化学的实验方法是本领域熟知且常用的那些。标准技术或其改良用于化学合成 和化学分析。
[0068] 本文中的"野生型"或者"WT"或"天然的"表示在自然界中发现的氨基酸序列或者 核苷酸序列，包括等位基因变化形式。"野生型IL-4"表示IL-4,无论是天然的还是重组的， 具有天然人IL-4的129个正常存在的氨基酸序列，SEQ ID NO: 1，不包含24个氨基酸IL-4 信号肽。
[0069] 如本文所使用的，"突变蛋白"表示相对于野生型多肽在一个或多个位点处有氨基 酸插入、缺失、取代和修饰的多肽。示例性的突变蛋白可以包括对1个、2个、3个、4个、5个、 6个、7个、8个、9个、10个或更多个氨基酸的取代。
[0070] 突变蛋白还包括对整个野生型多肽或多聚核苷酸序列的保守修饰和取代（例 如，对突变蛋白的二级结构或三级结构具有最小影响的那些）。这种保守性取代包括在 Dayhoff 的 The Atlas of Protein Sequence and Structure 5(1978)和 Argos 的 EMBO J. ,8:779-785(1989)中描述的那些。例如，属于下列组之一的氨基酸代表保守性变化：组 I :ala、pro、gly、gin、asn、ser、thr ;组 II :cys、ser、tyr、thr ;组 III :val、ile、leu、met、 ala、phe ;组 IV :lys、arg、his ;组 V :phe、tyr、trp、his ;以及组 VI :asp、glu〇
[0071] 如本文所使用的，"共有受体多肽"指多于一个配体之间共有的多肽受体。示例性 共有受体是被IL-4结合的那些，包括但不限于yc、gpl30、|3c或者IL-13Ra 1。
[0072] 如本文所使用的，"配体"指能够特异性地结合至另一分子例如受体的任何分子。 术语"配体"包括激动剂和拮抗剂两者，并且可以是例如小分子、抗体片段、SiRNA、反义核 酸、诸如突变蛋白的多肽、DNA和/或RNA。
[0073] 如本文所使用的，"靶细胞"指表达共有受体多肽的细胞，或者表达能够结合至本 发明的突变蛋白的受体多肽的细胞。靶细胞的实例可以包括但不限于B细胞、CD4T细胞、 巨噬细胞、单核细胞以及上皮细胞。
[0074] "根据野生型编号"表示提及所选氨基酸在野生型多肽的成熟序列中正常存在的 位置来鉴别该氨基酸，例如118应指在SEQ ID NO: 1中存在的第一百一^h八个氨基酸。
[0075] 如本文提及多肽或DNA序列使用的术语"同一性"指两个分子之间亚基序列的同 一性。当两个分子中的亚基位置被相同的单体亚基（例如，相同的氨基酸残基或核苷酸） 占据时，则所述分子在该位置处是同一的。两个氨基酸或者两个核苷酸序列之间的相似性 是同一性位置数量的直接函数。一般说来，对所述序列进行比对以便获得更高级别的匹配。 如有必要，可以使用公开的技术和广泛可用的计算机程序来计算同一性，诸如GCS程序包 (Devereux 等人，Nucleic Acids Res. 12:387,1984)、BLASTP、BLASTN、FASTA (Atschul 等 人，J. Molecular Biol. 215:403,1990)。可以使用序列分析软件来测量序列同一性，所述 序列分析软件诸如 University of Wisconsin Biotechnology Center (1710University Avenue,Madison, ffis. 53705)的 Genetics Computer Group 的 Sequence Analysis Software Package，使用软件的默认参数。
[0076] 术语"多肽"、"蛋白"或者"肽"指氨基酸残基的任何链，而不论其长度或翻译后修 饰（例如，糖基化或磷酸化）。
[0077] 在本公开的突变蛋白多肽是"基本上纯的"的情况下，突变蛋白多肽可以占目标多 肽的至少约60重量％ (干重）。例如，所述多肽可以占目标多肽的至少约75重量％、约80 重量％、约85重量％、约90重量％、约95重量％或者约99重量％。可以通过任何合适的 标准方法来测量纯度，例如柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳或者HPLC分析。
[0078] 如本文所使用的术语"有效量"指引起所需的生物反应所必需的量。药物的有效 量可根据诸如以下因素而变化：所需的生物终点、待递送的药物、任何其他活性或失活成分 的组成，等等。
[0079] 本文使用的术语"表达"表示从DNA产生多肽的过程。所述过程包括基因转录成 mRNA，以及此mRNA翻译成多肽。根据其使用的上下文，"表达"可指RNA、蛋白、或RNA和蛋 白两者的广生。
[0080] 如本文所使用的术语"基因产物"表示由该基因编码的RNA(例如信使RNA(mRNA) 或微RNA (miRNA))或者蛋白。
[0081] 如本文所使用的，术语"经分离的"指分子是基本上纯的。经分离的蛋白可以是基 本上纯的，例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或者99%不含其他不同的蛋 白分子。
[0082] 如本文所使用的，术语"调节（modulate/modulation) "或者"操纵（manipulate/ manipulation) "泛指特异性靶向基因（包括其RNA和/或蛋白产物）、信号传导途径、细胞 和/或靶向表型的下调（例如，抑制或遏制），或者靶向基因的上调（例如，诱导或增加）。
[0083] "患者"或"受试者"表示哺乳动物，例如人，其患有或有风险发展诸如炎性疾病的 疾病或病症，或者患有或被诊断为患有炎性疾病，或者可以其他方式受益于本文所描述的 组合物和方法。
[0084] 如本文所使用的，术语"减少"以及其语法上的等效形式指对表达或基因产物活性 的任何抑制、减少、降低、遏制、下调或阻止。例如，表达或者活性的水平可以是未受抑制的 表达或活性的例如100%或者小于100%，例如小于95%、小于90%、小于85%、小于80%、 小于75%、小于70%、小于65%、小于60%、小于55%、小于50%、小于45%、小于40%、小 于35%、小于30%、小于25%、小于20%、小于15%、小于10%，或者小于5%。
[0085] 术语"治疗（treating/treatment) "或者"减轻"或者"改善"指治疗性治疗和预 防或防治性措施，其中目的是预防或者延迟（减轻）靶向的病理病症或疾患。
[0086] IL-4
[0087] IL-4是经典的四α螺旋管束细胞因子。其主结合链是IL-4Ra，IL-4Ra是II型 细胞因子受体链，由胞外域、跨膜域和长胞内尾部组成，含有Boxl域、PTB域蛋白的结合位 点以及三个STAT6停靠和激活位点。
[0088] 野生型人IL-4包括24个氨基酸的信号肽和129个氨基酸的氨基酸链肽。SEQ ID NO: 1是成熟的129个氨基酸的人IL-4序列。
[0089] MGLTSQLLPPLFFLLACAGNFVHGHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKNTTEKE TFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKT IMREKYSKCSS (SEQ ID Ν0：1)〇
[0090] IL-4/IL_4Ra复合物充当IL-4受体的第二组分的配体，其对于I型受体是yc 并且对于II型受体是IL-13Ra 1。细胞表面上IL-4/IL-4Ra /yc或者IL-4/IL-4Ra / IL-13R a 1复合物的形成激活细胞内的信号传导途径，所述信号传导途径包括Jak-STAT途 径和PI3K/Akt途径，后一途径通过PTB域蛋白（特别是IRS2)的募集来动员。与IL-4结 合的I型和II型IL-4受体的胞外域的晶体结构的最近研宄（图la)显示IL-4位于由 IL-4R α和第二受体链形成的"Y形叉"中，并且通过细胞因子的D螺旋上的结合表面与第 二受体链直接接触。
[0091] IL-4与IL-4Ra的结合是非常高亲和力的，具有约KTiqM的KD。IL-4/IL-4Ra复 合物与γ〇或者IL_13Ra 1的后续结合是相对低亲和力的。由于IL-4与IL_4Ra的结合 的非常高的亲和力，在大部分情况下信号传导复合物的形成是由第二链的相对表达水平来 决定的。此外，替代性的第二链具有不同的细胞表达模式，Yc主要在造血细胞上表达，并且 IL-13Ra 1主要在非造血细胞上表达，尽管一些造血细胞也表达可变量的IL-13Ra 1。IL-4 的大部分调节活性是由主要表达I型受体的B细胞和T细胞介导的，而其大部分效应子功 能（其模拟IL-13)是由唯一表达II型受体并且也对IL-13响应的细胞介导的。
[0092] 功能上，IL-4通过分别作用于天然⑶4T细胞、B细胞和巨噬细胞来调节⑶4T细胞 的Th2分化、免疫球蛋白类型转换成IgE，以及替代性的巨噬细胞激活。因为IL-4结合至主 要在非造血细胞上表达的II型受体，与其结合I型受体一样有效，其可以诱导效应子功能 以及调节功能。效应子功能是气道超敏性和杯状细胞化生。然而，后面的这些活性在生理 上主要是利用IL-13由II型受体诱导的，因为IL-13的量远大于IL-4。此外，因为IL-13 无法结合至主要在造血细胞上表达的I型受体，所以IL-13很少或没有"调节"活性。总的 说来，通过使用I型和II型IL-4受体，IL-4在Th2型炎症中起重要作用，不论该炎症是由 过敏原引发的还是由侵入的细胞外寄生虫引发的。
[0093] IL-4当前并未用作治疗剂，但是其已经在过去被考虑用于此类用途，并且如果无 毒性，可以被考虑用于以下目的：诸如在疫苗接种期间指导CD4T细胞分化，或者鉴于对已 分化的⑶4T细胞的可塑性的最近识别来改变分化的产生模式。在20世纪90年代早期，进 行临床试验，在所述临床试验中将IL-4施用给癌症患者，以期促进T细胞反应或者参与先 天免疫系统。
[0094] 然而，大剂量（600 μ g/m2/天）IL-4的静脉内施用导致研宄组中三分之二的患者 的血管渗漏综合征。在这些研宄和临床前分析中还遭遇了其他毒性。虽然这些毒性中有许 多毒性涉及IL-4作用于非造血细胞，但是IL-4在小鼠体内具有明显的巨噬细胞介导的毒 性。将IL-4施用至小鼠导致由替代地激活的巨噬细胞介导的噬血细胞综合征。
[0095] 因为IL-4通过结合至II型受体和后续的效应子功能而对非造血细胞的活性，使 用IL-4药理学地调节淋巴细胞分化是复杂的。因此产生无法激活II型受体或者其中I型 受体的激活以比II型受体的激活明显降低的浓度实现的IL-4突变蛋白将是有利的。
[0096] 因此，在一些实施方式中提供了经工程改造的IL-4突变蛋白，与野生型IL-4相 比，该IL-4突变蛋白具有对I型和II型受体的第二链改变的相对结合活性。在一些实施 方案中，IL-4突变蛋白调节或增强信号传导，而不是阻断信号传导。
[0097] 本文描述了人IL-4突变蛋白的产生，人IL-4突变蛋白被称为"超级因子"，具有对 γ c非常高的亲和力以及对IL-13R a 1减弱的亲和力，并且相反地，那些IL-4突变蛋白以比 IL-4高得多的亲和力结合至IL-13Ra 1，其对γ c的亲和力很少或者没有变化。
[0098] 因此，在一些实施方案中，IL-4突变蛋白具有对ye相对高的亲和力和对 IL_13Ra 1减弱的亲和力。在其他实施方案中，IL-4突变蛋白具有比IL-4相对高得多的对 IL-13R a 1的亲和力，其对γ c的亲和力很少或没有变化。
[0099] IL-4超级因子（突变蛋白）
[0100] 在各种实施方案中，本公开提供了 IL-4突变多肽，所述突变多肽可以但不一定是 基本上纯化的，并且可以作用为野生型IL-4的激动剂；实现IL-4的一种或多种生物学活性 (例如，刺激细胞增殖）。
[0101] 示例性的突变IL-4多肽包括具有与SEQ ID NO: 1至少约80%的同一性的氨基酸 序列，该氨基酸序列以比SEQ ID NO: 1代表的多肽结合至ye的亲和力更大的亲和力结合 yc，并且具有对IL_13Ra 1减弱的亲和力。例如，相对于野生型IL-4,突变IL-4多肽可以 具有至少一个突变（例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12 个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个氨基酸残基的缺失、添加或 者取代），并且以比SEQ ID NO: 1的IL-4更大的亲和力结合yc，并且与SEQ ID NO: 1对 IL_13Ra 1的亲和力相比，具有对IL_13Ra 1减弱的亲和力。
[0102] 示例性的突变IL-4多肽包括具有与SEQ ID NO: 1至少约80%的同