用于增加cftr活性的方法
【专利说明】用于増加 CFTR活性的方法
[0001] 史蒂文· M ·罗和马克?德雷恩斯菲尔德 [0002] 披露领域
[0003] 本披露涉及增强受试者的粘液纤毛清除的方法。在一个具体实施例中，本披露涉 及增强受试者的粘液纤毛清除的方法，其中该受试者不具有细胞粘液纤毛清除器官的先天 性或遗传性缺陷和/或细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常。
[0004] 背景
[0005] 粘液清除障碍（粘液淤滞）和粘液产生增加是影响许多人病症的常见问题。即使 在正常上皮功能和正常运作的细胞粘液纤毛清除器官的背景中也是如此，因此粘液纤毛清 除对该具体病症是次优的。许多疾病和/或病症可能会导致次优的粘液清除和/或过量的 粘液生产。在这种情况下，粘液纤毛清除可被视为受损，即使在该细胞粘液纤毛清除器官 中不存在缺陷或异常，因为正常运作的细胞粘液纤毛清除器官未被充分给予患者的潜在病 症。
[0006] 例如，患有由先天性或遗传性病症引起的神经肌肉疲软（例如但不限于肌肉萎 缩、脊髓性肌萎缩、以及ALS)的个体遭受复发性肺炎，归因于导致粘膜淤滞的不良的咳嗽 清除。此外，患有获得性解剖学问题导致肌肉无力（例如但不限于截瘫、四肢瘫痪、膈神经 麻痹等）的个体遭受着同样的命运。其他受试者，如由于病症（例如但不限于哮喘和哮喘 持续状态）遭受过量粘液产生的那些，由于病症（例如但不限于免疫球蛋白缺陷、SCID、高 IgE综合征、以及类似病症）遭受受损的免疫的那些，遭受解剖学呼吸异常损害粘液清除的 那些，和因为不明原因遭受复发性肺炎的那些以及遭受口咽部异常的那些，遭受着肺不张 和/或肺炎（归因于粘液产生过多压制了该粘液纤毛清除器官有效转运它的能力）。归因 于或导致次优的粘液清除和/或粘液产生过多的这些障碍是严重的复发性问题，引起相当 大的发病率，而且也导致死亡率的一个促因。因此，即使在其中粘液纤毛清除功能是正常的 疾病中，粘液纤毛清除功能增强到超常水平也有利于对抗特定的疾病。
[0007] 本领域缺乏增强粘液纤毛清除和/或气道上皮细胞功能的化合物和治疗方法。本 领域尤其缺乏增强受试者的粘液纤毛清除和/或气道上皮细胞功能的化合物和治疗方法， 该受试者在细胞粘液纤毛清除器官方面不具有先天性或遗传性缺陷和/或在细胞粘液纤 毛清除器官方面不具有获得性异常。此类化合物和治疗方法将通过治疗由次优的粘液清除 和/或粘液产生过量引起的病症和类似的病症，为那些受试者提供实质利益。
[0008] 本披露为本领域中遇到的问题提供了一种解决方案，通过提供化合物和治疗方法 来增强粘液纤毛清除和/或气道上皮细胞功能，以克服次优的粘液清除和/或粘液产生过 量。此外，本披露为本领域中遇到的问题提供了一种解决方案，通过提供化合物和治疗方法 诱导超常的粘液纤毛清除来增强粘液纤毛清除和/或气道上皮细胞功能，以克服次优的粘 液清除和/或粘液产生过量。而且，本披露在受试者中提供了以上益处，其中该受试者不具 有细胞粘液纤毛清除器官的先天性或遗传性缺陷和/或细胞粘液纤毛清除器官的获得性 异常。在一个实施例中，该次优的粘液清除和/或增加的粘液产生是由于或与神经肌肉疾 病、解剖学呼吸异常、获得性解剖学问题相关联，导致肌肉疲软、解剖学疲软、哮喘和哮喘持 续状态，相对易于呼吸感染（例如归因于受损的免疫）、和/或粘液产生过量。
[0009] 附图简要说明
[0010] 图1示出CFTR增效剂艾维卡夫特（ivacaftor)增强了野生型CFTR活性。
[0011] 图IA示出了使具有和不具有野生型CFTR的互补表达的CFBE410-细胞在空气-液 体界面生长，然后将其安装在尤斯（Ussing)室中，并在Cl-分泌梯度的背景下，在阿米洛 利（amiloride) (ΙΟΟμΜ)和毛喉素（forskoiin) (IOOnM)之后，用艾维卡夫特（VX-770 ; 10 μΜ)或运载体对照进行刺激。将通过稳定表达WT-CFTR(通过慢病毒启动子）互补的 CFBE410-细胞与不具有WT CFTR互补的CFBE410-细胞（亲本细胞）对比显示。*Ρ〈0·05， **Ρ〈0· 005, η = 5/ 条件。
[0012] 图IB示出将细胞的代表性Isc跟踪依次暴露于在阿米洛利（100 μ Μ)背景下的毛 喉素（IOOnM)和艾维卡夫特（VX-770 ;10 μΜ)或运载体对照，随后是CFTR Inh-172(10 μΜ)。
[0013] 图2示出该CFTR增效剂艾维卡夫特增强ASL深度并增加粘液纤毛清除。
[0014] 图2Α示出在测定前将运载体对照或艾维卡夫特（VX-770 ;1. 0 μ Μ)暴露于基底外 侧隔室24h后来源于HBE细胞的表面的代表性Z-扫描共聚焦图像。白比例尺指定10 μ m。
[0015] 图2B示出来自示于图2A中的实验的汇总数据。林P〈0. 005,η = 10/条件。虚线 表示使用完全相同的方法的一组CF HBE细胞的ASL深度。
[0016] 图2C显示来源于在时间=Oh测量后立即将HBE细胞、艾维卡夫特（VX-770 ; 10 μ Μ)或运载体对照添加到用CAMP激动剂VIP (30nM)共刺激的单层的基底外侧隔室的粘 液纤毛传输速率。**P〈〇. 001，相对于运载体对照，η = 10个粒子/条件。
[0017] 图2D示出将完全分化的HBE细胞暴露于CSE (2 % )或顶上地暴露于运载体（具有 2% DMSO的介质）和VX-770 (10 μΜ)或基底外侧地暴露于运载体（0. 1%，DMSO) 24小时的 代表性的SD-OCT图像。ASL深度显示为红色条。白比例尺=10 μ m。
[0018] 图3示出CFTR增效剂艾维卡夫特增强了野生型CFTR活性。
[0019] 图3A显示来自于正常人类受试者的支气管在切割粘膜层之后，然后在电压钳位 条件下安装在尤斯室并浸入匀称的林格氏溶液的代表性Isc跟踪。显示了顺序添加阿米 洛利（100μΜ)、毛喉素（IOOnM)和艾维卡夫特（VX-770 ;10μΜ)或运载体对照，随后添加 ΑΤΡ(ΙΟμΜ)和 CFTR Inh-172(10yM X 2)作为对照添加。
[0020] 图3Β示出来源于示于图3Α中的实验的汇总数据。示出了在添加艾维卡夫特 (VX-770)或运载体对照后的Isc的变化。*Ρ〈0. 05, η = 19, 24个样品/条件。
[0021] 图4通过μ OCT示出CFTR激活剂对人支气管上皮细胞中的气道上皮功能的影响。 含有缺陷型CFTR的对照HBE细胞（指定的对照，CF)以及含有WT-CFTR的HBE细胞（指定 对照和VX-770,野生型）仅接受运载体（对照；0· 2% DMS0)或艾维卡夫特（10 μΜ)。小图 A-D显示ASL深度（A)、PCL深度（B)、纤毛摆动频率（C)、和粘液纤毛转运（MCT)速率（D)， 如从μ OCT图像量化的。
[0022] 图5通过yOCT示出CFTR激活剂对人支气管上皮细胞中的气道上皮功能的影 响。小图A显示了将完全分化的HBE细胞暴露于运载体（对照；具有2% DMSO的介质）、 CSE (2 % )、CSE (2 % )和艾维卡夫特（10 μ M)或仅艾维卡夫特（10 μ M ;0· 1 % DMS0)的代表 性μ OCT图像。顶上地给予CSE并且基底外侧地给予艾维卡夫特。将细胞暴露于每种条件 24小时。ASL深度显示为暗条。白比例尺=10 μ m。小图B-D显示ASL深度（B)、纤毛摆动 频率（C)、和粘液纤毛转运（MCT)速率（D)，如从μ OCT图像量化的。数据来源于每孔5个 测量以及3孔每个条件。
[0023] 图6通过μ OCT示出CFTR激活剂对人支气管组织中的气道上皮功能的影响。小 图A-C分别显示ASL深度、CBF和MCT。小图A-C分别显示响应于艾维卡夫特处理（10 μ Μ) 的ASL深度、CBF和MCT。
[0024] 图7通过μ OCT示出CFTR激活剂对完整的猪气管中的气道上皮功能的影响。小 图A和B显示关于CFTR-/-(小图Α)和CFTR+/+(小图Β)动物的代表性的μ OCT图像。小 图C-F分别显示ASL深度、PCL深度、CBF和MCT测量，来源于来自CFTR-/-和CFTR+/+动物 的yOCT图片。小图G和H显示响应于艾维卡夫特（10 μ Μ)、毛喉素（IOOnM)和乙酰胆碱 (100 μ Μ)的连续药物干预的上皮功能参数，即CFTR-/-和CFTR+/+动物的ASL深度和MCT。
[0025] 详细说明
[0026] 粘液纤毛转运及气道表面的功能是人呼吸系统活性研宄的一个领域。在健康的气 道中，一层纤毛连续转运气道粘液，这是抵御颗粒污染和生物入侵者的一个至关重要的机 制。
[0027] 粘液纤毛清除的缺陷是现有技术中已知的。一个常见的实例是囊性纤维化（CF)。 CF是由囊性纤维化跨膜传导调节蛋白（CFTR)的突变引起的。CFTR是主要表达于外分泌组 织中的上皮阴离子通道。在编码CFTR的基因中的突变是CF的近因。在肺中，CFTR功能的 损失导致气道表面液体（ASL)损耗、粘液增稠、粘液纤毛清除降低、慢性细菌感染、和过量 的炎症。随着时间的推移，由于呼吸道分泌物浓缩和支气管扩张，肺梗阻随之而来，导致呼 吸衰竭。
[0028] CF和其他影响粘液纤毛清除的病症是由粘液纤毛清除器官的先天性缺陷引起，例 如但不限于CFTR。增加患有CFTR的先天性缺陷的受试者的CFTR活性的化合物是本领域已 知的。
[0029] 然而，本披露基于增强患有次优的粘液纤毛清除和/或粘液产生过量的受试者的 粘液纤毛清除和/或气道上皮细胞功能，并基于在其中受试者不具有细胞粘液纤毛清除器 官的先天性或遗传性缺陷和/或细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常的受试者中增强患 有次优的粘液纤毛清除和/或粘液产生过量的受试者的粘液纤毛清除和/或气道上皮细胞 功能。其结果是，该粘液纤毛清除器官的功能得到改善。
[0030] 增加或增强细胞粘液纤毛清除器官的活性具有重要的临床意义，即使在不具有细 胞粘液纤毛清除器官的先天性或遗传性缺陷和/或细胞粘液纤毛清除器官的获得性异常 的个体中。细胞粘液纤毛清除器官中的一个重要成员是CFTR。如上所讨论的，CFTR的突 变可以导致次优的粘液清除。在一个实施例中，本披露采用增加不具有CFTR的先天性或遗 传性缺陷和/或获得性异常的受试者的CFTR的