一种脾氨肽原液的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生化制药领域，具体涉及一种脾氨肽原液的提取方法。
【背景技术】
[0002] 脾氨肽的主要成份来自新鲜哺乳动物脾脏中提取的多肽及核苷酸类物质，其主要 用于治疗细胞免疫功能低下、免疫缺陷和自身免疫功能紊乱性疾病（反复呼吸道感染、支气 管炎、肺炎、哮喘、重症带状疱疹及牛皮癣等）；用于恶性肿瘤病人放、化疗及术后生活质量， 降低各种原因引起的感冒、发烧或其它感染发生率。
[0003] 现有的脾氨肽提取方法通常为先将动物脾脏清洗绞碎、匀浆，然后通过透析或超 滤的方法提取脾氨肽有效组分，这种方法的缺点是提取率低，产品纯度低，因为有害的大分 子和小分子不能有效去除，同时这种方法细胞破碎不完全，有效成分不能完全释放。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术存在的问题，本申请提供了一种快速、高纯度、高活性脾氨肽原液的 制备方法。具体技术方案如下。
[0005] 本申请提供的一种脾氨肽原液的制备方法，主要包括如下步骤： 1) 取料、磨碎、匀浆：将新鲜的健康的动物脾脏去脂肪及缔结组织，然后磨碎匀浆； 2) 速冻、融化：将步骤1)得到的匀浆液速冻，速冻完成的匀浆液放入恒温箱至完全融 化；反复两次； 3) 蛋白酶水解：向步骤2)得到的匀浆液中加入蛋白酶水解； 4) 高压破碎：将步骤3)酶解后的溶液放入高压细胞破碎机中破碎； 5) 核酸酶水解：将步骤4)破碎得到的溶液加入核酸酶水解； 6) 离心、超滤：将双酶酶解后溶液放入冷冻离心机中离心，离心后取上清液进入超滤器 超滤； 7) 制备型高效液相色谱纯化：将超滤后溶液进入制备型高效液相色谱纯化，得到脾氨 肽原液。
[0006] 通过上述步骤制得的脾氨肽原液经进一步的冻干/灌装：即将高纯度脾氨肽原液 冻干成脾氨肽冻干粉或直接灌装成脾氨肽注射剂，冻干可保证脾氨肽有效成分活性的稳定 性并延长保护期，由于本申请提供的脾氨肽原液纯度高可以直接灌装为脾氨肽注射剂，方 便不同人群的使用。
[0007] 进一步地，上述方法中步骤2)所述速冻为将匀浆液放入旋动机速冻，即旋冻，温度 为-25-30°C，时间为I. 5-3h ;步骤2)中所述融化的温度为35-45°C。本申请通过旋动法 对匀浆液进行速冻因为此种方法冷冻速冻快，能达到速冻，有利于细胞破碎。
[0008] 进一步地，上述方法中步骤3)所述蛋白酶与匀浆液的重量配比为I :60-100,优选 为 1 :80 ;酶解温度 35-45°C ;PH 值为 7. 5-8. 0。
[0009] 进一步地，上述方法中，步骤4)所述高压破碎的压力为100-llOMpa，时间 0. 8-1. 5h。本申请采用高压破碎是为了使细胞破碎完全的同时不破坏有效成分，而且适用 于大规模生产；现有技术常用的超声波法破碎容易破坏有效成分因其容量小、易发热，而且 不利于大规模生产，而溶菌酶法破碎率低成本高。
[0010] 进一步地，上述方法中，步骤5)所述核酸酶与破碎后溶液的重量配比为1 : 60-250,优选为I :100 ;酶解温度50-60°C ;PH6. 2-6. 8 ;时间2-3h。本申请采用核酸酶进一 步酶解其一是因为动物脾脏内的一些大分子附着在细胞壁上，采用核酸分子有利于破壁； 其二脾氨肽分子吸附在细胞内的核酸分子上，核酸酶水解核酸使核酸分子破坏，从而脾氨 肽分子得到有效的释放。
[0011] 进一步地，上述方法中步骤6)所述离心机的转速为转速4000r/min，离心时间为 30min ;超滤截留分子量为10000。
[0012] 进一步地，上述方法中步骤7)所述高效液相色谱参数为：反相高效液相色谱 RP-HPLC，固定相苯烷基和氰基键合硅胶孔径100万，流动相为纯化水和缓冲液，收集分子 量 2000-4000。
[0013] 本申请提供的方法通过匀浆、旋冻、融、双酶水解、高压破碎、离心超滤等步骤得到 高纯度高活性的脾氨肽原液，本申请提供的脾氨肽制备方法相对于现有的方法具有如下优 势： 1) 细胞破壁完全，有效成分得到全面释放； 2) 脾氨肽分子保持完整、没有分子结构变化； 3) 产品高纯度、高活性、质量均符合国家标准要求； 4) 没有大分子（Mr > 5000物质）和小分子（Mr < 1000物质）有害物质，可用作高活性 冻干粉和注射剂。
【附图说明】
[0014] 图1蛋白酶水解样图； 图2核酸酶水解样图； 图3 HPLC纯化样图； 图4制备型HPLC图； 图5为制备HPLC纯化样品紫外图谱。
【具体实施方式】
[0015] 下面通过实施例来对本发明做进一步解释说明。
[0016] 实施例1 脾氨肽口服冻干粉的制备方法： 1)取料，磨碎，旋动法速冻、融化：新鲜猪脾脏剪去脂肪及结缔组织称重，按称量猪脾重 量加2倍纯化水入胶体磨(胶体磨间隙：3 μ m)，时间5min，得到猪脾匀浆液；将磨碎后猪脾 匀浆液放入旋动机速冻，温度_30°C，时间2h ;将速冻完成的猪脾匀浆液放入恒温箱，温度 设定38°C，直至速冻品完全融化；二次速冻：将融化完全的猪脾匀浆液再次放入旋动机中 速冻，温度_30°C，时间2h ;二次融化：将二次速冻完成的猪脾匀浆液放入恒温箱，温度设定 38°C，直至速冻品完全融化； 2) 蛋白酶水解：猪脾匀浆液中放入蛋白酶，净脾重量：蛋白酶重量=80:1 ;酶解温度 40〇C ；PH7. 5-8. 0 ； 3) 高压细胞破碎机再破碎：将酶解后溶液放入高压细胞破碎机中破碎(分子直径< 0 · 2 μ m)，压力 lOOMpa，时间 I h ; 4) 核酸酶水解：将高压细胞破碎后得到的溶液加入酵母磷酸二酯酶(核酸酶）水解，溶 液：酶=100:1 ;酶解温度 55°C ;ΡΗ6· 2-6. 8 ; 5) 离心：将双酶酶解后溶液放入冷冻离心机中离心，转速4000r/min，时间30min ; 6) 超滤：离心后取上清液进入超滤器超滤，超滤膜的截留分子量10000 ; 7) 制备型高效液相色谱纯化：将超滤后溶液进入制备型高效液相色谱纯化，得到脾氨 肽原液；高效液相色谱参数(反相高效液相色谱RP-HPLC，固定相苯烷基和氰基键合硅胶孔 径100万，流动相为纯化水和缓冲液，收集分子量2000-4000); 8) 纯化后得到的高纯度脾氨肽原液，测定光谱、多肽、核糖、分子量、活性； 9) 将高纯度脾氨肽原液冻干成脾氨肽冻干粉。
[0017] 实施例2 脾氨肽口服冻干粉的制备方法：步骤同实施例1，不同的为： 步骤2)中净脾重量：蛋白酶重量=100:1。
[0018] 实施例3 脾氨肽口服冻干粉的制备方法：步骤同实施例1，不同的为： 步骤2)中净脾重量：蛋白酶重量=60:1。
[0019] 实施例4 脾氨肽口服冻干粉的制备方法：步骤同实施例1，不同的为： 步骤4)中所述溶液：酶=250:1。
[0020] 实施例5 脾氨肽注射剂的制备方法：步骤同实施例1，不同的为： 步骤9)为：将脾氨肽原液直接灌装成脾氨肽注射剂。
[0021] 实施例6参数优化及数据结果 1.首先通过高效液相色谱测定多肽和蛋白质分子出峰时间，具体结果如表1 : 色谱测定参数：色谱柱：硅胶凝胶色谱柱（TSK-GET 2000 SffXL 300X7. 8mm 5ym 流动相：PB 0· lmol/L PH: 7. 0 内含 0· 05 mol/L NaN3、0· lmol/L Na2SO4 检测波长： 280nm，214nm ; 表1高效液相色谱测定多肽和蛋白质分子出峰时间
【主权项】
1. 一种脾氨肽原液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 取料、磨碎、匀浆：将新鲜的健康的动物脾脏去脂肪及缔结组织，然后磨碎匀浆； 2) 速冻、融化：将步骤1)得到的匀浆液速冻，速冻完成的匀浆液放入恒温箱至完全融 化；反复两次； 3) 蛋白酶水解：将步骤2)得到的匀浆液中加入蛋白酶水解； 4) 高压破碎：将步骤3)酶解后的溶液放入高压细胞破碎机中破碎； 5) 核酸酶水解：将步骤4)破碎得到的溶液加入核酸酶水解； 6) 离心、超滤：将双酶酶解后溶液放入冷离心机中离心，离心后取上清液进入超滤器超 滤； 7) 制备型高效液相色谱纯化：将超滤后溶液进入制备型高效液相色谱纯化，得到脾氨 肽原液。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述速冻为将匀浆液放入旋 动机速冻，温度为-25-30°C，时间为I. 5-3h ;步骤2)所述的融化温度为35-45°C。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述蛋白酶与匀浆液的重量 配比为I :60-100,优选为1 :80 ;酶解温度35-45°C ;PH值为7. 5-8. 0。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)所述高压破碎的压力为 100-1 lOMpa，时间 0· 8-1. 5h。
5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5)所述核酸酶与破碎后溶液的 重量配比为I :60-250,优选为I :100 ;酶解温度50-60°C ;PH6. 2-6. 8 ;时间2-3h。
6. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤6)所述离心机的转速为转速 4000r/min，离心时间为30min ;超滤截留分子量为10000。
7. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤7)所述高效液相色谱参数为： 反相高效液相色谱RP-HPLC，固定相苯烷基和氰基键合硅胶孔径100万，流动相为纯化水和 缓冲液，收集分子量2000-4000。
【专利摘要】本发明公开了一种脾氨肽口服原液的制备方法，通过磨碎、匀浆、旋冻、融、双酶水解、高压破碎、离心超滤等步骤得到高纯度高活性的脾氨肽原液，本申请提供的脾氨肽制备方法相对于现有的方法具有如下优势：细胞破壁完全，有效成分得到全面释放；脾氨肽分子保持完整、没有分子结构变化；产品高纯度、高活性、质量均符合国家标准要求；没有大分子和小分子有害物质，可制作成高活性冻干粉或注射剂。
【IPC分类】A61K38-00, A61K35-26, A61P37-02, A61P37-04, A61K9-19
【公开号】CN104644672
【申请号】CN201510079165
【发明人】赵卿全
【申请人】大连百利天华制药有限公司
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月13日