对照相比，GFP-hWJSC和hWJSC-CM臂示出显著更多的伤口愈合，表 明伤口愈合的直接和间接机制是通过GFP-hWJSC到角质形成细胞的直接分化以及间接地 通过释放起始和促进针对组织修复的宿主反应之重要的生物活性分子来发生的。因为伤口 组织活检示出绿色GFP-hWJSC信号的存活以及人角质形成细胞标志物（细胞角蛋白、内披 蛋白和聚丝蛋白）的物种特异性上调，所以，GFP-hWJSC分化成新的角质形成细胞可能有助 于切除伤口和糖尿病伤口中的上皮细胞再形成。本文的结果示出，通过hWJSC-CM将可溶性 生物活性分子引入伤口以及通过植入的GFP-hWJSC分泌相同分子为天然皮肤MSC和祖细胞 到伤口部位的募集建立了小环境以促进愈合。
[0180] 在本研宄中，在伤口组织活检上的QRT-PCR和物种特异性表面标志物分析有助于 鼠细胞和人细胞的存在之间的区分。基于ICAM-1、??ΜΡ-1和VEGF-A的上调，可能的是， hWJSC和hWJSC-CM两者调节伤口中的差别基因表达，造成在伤口愈合期间的细胞粘附、增 加的血管生成和上皮形成。由于其在伤口愈合级联反应（例如血管生成、上皮形成和胶原 蛋白沉淀）上的多重效应，VEGF-A是独特的[Bao P，等，J Surg Res，153 :347-358 (2009)]。 ICAM-I是在人和小鼠中的伤口愈合期间调节炎性过程的中枢[Yukami，T等，J Lec Biol， 82:519-531 (2007) ;Gay，AN 等，J Surg Res，171(1) :el-e7 (2011)]，因为在 ICAM-I 敲除小 鼠模型中，存在对伤口愈合的延迟反应[Nagaoka，T等，Am J Path，157 :237-247 (2000)]。 由我们实验室的细胞因子蛋白质阵列分析示出，与对照相比，通过在72小时hWJSC-CM中 的hWJSC以高浓度分泌重要的细胞因子，例如ICAM-1、IL-6、IL-8和??ΜΡ-1 [Fong，CY等， 113 :658-668 (2012)]。因此，在hWJSC-CM中的这些细胞因子在早期阶段对加速伤口愈合起 着重要作用。hWJSC分泌蛋白体（secrectome)可有助于发动伤口愈合过程以及对内源小 鼠细胞因子或生长因子分泌上的后续旁分泌作用。qRT-PCR的结果证明hWJSC对伤口的治 疗示出早在第3天的增加的小鼠 ICAM-I和TIMP-I表达。此外，在第14天的ICAM-I mRNA 数据与观察到的体内伤口闭合密切相关并且所述数据表明hWJSC产生在伤口愈合的早期 阶段期间加速伤口闭合的粘附分子。在CCD-CM治疗的伤口中，在第14天观察到的TIMP-I mRNA表达的增加表明在CXD-CM治疗的小鼠中观察到的伤口愈合延迟可能是由于??ΜΡ-1晚 的转录上调。若干公开的报道也已经示出在慢性伤口床中的高水平基质金属蛋白酶（MMP) 和低水平MMP的组织抑制剂（??ΜΡ)表明伤口愈合受损[Stevens，LJ，Molec Biol of the Cell，23 :1068-1079(2012) ;Liu，Y，等，DiabCare，32 :117-119 (2009)]。MMP 在伤口愈合中 起着主要作用，因为其能破裂分解所有胞外基质（ECM)的组分[Stevens，LJ，M 0lec Biol of the Cell，23 :1068-1079(2012)]。在糖尿病伤口中，存在MMP的上升和??ΜΡ的下降。高水 平的MMP-I对于伤口愈合至关重要，而提高水平的ΜΜΡ-8和ΜΜΡ-9是有害的。认为MMP-I/ ??ΜΡ-1比是糖尿病伤口愈合的良好预测[Muller Μ，等，DiabMed，25:419-426(2008)]。令 人感兴趣地注意到，在本研宄中，在72小时，hWJSC-CM中过量水平的分泌??ΜΡ-1是明显的 并且其在转录水平上与纤连蛋白、胶原蛋白I和胶原蛋白III的基因表达的显著增加相一 致，这表明hWJSC分泌影响ECM重塑的内源蛋白质。
[0181] 胶原蛋白在伤口愈合的炎性阶段期间正常地产生并且由真皮成纤维细胞分泌的 ECM 有助于伤口 重塑。Fathke 等[Fathke，C 等，Stem Cells，22 :812-822(2004)]证明 了 MSC群产生I型胶原蛋白和III型胶原蛋白，其提供皮肤伤口的长期重构。还报道了 在皮肤的早期愈合过程中表达111型胶原蛋白[21^叩，1(，等，1111￥68七061'1]^1:〇1，104 : 750-754(1995)]。在本研宄中，在暴露于hWJSC-CM之后，通过C⑶的胶原蛋白I和胶原蛋 白III的上调还表明hWJSC-CM支持伤口愈合。在本研宄中，hWJSC-CM还刺激纤连蛋白和弹 性蛋白的增加。纤连蛋白是在伤口愈合的增殖阶段期间由真皮成纤维细胞分泌的另一个重 要的 ECM 蛋白质[Bielefeld，KA，J Biol Chem，286 :27687-27697(2011)]并且其在为伤口 提供必需的机械强度中至关重要[Clark，RAF，J Invest Dermatol，94.128S_134S(1990)]。 弹性蛋白为皮肤提供弹性和复原并且这些纤维在胶原蛋白束之间通常是相互编织的。弹性 蛋白也涉及在伤口愈合过程中的细胞信号传导和迀移[Rnjak，J等，Tissue Engineering， Pat B，Reviews，17 :81-91(2011)]〇
[0182] 已经提出，由凋亡细胞释放的生物活性分子刺激伤口中的内源天然MSC和植入的 外源MSC以起始伤口愈合的再生过程[Li，F，等，Sci Signal，3(110)ral3(2010)]。从伤 口中受损的凋亡细胞释放的胱天蛋白酶3/7和前列腺素 E2 (PGE2)刺激受损部位处的MSC 以增殖、分化并且最终代替受损的组织（"凤凰涅槃"途径（'Phoenix rising'pathway)) [1^，？等，5(^5丨8仙1，3(110)四13(2010)]。缺乏这些胱天蛋白酶的小鼠在皮肤伤口愈合 方面有缺陷[Li，F，等，Sci Signal，3 (110)ral3 (2010)]。更近的证据证实了这样的想法， 死亡细胞信号存在于周围组织，并且这样做以引起通过干细胞或祖细胞的修复和再生，所 述修复和再生补偿由细胞死亡所造成的任何功能损失[Jager and Fearnhead，Biochem Res Intl，doi : 1155/2012/453838 (2012)]。这些分子可能在刺激本研宄中施加于伤口的hWJSC 以增强愈合中起着重要作用。
[0183] 特异性 miRNA 簇（miR-106a-363、miR-17-92、miR-106b-25、miR-302-367 和 miR-21)在hWJSC中高表达。过表达的miR-106a-363和miR-17-92簇涉及细胞增殖和生长， 因此其可能在伤口愈合过程中起作用。在功能上，miR-106b-25通过抑制促凋亡基因（例如 E2Fl、Bim、Fas激活的激酶、CASP7和PTEN)来促进细胞周期进展和过度增殖。促凋亡基因 的组合抑制还提供了具有存活和进展或增殖益处的miR-106b-25表达细胞。MiR-106b-25 上调可导致对胶原蛋白之增强的结合，从而增加 ECM结合。miR-302-367簇靶向TGFI3受 体2以增加钙粘着蛋白表达并加速间充质向上皮的转变[Liao, B等，J Biol Chem，286 : 17359-17364(2011)]。在本研宄中，该簇可涉及伤口中增强的上皮细胞再形成。在正常的 伤口愈合过程中，miR-21在第8天是上调的并且在糖尿病伤口中是下调的[Madhyastha， R等，Intl Wound J，9 :355-361 (2012)]。MiR-21在血管平滑肌细胞（VSMC)上表现出双功 能（增殖和抗凋亡）[Ji R，等，Circ Res·，100 :1579-1588(2007)]。由 Li 等[Li，F，等， Sci Signal，3 (110) ral3 (2010)]在其伤口愈合的"凤凰涅槃"机制中强调了凋亡的miRNA 在促进伤口愈合中的组织再生的作用。与C⑶和hBMMSC相比，在hWJSC中，VEGF诱导的 miRNA(miR-191、miR-155、miR-31、miR-17-5p、miR-18a 和 miR-20a) [Suarez，Y 等，PNAS， USA，105 :14082-14087 (2008)]也是显著上调的。VEGF在伤口愈合过程中起着重要作用 [Bao，P等，J Surg Res，153:347-358(2009)]。基于本文所述的微阵列数据分析，除了已经 发现的涉及增殖、伤口愈合和促凋亡过程的特异性miRNA之外（表1)，还发现在hWJSC中， 属于上文所述簇的miRNA也是显著过表达的。因此，在hWJSC和hWJSC-CM存在下所观察到 的增强的伤口愈合可能由为伤口愈合过程提供有益作用的若干miRNA所引导。
[0184] 表1. ECM相关基因和用于qRT-PCR的引物序列
[0185]
【主权项】
1. 在有此需要的个体中治疗伤口的方法，其包括将所述伤口与有效量的组合物接触， 所述组合物包含（i)沃顿胶质干细胞（WJSC)，（ii)已经用WJSC调节的细胞培养基，（iii) WJSC的裂解物，（iv)已经用暴露于活皮肤细胞、溯死皮肤细胞和癒痕瘤细胞的WJSC调节的 细胞培养基，或（V)其组合。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中将所述伤口与支架接触，所述支架包含沃顿胶质 干细胞（WJSC)，已经用WJSC调节的细胞培养基，WJSC的裂解物，已经用暴露于活皮肤细胞、 溯死皮肤细胞和癒痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基，或其组合。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述支架是纳米纤维支架。
4. 根据权利要求2或3所述的方法，其中所述支架是可生物降解的。
5. 根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述支架包含聚己酸内醋（P化）。
6. 根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述支架还包含芦菩（aloe vera)。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中rcL与芦菩的比值为约10 ;5。
8. 根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述支架具有约0. 5 y m至10 y m的 孔隙度、约250nm至650nm的纤维直径、约25化m至650nm的纤维厚度或其组合。
9. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述WJSC是人WJSC。
10. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述WJSC获得自一个或更多个厮 -W- J巿'〇
11. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述已经用WJSC调节的细胞培养基 是通过在一种或更多种细胞培养基中培养WJSC约24小时至72小时来获得的。
12. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述WJSC的裂解物是通过将所述 WJSC与裂解所述WJSC的裂解缓冲液接触来获得的。
13. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中（iv)的所述WJSC已经在常氧或低氧 环境下暴露于活皮肤细胞、溯死皮肤细胞和癒痕瘤细胞。
14. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述伤口与所述组合物接触约24 小时至约21天。
15. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述伤口是外科手术切口、糖尿病伤 口、创伤性损伤伤口、溃瘍、烧伤、切除的癒痕瘤伤口。
16. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述伤口处于变为癒痕或癒痕瘤的 风险之中。
17. 根据权利要求2至16中任一项所述的方法，其中将所述伤口与包含所述组合物的 支架接触，或者将所述伤口与所述支架接触，然后将所述支架与所述组合物接触。
18. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含一种或更多种抗 生素、银、纤维蛋白或其组合。
19. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述个体是人或动物。
20. 在有此需要的个体中治疗癒痕的方法，其包括将所述癒痕与有效量的组合物接触， 所述组合物包含（i)沃顿胶质干细胞（WJSC)，（ii)已经用WJSC调节的细胞培养基，（iii) WJSC的裂解物，（iv)已经用暴露于活皮肤细胞、溯死皮肤细胞和癒痕瘤细胞的WJSC调节的 细胞培养基，或（V)其组合。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述癒痕是癒痕瘤。
22. 根据权利要求20或21所述的方法，其中将所述癒痕与支架接触，所述支架包含沃 顿胶质干细胞（WJSC)，已经用WJSC调节的细胞培养基，WJSC的裂解物，已经用暴露于活皮 肤细胞、溯死皮肤细胞和癒痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基，或其组合。
23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述支架是纳米纤维支架。
24. 根据权利要求22或23所述的方法，其中所述支架是可生物降解的。
25. 根据权利要求2至24中任一项所述的方法，其中所述支架包含聚己酸内醋（P化）。
26. 根据权利要求22至25中任一项所述的方法，其中所述支架还包含芦菩。
27. 根据权利要求26所述的方法，其中？化与芦菩的比值为约10 ;5。
28. 根据权利要求22至27中任一项所述的方法，其中所述支架具有约0. 5 y m至10 y m 的孔隙度、约250nm至650nm的纤维直径、约250nm至650nm的纤维厚度或其组合。
29. 根据权利要求20至28中任一项所述的方法，其中所述WJSC是人WJSC。
30. 根据权利要求20至29中任一项所述的方法，其中所述WJSC获得自一个或更多个 厮带。
31. 根据权利要求20至30中任一项所述的方法，其中所述已经用WJSC调节的细胞培 养基是通过在一种或更多种细胞培养基中培养WJSC约24小时至72小时来获得的。
32. 根据权利要求20至31中任一项所述的方法，其中所述WJSC的裂解物是通过将所 述WJSC与裂解所述WJSC的裂解缓冲液接触来获得的。
33. 根据权利要求20至32中任一项所述的方法，其中（iv)的所述WJSC已经在常氧或 低氧环境下暴露于活皮肤细胞、溯死皮肤细胞和癒痕瘤细胞。
34. 根据权利要求20至33中任一项所述的方法，其中将所述癒痕与所述组合物接触约 24小时至约21天。
35. 根据权利要求22至34中任一项所述的方法，其中将所述癒痕与包含所述组合物的 支架接触，或者将所述癒痕与所述支架接触，然后将所述支架与所述组合物接触。
36. 根据权利要求20至35中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含一种或更多种 抗生素、银、纤维蛋白或其组合。
37. 根据权利要求20至36中任一项所述的方法，其中所述个体是人或动物。
38. -种医用敷料，其包含沃顿胶质干细胞（WJSC)，已经用WJSC调节的细胞培养基， WJSC的裂解物，已经用暴露于活皮肤细胞、溯死皮肤细胞和癒痕瘤细胞的WJSC调节的细胞 培养基，或其组合。
39. 根据权利要求1所述的医用敷料，其中还包含支架，所述支架包含沃顿胶质干细胞 (WJSC)，已经用WJSC调节的细胞培养基，WJSC的裂解物，已经用暴露于活皮肤细胞、溯死皮 肤细胞和癒痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基，或其组合。
40. 根据权利要求39所述的医用敷料，其中所述支架是纳米纤维支架。
41. 根据权利要求39或40所述的医用敷料，其中所述支架是可生物降解的。
42. 根据权利要求39至41中任一项所述的医用敷料，其中所述支架包含聚己酸内醋 (PCL)。
43. 根据权利要求40至42中任一项所述的医用敷料，其中所述支架还包含芦菩。
44. 根据权利要求43所述的医用敷料，其中？化与芦菩的比值为约10 ;5。
45. 根据权利要求39至43中任一项所述的医用敷料，其中所述支架具有约0. 5 ym至 10. m的孔隙度、约250nm至650nm的纤维直径、约250nm至650nm的纤维厚度或其组合。
46. 根据权利要求38至45中任一项所述的医用敷料，其中所述WJSC是人WJSC。
47. 根据权利要求38至46中任一项所述的医用敷料，其中所述WJSC获得自一个或更 多个厮带。
48. 根据权利要求38至47中任一项所述的医用敷料，其中所述已经用WJSC调节的细 胞培养基是通过在一种或更多种细胞培养基中培养WJSC约24小时至72小时来获得的。
49. 根据权利要求38至48中任一项所述的医用敷料，其中所述WJSC的裂解物是通过 将所述WJSC与裂解所述WJSC的裂解缓冲液接触来获得的。
50. 根据权利要求38至49中任一项所述的医用敷料，其中（iv)的所述WJSC已经在常 氧或低氧环境下暴露于活皮肤细胞、溯死皮肤细胞和癒痕瘤细胞。
51. 根据权利要求38至50中任一项所述的医用敷料，其还包含一种或更多种抗生素、 银、纤维蛋白或其组合。
52. -种药物组合物，其包含根据权利要求38至51中任一项所述的医用敷料。
【专利摘要】本发明涉及在有此需要的个体中治疗伤口(例如，抑制瘢痕形成)的方法，其包括将所述伤口与有效量的组合物接触，所述组合物包含(i)沃顿胶质干细胞(WJSC)，(ii)已经用WJSC调节的细胞培养基，(iii)WJSC的裂解物，(iv)已经用暴露于凋亡的皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基，或(v)其组合。本发明涉及医用辅料(例如，药物组合物)，其包含沃顿胶质干细胞(WJSC)、已经用WJSC调节的细胞培养基、WJSC的裂解物、已经用暴露于凋亡的皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基或其组合。
【IPC分类】A61K36-886, A61L15-40, A61K36-896, A61K9-70, A61L15-42, A61K35-51, C12N5-0797, A61L15-44, A61L15-26, A61P17-02
【公开号】CN104661666
【申请号】CN201380047888
【发明人】方翠仪, 马赫什·朱拉尼, 阿里希特·比斯瓦斯, 图安·阿里夫恩·邦索, 西里拉姆·罗摩克里希纳
【申请人】新加坡国立大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2013年8月15日
【公告号】WO2014027965A1, WO2014027965A8