植入物和用于生产植入物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植入物以及用于生产植入物的方法。本发明在来源于肠的植入物的生 产中是特别有用的。
【背景技术】
[0002] 包括生物衍生材料支架（biologically derived scaffold)的植入物在各种不同 疾病和症状的治疗中对于组织/器官修复和再生已经成为重要的选择。持续的主要障碍是 对于植入的支架的功能血液供应的需求。
[0003] 患有短肠综合症（SBS)的患者缺乏超过一半的它们的小肠，其可以起因于大量的 紊乱并且通常导致外科手术切除。适合的植入物在SBS的治疗中将是有用的。肠疾病例如 成年人的克罗恩氏病和婴儿的坏死性小肠结肠炎是可能导致短肠综合症（SBS)和随后需 要肠移植的营养素吸收障碍的疾病。这是一个重大的临床问题，其导致差的生活质量、缩短 的预期寿命和为了存活对昂贵的长期护理方案的依赖。据估计，在欧盟和美国，对于SBS，仅 仅在不经肠道的营养素上每年花费￡ 7亿（不包括看护和其他护理）。
[0004] 以前的研宄已经使用合成的和生物的支架以产生新肠组织的短部分。例如，去细 胞化的猪小肠黏膜下层（SIS)，用于患病的或无功能生物系统的再生或增大的基于胶原的 脱细胞基质，已经在小动物模型中成功用于重新生成新肠。然而，SIS不保留至组织的原始 血管供应，导致有限的灌注。另外，SIS具有相对弱的机械性能和再生性能。
[0005] 创造厚复杂组织或多层组织的能力的关键性障碍是适合的血管供应的需求，血管 供应可能是管理组织构造大小的限制因素。在该问题解决后，小型支架植入平移至真正临 床相关的更大的移植物变得更可行。现存的或快速发展的植入的支架的血管供应必须能够 提供所有必需的氧气、营养素和生长因子以确保生存。100 μπι-200 μπι的扩散距离限制最近 的毛细血管的细胞的生存并且因为血管可能花费几天发展，缺乏的可用氧气可以潜在地预 先放置植入物至局部缺血。
[0006] 血管生成方法已经趋向侧重于新生血管的合成而不是连接至生物支架的现有血 系统的利用。因为受体血管至植入的移植物的生长可能花费几周才发生，移植物常常受到 局部缺血和坏死威胁。
[0007] 最近，德国的组已经开发了一种方法以获得生物支架，该支架具有供血动脉和静 脉作为支架的组成部分。该血管系统可以直接融合至受体的血液供应并且当连接至受体时 或在植入之前在体外提供再内皮化的可能性。（Linke et al. (2007)Tissue Engineering 13(11) :2699-2707 ；Mertsching et al. (2009)Transplantation 88(2) :203-210 ；Schanz et al. (2010)Journal of Biotechnology 148(1) :56-63)〇
【发明内容】
[0008] 本发明提供了用于生产用于组织/器官修复的植入物的改进方法，该植入物来源 于肠组织。
[0009] 根据本发明的第一方面，提供了用于生产来自肠组织的植入物的方法，该肠组织 包括肠的管状部分，其相关血管系统的至少部分是完整的，该方法包括：
[0010] 用至少一种去细胞化介质通过血管系统的血管灌注血管系统，以及
[0011] 用至少一种去细胞化介质通过肠管腔单独灌注肠的管状部分。
[0012] 得到的支架提供了用于肠组织修复和再生的优良的植入物。该支架包括开放的供 血动脉、排泄静脉（draining vein)和微血管连接物。本发明的方法可以应用于短的肠部 分以提供植入物，该植入物允许在SBS和肠衰竭患者中不经肠营养素需求降低，或本发明 的方法应用于足够长的部分以提供植入物，该植入物允许不经肠营养素需求的完全终止。
[0013] 支架包括两个组件：来源于肠的管状部分的管状组件和来源于相关血管系统的血 管组件。当植入时，支架的血管组件提供用于将血液递送至支架的直接路线（immediate route)，并且当它在植入物受体中重新生成时将氧气和营养素供应至支架。血管组件递送 体循环血液（systemic blood)深入至支架管状组件的绒毛。
[0014] 优选由通过其动脉引入去细胞化介质灌注血管系统，最优选主干动脉（main artery)或主干动脉之一。可以插管至动脉以促进灌注。去细胞化介质可以经由静脉（如 主干静脉或主干静脉之一）离开血管系统。
[0015] 为了促进肠的管状部分的灌注，可以提供输入工具和/或输出工具。例如，管可以 连接至肠的管状部分的近端和/或远端，例如通过系或缝。
[0016] 通常使用泵以确保有效灌注。
[0017] 该方法可以用于提供基本上去细胞化的支架，其中，细胞基本被去除，具有已经去 除足够的细胞物质和相关组分的支架使得在体内没有观察到不利的组织反应性或免疫反 应。通过皮下植入可以测量反应性。基本上去细胞化的支架没有细胞，其在x40放大倍数 下通过显微镜可见。
[0018] 在组织和整个器官去细胞化方法的最近综述中（Crapo et al. (2011) Biomaterials 32 :3233-3243)，提出以下最小的标准，除缺乏不利的体内反应外，足以满足 细胞外基质（ECM)去细胞化的需要：每mg ECM干重<50ng dsDNA ;<200bp DNA片断长度； 并且在用DAPI或H&E染色的组织部分中缺乏可视的核物质。
[0019] 通过本发明满足这些标准，已经发现根据本发明在典型的回肠衍生的支架中剩余 的DNA通常小于原组织（回肠和血管）的1%。这可比得上在临床应用中使用的商购的脱 细胞生物基质中发现的DNA的量，并且显著小于在临床前调查时在其它ECM支架中发现的 核含量。具体地，Mertsching等人报道了剩余的DNA测量值是通过本发明通常获得的那些 的100倍。由于宿主对剩余DNA的反应，较高的剩余DNA含量可以导致非最优的细胞和组 织反应，其将影响组织的再生能力。
[0020] 剩余的支架包括ECM，尤其是胶原和弹性蛋白。胶原通常主要包括I型胶原加 III 型和V型胶原。例如，根据本发明的典型支架的胶原分析显示约68%的I型胶原、约20% 的III型胶原和约12%的V型胶原。
[0021] 天然血管组织的胶原和弹性蛋白含量以及这些蛋白的相对量在不同的血管之间 显著变化。例如，在一些动脉中胶原含量可以在约5%至约25%之间变化，而在一些静脉中 可以在约20%至约45%之间变化。在一些动脉中弹性蛋白含量可以在约20%至约60%之 间变化，而在一些静脉中可以在约15%至约40%之间变化。因此，将要理解的是，胶原、弹 性蛋白和其它ECM组分的相对量可以根据原始材料变化。
[0022] 此外，将要理解的是，在支架的管状组件和支架的血管组件之间，各种ECM组分的 相对量通常不同。在管状肠衍生的组件中，胶原通常是主要的蛋白。
[0023] 因此，去细胞化的支架是非免疫原性的、生物可相容的并且提供直接的功能。
[0024] 优选地，ECM的结构至少部分保留在支架中并且优选基本保留。因此，该支架可以 包括胶原纤维和/或弹性蛋白纤维，其显示出原始的纤维结构以及其所源自的天然组织材 料的分子超微结构。这些纤维组织蛋白的天然三维结构优选基本被保留。
[0025] 众所周知，仅当在去细胞化的组织或器官内纤维独特的聚合结构保持至少部分完 整时，对支架源和/或它植入位置特异的细胞组分将引起ECM适当的结构改造。因此，ECM 比任何合成的基质是更适合的，以引起功能性再生改造，并且提供用于肠生长的成功支架。
[0026] 功能性ECM蛋白的保存对于维持支架的生物活性、结构完整性、耐久性和物理机 械性能也是重要的。从蛋白和GAG(即氨基酸和碳水化合物/糖序列，键和交互作用）的分 子结构直到肠和相关血管组织的宏观超微结构的结构层次维持和保护对于固有物理机械 性能的保存是重要的，固有物理机械性能反过来对于正确的肠功能（运动、扩张和收缩）是 重要的。此外，细胞的功能和反应部分由天然组织中固有的结构或地形提示或信号决定。换 句话说，组织结构在决定细胞命运和分化中发挥作用。因此，在去细胞化和组织处理期间， 三维结构的保留极大地改善肠和血管组织的最终细胞增殖以及细胞和组织特异功能的再 生。
[0027] 众所周知，大多数GAG与细胞或与ECM相关。本发明优先保留ECM衍生的/定位 的GAG，同时基本上去除细胞相关的GAG。因此，通过去除细胞和细胞成分（包括细胞相关 的GAG)，去细胞化过程导致总GAG的减少。另一方面，ECM相关的GAG优选大量保留。这是 重要的，因为在ECM GAG和不同的细胞类型之间存在'串扰（cross-talk)'，这有助于引导 细胞