冷冻干燥，不加任何防冻剂。所得饼块加入无菌水或生理盐水后复溶，再构成颗粒大小保持200nm以下。
[0089]制备例9
[0090]本实施例的目的是介绍可无菌滤过的药物颗粒的制备过程。将65mg的长春瑞滨溶于6ml的甲醇中。然后将溶液加入29.4ml人血清白蛋白(3% w/v)的水性溶液中，将得到的混合物进行进行高压均质再喷雾干燥以除去有机溶剂得到干燥的混合物。然后，用水性溶液将干燥的混合物复溶，在低RPM下匀浆5分钟形成粗乳剂，然后转移到高压匀浆器内(Avestin)0乳化在9000-18000镑/英寸2下进行，至少进行6个循环。所得长春瑞滨颗粒的直径一般小于200nm(透射电镜)。将分散液通过0.22微米微孔过滤器，由此得到无菌的紫杉醇分散液。将分散液冷冻干燥，不加任何防冻剂。所得饼块加入无菌水或注射用水后复溶，再构成颗粒大小保持200nm以下。
[0091]制备例10
[0092]本实施例的目的是介绍可无菌滤过的药物颗粒的制备过程。将10mg的长春瑞滨溶于1ml的甲醇中。然后将溶液加入90ml人血清白蛋白(I % w/v)的水性溶液中，将得到的混合物进行进行高压均质再喷雾干燥以除去有机溶剂得到干燥的混合物。然后，用水性溶液将干燥的混合物复溶，在低RPM下匀浆5分钟形成粗乳剂，然后转移到高压匀浆器内(Avestin)0乳化在9000-18000镑/英寸2下进行，至少进行6个循环。所得长春瑞滨颗粒的直径一般小于200nm(透射电镜)。将分散液通过0.22微米微孔过滤器，由此得到无菌的紫杉醇分散液。将分散液冷冻干燥，不加任何防冻剂。所得饼块加入无菌水或注射用水后复溶，再构成颗粒大小保持200nm以下。
[0093]制备例11
[0094]本实施例的目的是介绍可无菌滤过的药物颗粒的制备过程。将10mg的吲哚菁绿和900mg的人血清白蛋白溶于90ml的水中。然后向溶液加入20ml乙醇，将得到的混合物进行进行高压均质再喷雾干燥以除去有机溶剂得到干燥的混合物。然后，用水性溶液将干燥的混合物复溶，在低RPM下匀浆5分钟形成粗乳剂，然后转移到高压匀浆器内(Avestin)。乳化在9000-18000镑/英寸2下进行，至少进行6个循环。所得吲哚菁绿颗粒的直径一般小于200nm。将分散液通过0.22微米微孔过滤器，由此得到无菌的吲哚菁绿分散液。将分散液冷冻干燥，不加任何防冻剂。所得饼块加入无菌水或注射用水后复溶，再构成颗粒大小保持200nm以下。
[0095]制备例12
[0096]本实施例的目的是介绍可无菌滤过的药物颗粒的制备过程。将10mg的盐酸阿霉素和900mg的人血清白蛋白溶于90ml的水中。然后向溶液加入20ml乙醇，将得到的混合物进行进行高压均质再喷雾干燥以除去有机溶剂得到干燥的混合物。然后，用水性溶液将干燥的混合物复溶，在低RPM下匀浆5分钟形成粗乳剂，然后转移到高压匀浆器内(Avestin)。乳化在9000-18000镑/英寸2下进行，至少进行6个循环。所得阿霉素颗粒的直径一般小于200nm。将分散液通过0.22微米微孔过滤器，由此得到无菌的阿霉素分散液。将分散液冷冻干燥，不加任何防冻剂。所得饼块加入无菌水或注射用水后复溶，再构成颗粒大小保持200nm以下。
[0097]试验例I
[0098]将本发明实施例1中制备的白蛋白-紫杉醇纳米粒子和市售Abraxane分别用生理盐水复溶、稀释，其结果如图1和图2所示，本发明实施例1中制备的白蛋白-紫杉醇纳米粒子复溶浓度为lmg/mL时,最大动力学水合粒径为10nm左右；稀释至0.lmg/mL时,最大动力学水合粒径依然保持在10nm左右。而市售Abraxane复溶浓度为lmg/mL时,最大动力学水合粒径为10nm左右；但稀释至0.lmg/mL时,最大动力学水合粒径降至1nm以下。证明本发明实施例1中制备的白蛋白-紫杉醇纳米粒子在复溶稀释时不易迅速解离至1nm以下。
[0099]试验例2
[0100]用实施例1中制备的白蛋白-紫杉醇纳米粒子对MCF-7人乳腺癌细胞进行体外治疗。将处于对数生长期的MCF-7细胞用胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，随之将其接种于96孔板，每孔100 μ L，置于37°C、5%C02培养箱培养，24h后加入不同浓度的按照实施例I方法制备的紫杉醇(taxol)纳米颗粒。24h后进行MTT检测。培养终止前4h加入10 μ L5mg/mL的MTT，吸弃培养液后加100 μ L DMSO终止反应，酶标仪570nm检测OD值。实验重复三次。实验结果如图3，结果显示所制备的紫杉醇纳米颗粒对MCF-7细胞有抗增殖作用，且纳米粒子的浓度越高，其抗增殖作用越强。
[0101]试验例3
[0102]用紫杉醇纳米颗粒对肿瘤动物模型的治疗。采用按照实施例1方法制备的紫杉醇(taxol)纳米颗粒。将此药物的制剂对小鼠异种移植的MCF-7人乳腺肿瘤模型进行实验。在小鼠皮下种植MCF-7乳腺肿瘤，当肿瘤长到大约150-300mg尺寸时开始治疗。因肿瘤生长12天可达到上述指标，故在移植后第13天开始治疗。
[0103]紫杉醇纳米颗粒作为生理盐水中的混悬液以10mg/kg的剂量治疗荷瘤小鼠，在第13天给予静脉内注射。治疗组有7只动物。7只动物的对照荷瘤组用按同样方法，但仅接受生理盐水。随时间监视肿瘤的大小。结果如图4所示，对照组的肿瘤重量显示极大的增力口，这一组的动物均在第28天至39天之间将其处死。而治疗组显示有显著的效果，在第33天所有治疗组动物的肿瘤体积明显比对照组小得多。
[0104]试验例4
[0105]在白蛋白-紫杉醇纳米颗粒制备过程中，对白蛋白进行荧光染料Cy5标记，从而制备出具有荧光标记的白蛋白-紫杉醇纳米颗粒。对荷瘤小鼠给予10mg/kg剂量的给药后，对接受白蛋白-紫杉醇纳米颗粒治疗的荷瘤小鼠不同器官的荧光强度通过小动物荧光成像系统进行定量，其结果如图5所示，结果显示:肿瘤中白蛋白-紫杉醇纳米颗粒的浓度明显高于其它组织，说明本发明白蛋白-紫杉醇纳米颗粒在肿瘤中有明显的富集。
[0106]申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1.一种药理活性物质输送系统，包括固体或液体的药理活性物质及蛋白质包衣构成的颗粒，其中所述蛋白质包衣具有与其缔合的游离蛋白质，所述药理活性物质的一部分包含在所述蛋白质包衣中，所述药理活性物质的另一部分与游离蛋白质缔合；所述颗粒的平均直径为10至200nm，其分散于水性溶液时的最大动力学水合粒径在1nm以上。
2.根据权利要求1所述的药理活性物质输送系统，其特征在于，所述颗粒分散于0.lmg/mL的生理盐水时的最大动力学水合粒径在1nm以上、优选在20nm以上、更优选50_180nm。
3.根据权利要求1或2所述的药理活性物质输送系统，其特征在于，所述颗粒悬浮于生物相容性水溶液中； 优选地，所述生物相容性水溶液为可接受的注射液，更优选为生理盐水、葡萄糖注射液或缓冲液。
4.一种制备权利要求1-3任一项所述的药理活性物质输送系统的方法，包括: (1)将蛋白质、药理活性物质、生物相容性水溶液和与水互溶的有机溶剂混合制成混合溶液； (2)除去与水互溶的有机溶剂再进行高压均质，或者进行高压均质再除去与水互溶的有机溶剂，得到纳米悬浮液，然后通过干燥得到干粉状的药理活性物质输送系统。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)具体包括: (Ia)将蛋白质溶于生物相容性水溶液中，形成蛋白质溶液；将水不溶性药理活性物质溶于与水互溶的有机溶剂中，形成药理活性物质溶液； (Ib)将所述药理活性物质溶液与所述蛋白质溶液混合。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)具体包括: (Ia)将蛋白质和水溶性药理活性物质共同溶于生物相容性水溶液中，形成蛋白质/水溶性药理活性物质混合溶液； (Ib)将与水互溶的有机溶剂与所述蛋白质/水溶性药理活性物质混合溶液混合。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白质选自白蛋白、鱼精蛋白、抗体、免疫球蛋白、酪蛋白、胰岛素、溶菌酶、纤维蛋白原、脂肪酶、胶原蛋白、纤维连接素、玻璃连接素、去铁蛋白、铁蛋白、血红蛋白中的一种或多种，优选人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、鱼精蛋白、抗体、铁蛋白或去铁蛋白，最优选人血清白蛋白； 优选地，所述药理活性物质选自抗肿瘤药、镇痛剂/退热剂、麻醉剂、平喘药、抗生素、抗抑郁药、抗糖尿病药、抗真菌剂、抗高血压药、消炎药、肿瘤并发症辅助治疗生物技术药物、抗焦虑药、免疫抑制剂、抗偏头痛药、镇静剂/安眠药、抗心绞痛药、抗精神病药、抗躁狂药、抗心律失常药、抗关节炎药、痛风剂、抗凝剂、溶栓剂、抗纤溶药、血液流变学剂、抗血小板药、抗惊厥药、抗帕金森药物、抗组胺药/止痒药、钙调节剂、抗菌剂、抗病毒药、抗微生物药、抗感染药、支气管扩张药、激素、降血糖药、降血脂药、蛋白质、核酸、红血球生成刺激剂、抗溃疡/抗反流剂、止恶心药/止吐剂、维生素或成像剂； 优选地，所述生物相容性水溶液为可接受的注射液，更优选为生理盐水、葡萄糖注射液或缓冲液； 优选地，所述与水互溶的有机溶剂选自乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲亚砜、丙酮、乙腈、甲醇、丙醇、丙三醇、辛醇、二氧六环和甲基吡咯烷酮中的一种或多种的混合溶剂。
8.根据权利要求4-7任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中除去与水互溶的有机溶剂的方法包括:喷雾干燥、减压蒸发、冷冻干燥、采用降膜蒸发器、透析或超滤； 优选地，所述高压均质的操作压力在3000-30000磅/英寸2内，更优选在6000-25000磅/英寸2内，最优选在9000-18000镑/英寸2内； 优选地，所述干燥的方法包括冷冻干燥、喷雾干燥、减压蒸馏或它们的组合。
9.根据权利要求1-3任一项所述的药理活性物质输送系统在制备将药理活性物质输送到受试者的药物制剂中的应用。
10.根据权利要求1-3任一项所述的药理活性物质输送系统在制备减少药剂副作用的药物制剂中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种基于蛋白质的药理活性物质组合物及其制备方法和应用。所述药理活性物质输送系统，包括固体或液体的药理活性物质及蛋白质包衣构成的颗粒，其中所述蛋白质包衣具有与其缔合的游离蛋白质，所述药理活性物质的一部分包含在所述蛋白质包衣中，所述药理活性物质的另一部分与游离蛋白质缔合；所述颗粒的平均直径为10至200nm，其分散于水性溶液时的最大动力学水合粒径在10nm以上。本发明的药理活性物质输送系统不会因注射液的溶解稀释迅速解离至10nm尺寸以下，因此提高在肿瘤部位的富集效果，改善生物分布。
【IPC分类】A61K47-42, A61K9-16, A61K31-337, A61P35-00
【公开号】CN104758942
【申请号】CN201410001419
【发明人】梁兴杰, 安菲菲, 柳娟
【申请人】国家纳米科学中心
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2014年1月2日
【公告号】WO2015100843A1