4] "弓形体属物种或新孢子虫属物种的减毒株"意指这样的弓形体属物种或新孢子 虫属物种的株系，其具有低于能够诱导病理学状况的鼠弓形体或犬新孢子虫野生株的毒力 的减弱的毒力，但仍然保留了免疫原性能力以便能够在预防或治疗与隐孢子虫科的顶复门 动物相关的病理学状况中充当免疫原。毒力的减弱抗原要么可以产生自物种进化的自然过 程，要么可以尤其通过本领域技术人员所熟知的分子生物学技术来诱导。无论其是天然来 源的还是人工的结果，毒力的减弱都归因于毒力因子的表达不存在或者表达出一种或多种 非功能性的或具有改变的功能的毒力因子。弓形体属物种或新孢子虫属物种的遗传型的体 外修饰赋予该株系以突变型特征，与它所衍生自的野生株相比。寄生虫的野生株不仅具有 免疫原性潜力，而且还是有毒力的，即它们能够诱导与弓形体属物种或新孢子虫属物种相 关的病理学状况（即分别为弓形体病和新孢子虫病），这使得它们不适合在本发明的背景 下使用。弓形体属物种或新孢子虫属物种的株系的毒力可以尤其通过体外细胞感染性测定 法或者通过在动物中的感染性测定法来进行评价。
[0035] 细胞感染性测试通过将速殖子放置在汇合细胞例如HFF细胞（人包皮成纤维细 胞）或Vero细胞（经常用于产生鼠弓形体或犬新孢子虫的速殖子的细胞系）上来进行。 所形成的泡的数目和在每个泡中寄生虫的数目通过显微镜观察来测定。关于在动物中的 感染性测定法，向动物注射各种不同的株系并且随时间监测这些动物的存活（C6技de等 人，2005) 〇
[0036] "与隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学状况"意指由于被属于顶复门的 原生动物，特别是属于隐孢子虫科（其包括隐孢子虫属（Cryptosporidium))的寄生 虫感染而引起的疾病。已经提及了几十个隐孢子虫属的物种（Fayer R, 2010, Exp. Parasitol.，124, 90-7)。这些寄生虫能够入侵粘膜上皮。
[0037] 根据一个特别的实施方案，在从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓 形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的根据本发明的用途中，所述哺乳动物为 新生动物。
[0038] 本发明的目标在于从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物 种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系，其用于在新生哺乳动物中预防或治疗与隐孢子虫 科的顶复门动物相关的病理学状况之中使用。
[0039] "新生动物"意指处于下述时刻的哺乳动物：从其出生的时刻直至其断奶，即直至 所述哺乳动物变成能够自己进食和不再依赖母乳的时刻。将弓形体属物种或新孢子虫属物 种的突变株用于在新生动物中预防和/或治疗与隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学 状况的主要优点是，刺激其未成熟的免疫系统以便通过合成抑制顶复门动物生长的分子来 诱导非特异性免疫应答。
[0040] 根据一个特别的实施方案，在从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓 形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的根据本发明的用途中，所述哺乳动物为 人类或动物。
[0041] 本发明所涉及的动物主要是农用或饲养动物，其对于农产食品工业具有利益，但 还涉及某些伴侣动物。
[0042] 根据一个更特别的实施方案，在从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自 弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的根据本发明的用途中，所述动物属于 包括下列或由下列组成的组：绵羊、山羊、猪、牛、马科动物、骆驼科动物、犬科动物或猫科动 物（Fayer，2004, Vet. Parasitol.，126, 37-59)〇
[0043] 根据另一个实施方案，在从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体 属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的根据本发明的用途中，所述弓形体属物种或 新孢子虫属物种的株系至少具有通过涉及基因micl和/或mic3中的至少一个的遗传修饰 而失活的粘附素MICl和/或粘附素MIC3。
[0044] "粘附素MICl和/或粘附素MIC3"意指微线体的蛋白质（也称为粘附素）MICl和 /或MIC3,其在顶复门的寄生虫在其宿主中的运动、迀移或侵入中发挥作用。这些蛋白质具 有允许它们固着在宿主靶细胞上的结合模块。
[0045] "失活的粘附素"意指其功能在细胞内不再能够得到确保的粘附素。当它不产生时 或者当它产生但不具有功能活性或具有降低的功能活性时，粘附素就是失活的。所述失活 还涉及不再能够与其他蛋白质结合以形成复合物的粘附素。
[0046] "遗传修饰"意指在基因的核酸序列中实施的任何突变，其导致由该基因编码的 蛋白质的表达不存在，或者导致表达出由该基因编码的蛋白质的非功能性或功能较低的形 式。当其在体外施行时，该操作需要人工的介入。该突变可以由下列组成：基因或其编码区 或其启动子区的全部或部分缺失，在基因的核苷酸序列中核苷酸的插入或置换。
[0047] "基因micl"意指编码微线体的蛋白质MICl(也称为粘附素MICl)的基因。该蛋 白质包含数个模块，其中包括特异地结合乳糖的结合结构域。蛋白MICl还能够结合至宿主 细胞的表面。
[0048] 株系Toxo micl KO的详细的构建描述在文献US 7,946,185 B2和EP 1 703 914 Bl中。株系Neo ncmicl KO的详细的构建描述在本申请中。
[0049] "基因mic3"意指编码微线体的蛋白质MIC-3(也称为粘附素MIC3)的基因。该蛋 白质进行同二聚体化，从而形成90kDa的复合物。MIC3包含EGF类型的结构域和凝集素类 型的结构域。蛋白MIC3也能够结合至宿主细胞的表面。
[0050] 株系Toxo mic3 KO的详细的构建描述在文献US 7,946,185 B2和EP 1 703 914 Bl中。株系Neo ncmic3 KO的详细的构建描述在本申请中。
[0051] 根据另一个特别的实施方案，在从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自 弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的根据本发明的用途中，所述弓形体属 物种或新孢子虫属物种的株系具有通过涉及micl和mic3这两个基因的遗传修饰而失活的 MICl和MIC3这两种粘附素。
[0052] "涉及micl和mic3这两个基因的遗传修饰"意指在基因micl的核酸序列中和在 基因mic3的核酸序列中实施的突变。该双突变导致蛋白MICl和MIC3的表达不存在，或者 导致表达出蛋白MICl和MIC3的非功能性或功能较低的形式。弓形体属物种或新孢子虫属 物种的这些突变株分别称为Toxo micl-3 KO或Neo ncmicl-3 KO,并且具有相比于它们所 衍生自的RH类型的鼠弓形体或NCl类型的犬新孢子虫的野生株而言大为减弱的毒力。但 是，株系Toxo micl-3 KO或Neo ncmicl-3 KO保留了强的免疫原性能力。株系Toxo micl-3 KO的详细的构建描述在文献US 7,946,185 B2和EP 1 703 914 BI中。株系Neo ncmicl-3 KO的详细的构建描述在本申请中。
[0053] 株系Toxo micl-3 KO和Neo ncmicl-3 KO保留了其侵占靶组织的能力，而没有发 展出由于向哺乳动物施用所述株系而引起的致病现象。基因micl和mic3的无效不改变或 很少改变这些株系的免疫原性潜力，但相对于强毒株（即具有与从其获得毒力减弱的株系 的那个株系的毒力基本上相同的毒力的株系）而言，大大减低了其毒力。
[0054] 向新生幼鼠接种株系Toxo micl-3 KO导致细胞因子IL-12和IFN-y的产生，并 且有效地保护幼鼠免于以后被小隐孢子虫感染。
[0055] 突变株Toxo micl-3 KO有效地刺激由羔羊的肠系膜淋巴结细胞和脾细胞产生 IL-12和IFN-Y，这确认了在该靶动物物种中使用该突变株作为免疫刺激剂的可能性。
[0056] 根据一个特别的实施方案，在从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓 形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的根据本发明的用途中，所述弓形体属 物种或新孢子虫属物种分别为鼠弓形体（Toxoplasma gondii)或犬新孢子虫（Neospora caninum)〇
[0057] 根据另一个实施方案，在从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体 属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的根据本发明的用途中，所述株系的所述免疫 刺激效应导致白介素-12(IL-12)的分泌，随后为干扰素-y (IFN-y)的分泌。
[0058] "白介素-12(IL-12) "意指由免疫细胞例如单核细胞、树突细胞和巨噬细胞所合成 的细胞因子。该细胞因子在早期被分泌，并因此将会激活靶细胞（T细胞和天然杀伤细胞）， 从而所述靶细胞则分泌IFN-Y。
[0059] "干扰素-Y (IFN-y ) "意指由被IL-12激活的⑶4+T淋巴细胞、⑶8+T淋巴细胞 和天然杀伤细胞（NK)所合成的细胞因子。生物体的细胞分泌IFN-Y将会使得能够产生针 对小隐孢子虫的先天的保护性应答。由于所靶向的细胞系的多样性，因而该细胞因子将会 具有多效活性。
[0060] "细胞因子"是指所有在免疫系统的发育和调节中所牵涉的分子。细胞因子是糖基 化或非糖基化的蛋白质，其可以按照其生物学活性进行分类：
[0061] ?促炎的：其中包括白介素（IL)和肿瘤坏死因子（TNF)，
[0062] ?免疫调节的：其中包括白介素（IL)，
[0063] 鲁效应的：其中包括干扰素（IFN)、肿瘤坏死因子（TNF)和趋化因子。
[0064] 根据另一个更特别的实施方案，在从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的 选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的根据本发明的用途中，白介 素-12 (IL-12)和干扰素-Y (IFN-Y)的所述分泌在使用所述弓形体属物种或新孢子虫属 物种的株系作为免疫刺激剂后3至9天开始。
[0065] 根据一个更特别的实施方案，在从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自 弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的根据本发明的用途中，所述与隐孢子 虫科的顶复门动物相关的病理学状况为隐孢子虫病。
[0066] "隐孢子虫病"意指以下列为特征的病理学状况：痉挛、发热、疲劳、恶心类型的症 状，和尤其是腹泻，其可以导致被小隐孢子虫或被隐孢子虫属的其他物种感染的哺乳动物 脱水。隐孢子虫病主要影响哺乳动物的肠，但在受到免疫抑制的个体中也可以感染胆道和 胰道以及呼吸道。侵染通过摄入存在于已污染了环境（水、土壤或生的食物）的被寄生的 动物的排泄物中的卵囊而发生。症状在感染发生后两至十天出现，并且持续超过两周。该 病理学状况的严重性随被感染的宿主的年龄，但更特别地随其免疫系统的状态而变化。在 具有成熟且功能性的免疫系统的宿主中，隐孢子虫病对于其宿主的健康没有后果。相反地， 非常年幼的、非常年老的或者具有未成熟或缺陷的免疫系统的宿主可以发展出隐孢子虫病 的非常严重的形式。
[0067] "未成熟或缺陷的免疫系统"意指这样的免疫系统，对于所述免疫系统来说，一种 或多种细胞谱系要么不存在，要么是缺陷的。免疫系统的未成熟是新生哺乳动物中的共同 特点，其使得它们特别易受寄生虫感染。通过初乳实现的母体抗体的吸收在其免疫系统建 立的时候赋予新生动物以一定程度的保护。免疫系统的未成熟或缺陷也可以产生自基因起 源的病理学状况，尤其是在人中，例如维-奥（Wiskott-Aldrich)综合征，这是与X连锁淋 巴细胞增生性综合征。该缺陷还可以由于被人免疫缺陷病毒（HIV)感染而引起，或者由于 与器官移植相关的治疗性治疗或者通过化学疗法或放射疗法来进行的某些癌症的医学救 济而引起。具有未成熟或缺陷的免疫系统的哺乳动物被使得特别易受顶复门动物感染。
[0068] 根据一个更加特别的实施方案，在从其天然环境中分离并具有免疫刺激效 应的选自弓形体属物种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系的根据本发明的用途 中，所述对隐孢子虫病负有责任的隐孢子虫科的顶复门动物为至少一种从由下列组 成的组中选择的顶复门动物：小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum)、牛隐孢子虫 (Cryptosporidium bovis)、安