新一代多功能抗体纳米团簇的制备及其协同治疗应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物技术领域，具体地说，是新一代多功能抗体纳米团簇的制备及其 协同治疗应用。
【背景技术】
[0002] 分子靶向治疗是指针对参与了肿瘤发生发展过程的细胞信号转导和其他生物学 途径的治疗手段。广义的分子靶向治疗的靶点包括了参与细胞分化、凋亡、迀移、侵袭性行 为、淋巴转移、全身转移等多过程的从DNA到蛋白水平的任何亚分子。本世纪以来，分子靶 向治疗已成为肿瘤学研宄的热点和主要方向，推动着肿瘤治疗理念和理论的发展。利妥昔 单抗（Rituximab，C2B8,商品名美罗华）是第一个被FDA批准的以人⑶20分子为靶点治疗 非霍奇金淋巴瘤的单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb)。现Rituximab+经典的CHOP 化疗方案（环磷酰胺+阿霉素+长春新碱+泼尼松）已经成为CD20+非霍奇金淋巴瘤治疗 的一线方案，在西方，几乎所有的CD20+非霍奇金淋巴瘤患者在其病程中都会接受利妥昔 单抗的治疗。随后，抗体的靶向治疗已成为目前抗肿瘤生物治疗的主要手段。目前已有十 几种抗体被FDA批准用于临床治疗。
[0003] 然而并非所有的患者对抗体的分子靶向治疗都敏感。因此如何解决抗体的杀伤效 果及其临床上表现出来的耐药问题成为广大科研和临床工作者函待解决的主要问题。传 统癌症抗体治疗方法虽然已取得了一些可观的成效，但是彻底治愈和消除癌症仍然是当前 社会医疗和人口健康的重大挑战之一。例如，近年来，虽然NHL对传统的放化疗较敏感，约 48%的病人对Rituximab单抗治疗产生不良反应，其余的患者尽管初次治疗效果很好，但 经过一段时间的治疗会出现继发性耐药，甚至复发。研宄表明CD20抗体主要通过补体依赖 的细胞毒作用（complement dependent cytotoxicity ;□)〇、抗体依赖的细胞介导的细胞 毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)、诱导肿瘤细胞细胞凋 亡三种机制杀伤肿瘤细胞。根据CD20抗体与靶细胞的CD20结合后的转脂筏能力将其分为 两型，I型抗体主要作用机制包括⑶C、ADCC，而诱导肿瘤细胞凋亡的能力很弱。II型抗体 主要作用机制包括ADCC、诱导肿瘤细胞凋亡，而⑶C作用很弱。此外，I型⑶20抗体在体外 与靶细胞的CD20结合后，再经过二抗的交联，可以诱导靶细胞产生较强的凋亡。研宄表明， II型⑶20抗体诱导淋巴瘤细胞凋亡并不依赖于传统的Caspase通路，而是依赖一条与溶酶 体相关的特殊途径，而I型抗体交联后诱导淋巴瘤细胞的凋亡依赖于传统的Caspase通路。 然而，将CD20抗体进行交联而诱导肿瘤细胞凋亡在体内情况下无法实现。
[0004] 基于纳米技术的抗肿瘤治疗给癌症患者带来新的希望，与传统的抗体药治疗相 比，纳米医药载体有以下几个优势：体内较稳定，对正常组织毒副作用低，可以实现药物可 控释放，提高生物利用度。然而，基于传统纳米载药体系发展仍然不完善，受到体内外很大 因素限制，导致目前纳米药物治疗的瓶颈问题：1，纳米载体体内稳定性差、循环时间短；2， 由于靶向性和稳定性差，导致肿瘤内富集不足；3,肿瘤细胞靶向性及结合作用不强导致胞 吞少；4,胞内特定部位药物释放不可控的问题。
[0005] 纳米医学是将现代物理学、现代化学和先进工程技术与医学相结合的一门边缘学 科，其由于毒副作用低、治疗效果好，在恶性肿瘤的预防及治疗中发挥着越来越重要的作 用。本发明把纳米技术与靶向治疗抗体相结合，制备出新型的抗体纳米团簇，拟为淋巴瘤的 治疗提供新的方法和思路。
[0006] 本发明设计的新型抗体纳米团簇，国内外尚未见类似的研宄报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供新一代多功能抗体纳米团簇。
[0008] 本发明的再一的目的是，提供新一代多功能抗体纳米团簇的制备方法。
[0009] 本发明的另一的目的是，提供新一代多功能抗体纳米团簇的协同治疗功能。
[0010] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：抗体纳米团簇，所述的抗体纳米团簇 由两种或两种以上的同一类型或不同类型的抗体通过铰链偶联到同一大分子链或球面上， 链接抗体和大分子链的铰链剂分子包括可氧化还原降解，可水解，可酸解等可断裂的化学 键，及不可断裂的化学键。
[0011] 所述的抗体纳米团簇的形态为链状、球状或棒状，所述的抗体纳米团簇的尺寸范 围为0. 05-20 μL?，所述的分子链或球面的分子量为5000-100000g/mol。
[0012] 所述的抗体纳米团簇还包括修饰其表面的PEG分子、温敏高分子或pH值敏感等功 能高分子，所述的PEG分子的分子量为500-10000g/mol。
[0013] 所述举例的抗体为抗⑶20抗体。
[0014] 所述的抗体为I型抗⑶20抗体与II型抗⑶20抗体。
[0015] 所述的I型抗⑶20抗体是Rituximab，所述的II型抗⑶20抗体是11B8。
[0016] 所述的抗体纳米团簇以短链聚乙稀亚胺为载体，将I型抗⑶20抗体Rituximab与 II型抗⑶20抗体11B8在体外进行交联制得。
[0017] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的抗体纳米团簇的制备 方法包括以下步骤：
[0018] I) PEI溶液与MPEGS溶液反应制得MPEGS-PEI溶液，
[0019] 2)分别将Rituximab抗体和11B8抗体疏基化，
[0020] 3)巯基化的Rituximab抗体与巯基化的11B8抗体混合，再与MPEGS-PEI溶液反应 制得抗体纳米团簇。
[0021] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：所述的抗体纳米团簇在制备 治疗肿瘤（实体瘤及血液瘤）药物中的应用。
[0022] 所述的肿瘤为淋巴瘤。
[0023] 本发明制备的抗CD20抗体纳米团簇具有如下特点：
[0024] (1)、所述抗体纳米团簇首次将两种不同抗体在体外进行交联并成功应用体内，解 决了 CD20抗体交联在体内无法应用的科学难题。
[0025] (2)、所述抗体纳米团簇在体外实验中成功激活了目前已知的所有CD20抗体抗肿 瘤作用的四条通路，包括⑶C，ADCC，溶酶体介导的细胞凋亡以及caspases依赖的细胞凋亡 通路，在体内和体外实验中表现出较强的肿瘤杀伤效果。
[0026] (3)、所述抗体纳米团簇能够结合不同肿瘤细胞表面的CD20抗原，引起淋巴瘤细 胞的同源聚集，增强其抗肿瘤作用。
[0027] (4)、所述抗体纳米团簇与其来源抗体Rituximab、llB8相比具有更长的半衰期。
[0028] (5)、所述抗体纳米团簇对临床上对Rituximab耐药的淋巴瘤细胞仍然具有较强 的杀伤作用。
[0029] (6)、所述抗体纳米团簇能通过纳米药物增强的渗透与滞留效应（enhanced permeability and retention effect，EPR)以及抗原抗体的识别和结合效应，增强其在肿 瘤内部的富集能力。
【附图说明】
[0030] 附图1为抗⑶20抗体纳米团簇构建示意图。
[0031] 附图2为抗⑶20抗体纳米列针鉴定与表征分析。
[0032] 2A !SDS-PAGE鉴定抗CD20抗体纳米团簇的成功构建。1-2 :PEI，3-4