0.001-1% (W/V)。
[0029] 具体地，本发明的液体制剂可包括药理学上有效量的长期胃泌酸调节素缀合物、 5-50mM 组氨酸、2-15% (w/v)甘露醇、0. 01-lmg/mL 甲硫氨酸和 0. 001-0. 1% (w/v)聚山梨 醇酯20。除这些组分外，液体制剂还可进一步包括0.001-1% (w/v)间甲酚。
[0030] 如本文所用，术语"稳定剂"指使成分如活性成分保持稳定一定时间段的物质。基 于本发明的目的，该术语指能够使长期胃泌酸调节素缀合物稳定储存的物质。蛋白质如长 期胃泌酸调节素缀合物的储存稳定性，不仅对于保证精确剂量，而且对于抑制胃泌酸调节 素衍生物缀合物的抗原物质的可能性生成，都是非常重要的。
[0031] 本发明中的稳定剂优选包含缓冲剂、糖醇和非离子型表面活性剂，从而赋予长期 胃泌酸调节素缀合物稳定性。另外，稳定剂可优选进一步包括选自等渗剂、糖、多元醇和氨 基酸的一种或多种组分。
[0032] 缓冲剂起作用以保持液体制剂的pH，使得液体制剂的pH不发生快速变化，从而使 长期胃泌酸调节素缀合物稳定。缓冲剂的实例可包括药学上可接受的PH缓冲剂，包括碱性 盐（磷酸钠、磷酸钾、或其一氢或二氢盐）、柠檬酸钠、柠檬酸、乙酸钠、乙酸和组氨酸，或者 也可使用这些缓冲剂的混合物。缓冲剂优选是柠檬酸盐或组氨酸缓冲剂，更优选组氨酸缓 冲剂。缓冲剂的浓度优选为5-100mM，更优选5-50mM。缓冲剂的pH优选为4. 0-8. 0,更优选 4. 5-7. 0,还更优选 5. 0-6. 0。
[0033] 在本发明的一个实施例中，测量了长期胃泌酸调节素缀合物根据液体制剂的缓冲 剂pH的稳定性。即，在25°C下储存长期胃泌酸调节素缀合物0-4周同时改变缓冲剂的pH 后，分析缀合物的余量，由此显示，胃泌酸调节素缀合物在pH 5. 6、pH 5.8和pH 6.0下更稳 定（实施例3、表2至5、实施例7、表18至21、实施例8和表22至25)。因此，发现本发明中 最稳定缓冲剂的PH范围为5. 0至6. 0。在本发明的一个实施例中，测量长期胃泌酸调节素 缀合物根据液体制剂的缓冲剂种类的稳定性。具体地，在将胃泌酸调节素缀合物与〇. 02% 聚山梨醇酯20、0. lmg/mL甲硫氨酸和5%甘露醇在25°C下储存0-4周后，分析缀合物的余 量。SE-HPLC分析结果表明，缀合物的余量在相同pH的缓冲剂之间无显著差异。IE-HPLC 或RP-HPLC分析结果表明，组氨酸在相同pH下最稳定（实施例8和表22至25)。
[0034] 糖醇起作用以增加长期胃泌酸调节素缀合物的稳定性。在本发明中，糖醇可以是 选自甘露醇、山梨醇和甘油的一种或多种。优选地，糖醇可以是甘露醇。液体制剂中的糖醇 浓度优选为1-20 % (w/v)，更优选2-15 % (w/v)。
[0035] 在本发明的一个实施例中，分析了作为稳定剂的糖醇的种类对长期胃泌酸调节素 缀合物的稳定性的影响。具体地，将胃泌酸调节素缀合物在25°C下在柠檬酸盐缓冲剂（pH 5. 6)中储存的0-4周，然后通过IE-HPLC、SE-HPLC和RP-HPLC进行分析。结果是，缀合物在 存在甘露醇或山梨醇的情况下比相同浓度的甘油存在的情况下更稳定。RP-HPLC分析结果 表明，缀合物在在存在甘露醇的情况下与存在山梨醇相比更稳定一点（实施例4和表6至 9)。换句话说，证明甘露醇或山梨醇的添加显示良好的稳定性，但缀合物在存在甘露醇的情 况下最稳定。
[0036] 在本发明的一个实施例中，分析了作为稳定剂的糖醇的浓度对长期胃泌酸调节素 缀合物的稳定性的影响。具体地，将胃泌酸调节素缀合物在25°C下储存0-4周，然后通过 IE-HPLC、SE-HPLC和RP-HPLC进行分析。结果是，在存在2 %甘露醇或15 %甘露醇的情况 下、生成蛋白质沉淀，而在存在5%甘露醇或10%甘露醇的情况下，缀合物稳定（实施例5、 表10至13、实施例7和表18至21)。
[0037] 非离子型表面活性剂起作用以降低蛋白质溶液的表面张力，以防止蛋白质吸附到 疏水表面上或聚集。可用于本发明的非离子型表面活性剂的优选实例包括聚山梨醇酯系非 离子型表面活性剂和泊洛沙姆系非离子型表面活性剂，其可单独使用或两种或更多种组合 使用。液体制剂中不适宜使用高浓度的非离子型表面活性剂。本发明的液体制剂包含0.2% (w/v)或更少浓度的非离子型表面活性剂，优选0.001-0. 1 % (w/v)。
[0038] 本发明的稳定剂可包含氨基酸，如甲硫氨酸。甲硫氨酸通过抑制杂质生成起作用 以额外稳定化蛋白质，该杂质例如由蛋白质的氧化反应导致。
[0039] 在本发明的一个实施例中，测试了作为稳定剂的非离子型表面活性剂的浓度和氨 基酸存在与否对长期胃泌酸调节素缀合物的稳定性的影响。具体地，将胃泌酸调节素缀合 物在25 °C下储存在柠檬酸盐缓冲剂（pH 5. 6)和10 %甘露醇中0-4周，然后通过IE-HPLC、 SE-HPLC和RP-HPLC进行分析。结果是，胃泌酸调节素缀合物在存在0. 02 %聚山梨醇酯20 和0. lmg/mL甲硫氨酸的情况下最稳定（实施例6和表14至17)。
[0040] 等渗剂在体内以溶液给予长期胃泌酸调节素缀合物时起作用以使渗透压保持在 适当的水平，并且可另外起作用以进一步稳定化溶液中的长期胃泌酸调节素缀合物。等渗 剂的典型实例包括水溶性无机盐，如氯化钠、硫酸钠、柠檬酸钠及类似物。等渗剂的浓度优 选为0-200mM，并且其含量可被适当地控制。
[0041] 本发明稳定剂优选不包含白蛋白。可用作蛋白质稳定剂的人血清白蛋白由人血液 制成，因此可被人病原体病毒污染，并且明胶或牛血清白蛋白在一些患者内可引起疾病或 可引起过敏反应。本发明的不含白蛋白的稳定剂不包含外源蛋白质如人或动物血清白蛋白 或纯化的明胶，因此不易受病毒感染。
[0042] 在可另外被使用以增加储存长期胃泌酸调节素缀合物的稳定性的糖和多元醇中 糖的优选实例包括单糖如甘露糖、葡萄糖、岩藻糖和木糖，和多糖如乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉 子糖和葡聚糖，多元醇的优选实例包括聚丙烯、低分子量聚乙二醇、甘油、低分子量丙二醇 及类似物。这些糖和多元醇可单独使用或两种或更多种组合使用。
[0043] 除上述缓冲剂、等渗剂、糖醇、氨基酸和非离子型表面活性剂外，本发明的液体制 剂还可进一步包括不损害本发明的效果范围内的本领域已知的其他组分或物质。
[0044] 本发明的长期胃泌酸调节素缀合物的液体制剂包括药理学上有效量的长期胃泌 酸调节素缀合物一一该长期胃泌酸调节素缀合物包括连接至免疫球蛋白Fc区的生理活性 肽胃泌酸调节素一一和不含白蛋白的稳定剂，其中稳定剂可包含PH范围为4. 8至7. 0的缓 冲剂、选自甘露醇和山梨醇的一种或多种糖醇、和聚山梨醇酯20。更具体地，稳定剂可包含 pH范围为5. 0至6. 0的缓冲剂、甘露醇和聚山梨醇酯20。另外，稳定剂可进一步包括选自 等渗剂、糖、多元醇和氨基酸的一种或多种组分。
[0045] 本发明的不含白蛋白、包含高浓度的长期胃泌酸调节素缀合物、赋予长期胃泌酸 调节素缀合物稳定性的液体制剂不易受病毒感染，简单，并且显示良好的储存稳定性，因此 与其他稳定剂或低压冻干制剂相比可以经济的方式被提供。
[0046] 另外，由于本发明的液体制剂包括与天然胃泌酸调节素相比长期具有生理活性的 长期胃泌酸调节素缀合物，其与常规胃泌酸调节素制剂相比可在人体内长期保持蛋白质活 性，因此可用作有效的药物制剂。另外，本发明的液体制剂甚至对高浓度的长期胃泌酸调节 素缀合物也赋予良好的稳定性。
[0047] 如本文所用，术语"胃泌酸调节素"指由作为胰高血糖素前体的前胰高血糖素产生 的肽。在本发明中，胃泌酸调节素意为包括天然胃泌酸调节素及其前体、衍生物、片段和变 体。优选地，胃泌酸调节素具有 SEQ ID NO:l(HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA) 的氨基酸序列。
[0048] 如本文所用，术语"胃泌酸调节素衍生物"意为包括通过胃泌酸调节素的氨基酸序 列中氨基酸的添加、缺失或置换获得并且激活胰高血糖素和GLP-I受体的水平可高于天然 胃泌酸调节素激活的水平的肽、肽衍生物或肽模拟物。在本发明中，胃泌酸调节素衍生物可 具有SEQ ID NOS :2至34中的任一种氨基酸序列。优选地，胃泌酸调节素衍生物可具有SEQ ID NO :23或25的氨基酸序列。更优选地，其可具有SEQ ID NO :25的氨基酸序列。
[0049] 如本文所用，术语"胃泌酸调节素片段"指在天然胃泌酸调节素的氨基或羧基端具 有一个或多个氨基酸的片段，其中添加的氨基酸也可以是非天然存在的氨基酸（例如，D型 氨基酸）。这种胃泌酸调节素片段具有调控体内血糖水平的功能。
[0050] 如本文所用，术语"胃泌酸调节素变体"是具有不同于天然胃泌酸调节素的氨基酸 序列的一个或多个氨基酸残基并且具有激活GLP-I和胰高血糖素受体的功能的肽。胃泌 酸调节素变体可通过天然胃泌酸调节素氨基酸序列中的一些氨基酸的置换、添加、缺失、修 饰、或其组合中的任一种来制备。
[0051] 制备胃泌酸调节素变体、衍生物和片段的方法可单独或组合应用。例如，本发明还 包括这样的肽：具有一个或多个不同于天然胃泌酸调节素的氨基酸和N端氨基酸残基的脱 氣基，并且具有激活GLP-I受体和膜尚血糖素受体的功能。
[0052] 本文述及的氨基酸根据IUPAC-IUB的命名规则简写如下：
[0053]
[0054] 在本发明中，胃泌酸调节素衍生物包括任何通过SEQ ID NO : 1的氨基酸序列中的 氨基酸置换、添加、缺失或翻译后修饰（例如，甲基化、酰基化、泛素化、或分子内共价结合） 制备并且可激活胰高血糖素和GLP-I受体的肽。关于氨基酸的置换或添加，不仅可使用在 人蛋白质中常见的20种氨基酸，而且可使用非典型或非天然存在的氨基酸。非典型氨基酸 的商业来源包括 Sigma_Aldrich、ChemPep Inc.和 Genzyme Pharmaceuticals。包括这些氨 基酸和非典型肽序列的肽可被合成和购自商品供应商，例如，American Peptide Company 或 Bachem (USA)或 Anygen (韩国）。
[0055] 在本发明的【具体实施方式】中，本发明的胃泌酸调节素衍生物是新型的肽，其包括 下式1的氨基酸序列：
[0056] it 1
[0057] R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17- X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2
[0058] 其中
[0059] Rl是组氨酸、去氨基-组氨酰基、二甲基-组氨酰基（N-二甲基-组氨酰基）、 β -羟基咪唑并丙酰基、4-咪唑并乙酰基、β -羧基咪唑并丙酰基或酪氨酸；
[0060] Xl是Aib (氨基异丁酸）、d-丙氨酸、甘氨酸、Sar (Ν-甲基甘氨酸）、丝氨酸或d-丝 氨酸；
[0061] X2是谷氨酸或谷氨酰胺；
[0062] X3是亮氨酸或酪氨酸；
[0063] X4是丝氨酸或丙氨酸；
[0064] X5是赖氨酸或精氨酸；
[0065] X6是谷氨酰胺或酪氨酸；
[0066] X7是亮氨酸或甲硫氨酸；
[0067] X8是天冬氨酸或谷氨酸；
[0068] X9是谷氨酸、丝氨酸或α -甲基-谷氨酸或缺失缺失；
[0069] XlO是谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或丝氨酸或缺失；
[0070] Xll是丙氨酸、精氨酸或缬氨酸或缺失；
[0071] Χ12是丙氨酸、精氨酸、丝氨酸或缬氨酸或缺失；
[0072] Χ13是赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或α -甲基-谷氨酸或缺失；
[0073] Χ14是天冬氨酸、谷氨酸或亮氨酸或缺失；
[0074] Χ15是苯丙氨酸或缺失；
[0075] Χ16是异亮氨酸或缬氨酸或缺失；
[0076] Χ17是丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺或α -甲基-谷氨酸或缺失；
[0077] Χ18是色氨酸或缺失；
[0078] Χ19是丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丝氨酸或缬氨酸或缺失；
[0079] Χ20是丙氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺或精氨酸或缺失；
[0080] Χ21是天冬酰胺或缺失；
[0081] Χ22是丙氨酸、甘氨酸或苏氨酸或缺失