包括胃泌酸调节素和免疫球蛋白片段的蛋白质缀合物的液体制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及包括长期（long-lasting)胃泌酸调节素缀合物的不含白蛋白的液体 制剂，其中包括胃泌酸调节素衍生物、变体、前体或片段的胃泌酸调节素肽连接至免疫球蛋 白Fc区，其与天然胃泌酸调节素相比可增加长期胃泌酸调节素缀合物的生理活性持续时 间和长期保持其体内稳定性。本发明还涉及制备该液体制剂的方法。
【背景技术】
[0002] 肥胖被定义为异常或过度脂肪积累的情况，其可损害健康并且源于能量摄入超过 能量消耗的能量失衡。肥胖在过去不是严重的健康问题，但随着经济增长，肥胖人群随经 济富裕增加而增加，并且各种肥胖相关疾病的数量也逐渐增加。根据世界卫生组织（World Health Organization，WHO)的报告，世界上超过15亿成年人超重，其中超过5亿肥胖，并 且肥胖人群在1980和2008之间增加约两倍（世界卫生组织，Fact sheet on obesity and overweight，2011)。不仅在高收入国家，而且在低收入国家中肥胖人群的百分比目前也在 增加。超重和肥胖导致血压和胆固醇水平增加，并且引起或恶化各种疾病。另外，肥胖问题 在儿童或青少年中更加严重，增加了糖尿病、心脏病、高血压或高脂血的发病率，并且还可 导致死亡或残疾。
[0003] 如上所述，肥胖是全球性疾病和社会问题，但在过去认为肥胖可通过个人努力被 克服，因此没有特别重视肥胖治疗。然而，肥胖并不容易治疗，因为其是与食欲控制和能量 代谢机制相关的复杂疾病。因此，肥胖的治疗不仅需要患者自身的努力，而且还需要能够治 疗与食欲控制和能量代谢相关的异常机制的方法。因此，已尝试研发治疗肥胖的药物。
[0004] 这样尝试的结果是研发了包括利莫那班（Rimonabant) (Sanofi-Aventis)、西 布曲明（Sibutramine) (Abbott)、Contrave(Takeda)、奥利司他（Orlistat) (Roche)及 类似物的药物，但这些药物具有缺点，即其显示胎儿副作用或具有不足的肥胖治疗效 果。据报告，利莫那班（Sanofi-Aventis)显示中枢神经系统障碍，西布曲明（Abbott)和 Contrave(Takeda)显不心血管副作用，而奥利司他（Roche)显不给予1年时仅约4kg的减 重效果。因此，当前很少或没有肥胖治疗剂可安全地被开处方给肥胖患者。
[0005] 近来，胰高血糖素衍生物已得到众多关注。当血糖水平由于药物治疗、疾病、激素 或酶缺陷、或类似原因开始下降时，胰腺产生胰高血糖素。胰高血糖素作用以刺激肝细胞将 储存的糖原分解成葡萄糖，然后释放到血液中，以使血糖水平升高至正常水平。除增加血糖 水平的效果外，胰高血糖素据报告还抑制食欲和激活脂肪细胞的激素敏感性脂酶（HSL)以 促进脂解，从而显示抗肥胖效果。在胰高血糖素衍生物中，胰高血糖素样肽-I(GLP-I)正在 作为降低糖尿病患者的高血糖的治疗剂被研发，并且作用于刺激胰岛素合成和分泌、抑制 胰高血糖素分泌、抑制胃排空、增加葡萄糖利用度和抑制食物摄入。已知从蜥蜴的毒液分离 的艾塞那肽-4 (exendin-4)与GLP-I具有约50%的氨基酸同源性，并且激活GLP-I受体以 降低糖尿病患者的高血糖。然而，肥胖治疗性药物，包括GLP-I，据报告会引起副作用，如呕 吐和恶心。
[0006] 因此，作为GLP-I的替代品，能够与两种肽（GLP-1和胰高血糖素）的受体结合的 胃泌酸调节素正在受到关注。胃泌酸调节素是由前胰高血糖素（胰高血糖素的前体）制成 的肽，并且是有效的抗肥胖剂，因为其抑制食物摄入，如同GLP-1，促进饱腹感，并且显示脂 解活性，如同胰高血糖素。
[0007] 基于胃泌酸调节素肽的双重功能，关于肥胖治疗药物研发的研宄已积极进行。例 如，韩国专利登记号925017公开了用于治疗人肥胖的口服、胃肠外、粘膜、直肠、皮下或透 皮药物组合物，其包括胃泌酸调节素作为活性成分。然而，据报告，包括胃泌酸调节素的肥 胖治疗剂具有短的体内半衰期，并且显示低的肥胖治疗效果，即使在一日三次以高剂量给 予这些治疗剂时。因此，已尝试通过修饰胃泌酸调节素增加胃泌酸调节素的体内半衰期或 肥胖治疗效果。
[0008] 例如，双重激动剂胃泌酸调节素（Merck)通过如下获得：用D-丝氨酸置换胃泌酸 调节素的氨基酸2位处的L-丝氨酸以增加二肽基肽酶-IV (DPP-IV)耐受性，和附接胆固醇 部分至C端以增加血液半衰期。ZP2929 (Zealand)通过如下获得：用D-丝氨酸置换胃泌酸 调节素的氨基酸2位处的L-丝氨酸以增加 DPP-IV耐受性，用丙氨酸置换氨基酸17位处的 精氨酸以增加蛋白酶耐受性，用赖氨酸置换氨基酸27位处的甲硫氨酸以增加氧化稳定性， 和分别用天冬氨酸、丙氨酸和丝氨酸置换氨基酸20和24位处的谷氨酰胺以及氨基酸28位 处的天冬酰胺，以增加脱酰胺稳定性。双重激动剂胃泌酸调节素（Merck)具有1.7小时的 增加的体内半衰期，长于天然胃泌酸调节素的半衰期（8-12分钟），但其仍具有很短的体内 半衰期，并且以数mg/kg的极高剂量被给予。因此，胃泌酸调节素或其衍生物具有两个大劣 势，即，半衰期短和医疗效果低。由于这些劣势，其应每日以高剂量给予。为克服这些劣势， 研宄增加胃泌酸调节素的血液半衰期同时保持其体内活性的方法，从而研发胃泌酸调节素 衍生物。另外，利用这种技术，通过结合载体至胃泌酸调节素衍生物制备非肽基聚合物，并 且发现蛋白质缀合物由于增加了其血液半衰期同时保持体内活性可显示较好抗肥胖效果 (韩国专利申请号10-2012-0064110)。
[0009] 通常，蛋白质和肽具有很短的半衰期，并且在暴露于各种因素如不适的温度、 水-空气界面、高压、物理/机械应力、有机溶剂和微生物污染后由于单体聚集和血管表面 吸附发生变性如沉淀。这种变性是不可逆的，因此变性的蛋白质和肽丧失了内在的物理化 学性质和生理活性效果。另外，蛋白质和肽是不稳定的，并且易受外在因素如温度、湿度、 氧、UV射线或类似物影响，从而发生物理或化学变化，包括联合、聚合或氧化，导致活性显著 损失（韩国专利登记号10-0389726)。
[0010] 此外，被吸附的蛋白质和肽容易通过变性过程而聚集，并且变性的蛋白质和肽在 被给予人体时充当人体中抗体形成的诱因，因此，应给予足够稳定形式的蛋白质和肽。因 此，已研宄了防止溶液中的蛋白质和肽变性的不同方法（John Geigert, J. Parenteral Sci.Tech.，43, No5, 220-224，1989 ;David Wong，Pharm. Tech. October，34-48，1997 ; Wei Wang. , Int. J. Pharm. , 185, 129-188, 1999 ；Willem Nordej Adv. Colloid Interface Sci.，25, 267-340, 1986 ;Michelle et al.，Int. J. Pharm. 120, 179-188, 1995)。
[0011] 低压冻干被应用于一些蛋白质和肽药物以实现稳定性目的。然而，低压冻干的产 物的不便在于其必须被重新溶解在注射水中以使用。另外，在低压冻干的情况下，需要对大 容量冷冻干燥机或类似物大量投资，因为低压冻干过程被包括在生产过程中。进一步，利用 喷雾干燥器生产粉末状蛋白质和肽的方法也在被应用，但在这种情况下，经济效益由于低 产率而减少，并且高温暴露可不利地影响蛋白质的稳定性。
[0012] 为克服这些限制，已进行这样的研宄：其中稳定剂被添加至溶液中的蛋白质和 肽，以抑制蛋白质和肽的物理化学变化，同时保持其体内效率一一即使在长期储存后。人 血清白蛋白，一种蛋白质，已被广泛用作各种蛋白质药物的稳定剂，并且其性能已被证实 (Edward Tarelli 等，Biologicals(1998)26,331-346) 〇
[0013] 纯化人血清白蛋白的方法包括灭活生物污染物如支原体、朊病毒、细菌和病毒，和 筛选或检查一种或多种生物污染物或病原体。然而，始终存在患者暴露于未完全去除或灭 活的生物污染物的风险。例如，筛选过程包括检查来自供体的人血液是否包含某种病毒，但 这个过程不一定是可靠的。具体地，不能检测到在极少数供体中存在的特定病毒。
[0014] 不同蛋白质由于其化学差异可在储存过程中在不同条件下以不同速率被逐步灭 活。也就是说，通过稳定剂对储存期的延长对于不同蛋白质而言不是相同的。因此，用于提 供储存稳定性的稳定剂的适当比例、浓度和种类根据目标蛋白质的物理化学性质而不同。 当稳定剂组合使用时，由于其之间的竞争和相互作用，其可导致不同于期望效果的不利效 果。进一步，由于蛋白质的属性或浓度可在储存期间发生变化，所用的稳定剂可显示不同于 意图的效果。因此，需要大量努力和措施来稳定溶液中的蛋白质。
[0015] 具体地，胃泌酸调节素和免疫球蛋白Fc的缀合物是其中作为生理活性肽的胃泌 酸调节素连接于免疫球蛋白Fc区的缀合物。因此，由于缀合物的分子重量和体积肯定不同 于天然胃泌酸调节素，需要稳定化蛋白质的特殊组合物。
[0016] 进一步，由于胃泌酸调节素（其是生理活性肽）和免疫球蛋白Fc区是具有不同物 理化学性质的肽或蛋白质，其应被同时稳定化。然而，如上所述，不同蛋白质或蛋白质由于 其化学差异可在储存期间在不同条件下以不同速率被逐步灭活，并且在适于蛋白质或肽的 稳定剂组合使用时，由于其之间的竞争和相互作用，其可导致不同于期望效果的不利效果。 因此，在长期胃泌酸调节素缀合物的情况下，找到同时稳定化作为生理活性肽的胃泌酸调 节素和免疫球蛋白Fc区的的组合物有很大的困难。
[0017] 在这种情况下，本发明人做出了大量努力以提供可长期储存而不担心病毒污染的 稳定液体制剂，从而发现了稳定剂，该稳定剂包括缓冲剂、糖醇和非离子型表面活性剂，并 且可进一步包括添加剂如等渗剂或氨基酸和防腐剂以反复使用，可增加长期胃泌酸调节素 衍生物的稳定性，并且可利用该稳定剂制备成本有效且稳定的液体制剂，从而完成本发明。
[0018] 公开内容
[0019] 技术问题
[0020] 本发明的一个目的是提供长期胃泌酸调节素缀合物的液体制剂，包括药理学上有 效量的长期胃泌酸调节素缀合物，其中作为生理活性肽的胃泌酸调节素连接至免疫球蛋白 Fc区；和不含白蛋白的稳定剂。
[0021] 本发明的另一目的是提供制备上述液体制剂的方法。
[0022] 本发明的再一目的是提供预防或治疗肥胖或糖尿病的组合物，其包括液体胃泌酸 调节素缀合物制剂，该液体胃泌酸调节素缀合物制剂包括连接至免疫球蛋白Fc区的生理 活性肽胃泌酸调节素。
[0023] 本发明的再一目的是提供预防或治疗肥胖或糖尿病的方法，包括给予对象上述液 体制剂。
[0024] 问题解决方案
[0025] 为实现以上目的，一方面，本发明提供长期胃泌酸调节素缀合物的液体制剂，包括 药理学上有效量的长期胃泌酸调节素缀合物，其中作为生理活性肽的胃泌酸调节素连接至 免疫球蛋白Fc区；和不含白蛋白的稳定剂，其中稳定剂包含缓冲剂、糖醇和非离子型表面 活性剂。
[0026] 如本文所用，术语"液体制剂"指加工成液体形式的药物制剂，并且意图包括所有 液体内用制剂和外用制剂。现有技术没有报道适于药理学上有效量的包括连接至免疫球蛋 白Fc结构域的胃泌酸调节素的胃泌酸调节素缀合物的本发明液体制剂。因此，本发明的液 体制剂可包括药理学上有效量的胃泌酸调节素缀合物一一该胃泌酸调节素缀合物包括连 接至免疫球蛋白Fc结构域的胃泌酸调节素一一和不含白蛋白的稳定剂，其中稳定剂包含缓 冲剂、糖醇和非离子型表面活性剂。另外，本发明的液体制剂可进一步包括防腐剂。
[0027] 在本发明中，稳定剂可进一步包括一种或多种组分，选自等渗剂、糖、多元醇和氨 基酸。糖醇可以是选自甘露醇、山梨醇和甘油的一种或多种，并且液体制剂中的糖醇浓度可 以为2-15% (w/v)。进一步，缓冲剂可以是选自柠檬酸盐、乙酸盐、组氨酸和磷酸盐缓冲剂 的一种或多种，并且可具有4. 5至7. 0的pH范围。等渗剂可以是氯化钠，非离子型表面活 性剂可以是聚山梨醇酯或泊洛沙姆，并且可以0.001-0. 1% (w/v)的浓度存在。氨基酸可以 是甲硫氨酸。因此，本发明的液体制剂可包括稳定剂，该稳定剂包含pH范围为4. 8至6. 0 的缓冲剂、选自甘露醇和山梨醇的一种或多种糖醇和聚山梨醇酯20。
[0028] 另外，本发明的液体制剂可进一步包括选自间甲酚、苯酚和苄醇的一种或多种防 腐剂。液体制剂中的防腐剂浓度可以为